JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Umwelt

Samenstelling en analyse van de verdeling van Bioaerosols onder verschillende omgevingsomstandigheden

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58795
, , , , , ,
1Academy of Military Medical Sciences, 2Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3The Experimental High School Attached to Beijing Normal University

Summary

Inzicht in de biologische samenstelling van milieu zwevende deeltjes is belangrijk voor de studie van de significante effecten op de volksgezondheid en verspreiding van de ziekte. Hier, we drie soorten bioaerosol bemonsteringsmethoden en een biologische analyse van airborne microben gebruikt om beter verkennen vanuit de lucht microbiële gemeenschappen onder verschillende omgevingsomstandigheden.

Abstract

Variabele micro-organismen in zwevende deeltjes (PM) onder verschillende omgevingsomstandigheden wellicht significante effecten op de menselijke gezondheid. In deze studie, beschreven we een protocol voor meerdere analyses van de biologische composities in milieu PM. vijf experimenten worden gepresenteerd: (1) PM nummer controle met behulp van een laser deeltjes teller; (2) PM-collectie met behulp van een sampler Cyclonische aërosol; (3) PM-collectie met behulp van een hoog-volume lucht sampler met filters; (4) culturable microben-collectie door de Andersen zes-traps sampler; en (5) detectie van biologische samenstelling van milieu PM door bacteriële 16SrDNA en schimmel ITS regio sequentiebepaling. We geselecteerd wazig dagen en een veeteelt boerderij als twee typische voorbeelden van de toepassing van dit protocol. In deze studie, deze twee bemonsteringsmethoden, cyclonische aërosol sampler en filter sampler, toonde verschillende bemonstering efficiëntie. De Cyclonische aërosol sampler verricht veel beter in termen van het verzamelen van bacteriën, terwijl deze twee methoden de dezelfde doelmatigheid toonde bij het verzamelen van schimmels. Filter samplers kunnen werken onder lage temperatuursomstandigheden terwijl Cyclonische aërosol samplers een beperking van de bemonstering voor de temperatuur hebben. Een solide impacting sampler, zoals een zes-traps sampler van Andersen, kan worden gebruikt om te monster bioaerosols rechtstreeks in het kweekmedium, waardoor de overlevingskans van culturable micro-organismen. Echter, deze methode hoofdzakelijk een beroep op cultuur terwijl meer dan 99% van de microben kan niet worden gekweekt. DNA geëxtraheerd uit de culturable bacteriën verzameld door de Andersen zes-traps sampler en monsters verzameld door Cyclonische aërosol sampler en filter sampler werden ontdekt door bacteriële 16S rDNA en schimmel ITS regio sequentiebepaling. Alle bovengenoemde methoden wellicht brede toepassing in vele vakgebieden, zoals milieumonitoring en airborne pathogen detectie. Uit deze resultaten kunnen we concluderen dat deze methoden onder verschillende omstandigheden kunnen worden gebruikt en andere onderzoekers verder te onderzoeken met de gezondheidsgevolgen van milieu bioaerosols kunnen helpen.

Introduction

In een natuurlijke omgeving bestaan verschillende soorten micro-organismen in bioaerosols, met inbegrip van schimmels, bacteriën, virussen en andere micro-organismen1. Airborne micro-organismen, die door sommige menselijke activiteiten zoals dierlijke voeding operaties in veehouderijen kunnen worden uitgestoten, zijn de belangrijke inhoud van de atmosferische milieu2. Deze micro-organismen kunnen niet alleen spelen een belangrijke rol in de atmosferische omgeving maar ook significante effecten op de menselijke gezondheid en ziekten verspreiden.

Als een belangrijke manier van verspreiding van ziekten, hebben microbiële aërosolen brede aandacht over de hele wereld getrokken. In recente studies bleken veel ziekten bij de mens te worden geassocieerd met de complexe samenstelling van milieu zwevende deeltjes (PM) in verschillende locaties, zoals chemische fabrieken, veehouderijen en smoggy steden3,4. De biologische samenstelling van PM kan bijdragen aan sommige respiratoire en cardiovasculaire ziekten in PM-blootgesteld mens5. Lichaam van de verschillende regio’s, zoals de mucosa, de spijsverteringskanaal, de huid en de luchtwegen, kunnen doelwit van microben gekoppeld aan PM6,7. Een verhoogd risico op longkanker kan worden veroorzaakt door langdurige blootstelling aan PM2.58.

Bacteriën hebben onderzocht op verschillende locaties in verschillende landen over de hele wereld, waaronder in metrostations, veterinaire ziekenhuizen, slachthuizen, compostering leerlooierijen, melkverwerking faciliteiten, voorzieningen, kolenmijnen, tandheelkundige klinieken en het genereren van indoor omgevingen9,10,11,12,13,14,15,16,17, een groot aantal rapporten over biologische aërosolen. Drukke plaatsen in verband met campussen, vee boerderijen en grote steden tijdens mistige dagen zijn drie bijzonder belangrijke openbare voorwaarden waarvoor we nodig hebben om te verkennen van de verbindingen tussen de gezondheid van de mens en de mogelijke gevolgen van PM blootstelling. Bovendien, tijdens de dagen van de winter in de noordelijke steden van China, kunnen de hoge PM2.5 waarden menselijke gezondheid beïnvloeden. Hoewel PM2.5 toxische effecten genereren kan door zich te richten van respiratoire oppervlakken en ontbinding in bloed18, het is nog niet duidelijk of en hoe de microben gekoppeld aan PM2.5 mogelijk ook voor de gezondheid van de mens19 gevolgen ,20. Veehouderijen zijn een van de belangrijkste bronnen van PM en microbiële aërosolen in de lucht. Het grote aantal ziekteverwekkers, zoals griepvirus en Brucella melitensis, die worden gedragen door aërosolen in het gebied rond veehouderijen zijn belangrijke factoren veroorzaakt respiratoire aandoeningen in zowel vee en pluimvee werknemers.

In deze studie verkenden we meerdere soorten analyses van bioaerosols, met inbegrip van PM nummer toezicht, bioaerosol verzameling en analyse van de biologische samenstelling. Lucht monsters werden verzameld door een Cyclonische aërosol sampler, een sampler van grote hoeveelheden lucht met filters en een zes-traps sampler van Andersen. De monsters die door deze drie samplers waren vervolgens geanalyseerd door biologische analyse, met inbegrip van bacteriële 16S rDNA en schimmel ITS sequencing om te bepalen hun biologische composities. Hierin laten we zien representatieve resultaten uit de bioaerosol monsters verzameld tijdens Beijing wazig dagen en veehouderijen die aangeeft dat de bioaerosols grote gevolgen zou kunnen op de gezondheid van mens en dier hebben. De vergelijking tussen vloeistof en filter bemonstering methoden werden ook onderzocht in deze studie voornamelijk gebaseerd op de gegevens van het 16S DNA en schimmel ITS sequencing.

Protocol

1. PM nummer controle Gebruiken van een airborne laser particle counter (Zie Tabel van materialen) om te bepalen van het totale aantal PM. Verzamel de PM door de lucht bemonstering poort op de bovenkant van de airborne laser deeltjes teller.Opmerking: Deze deeltjes teller is een kantoorautomatiseringsapparatuur te bevorderen en het zelfstandig kan werken, wanneer het programma inclusief bemonsteringstijdstip, interval, collectie times, etc. is ingesteld op de touch-screen. Het instrument uit te rusten met een sensor ten aanzien van temperatuur en relatieve vochtigheid. Meten en registreren van temperatuur en relatieve vochtigheid gegevens tegelijkertijd elke 5 min. In totaal, meten en registreren van 6 verschillende deeltje grootteklassen (0.3-0,5 μm, 0,5-0,7 μm, 0.7-2.5 μm, 2.5-5 μm, 5-10 μm en > 10 μm) tegelijkertijd elke 5 min. 4 andere deeltje grootteklassen meten (0.3-0,5 μm, 0,5-1 μm, 1-3 μm en ≥ 3 μm). Verzamelen van de monsters van de lucht wel het gat van de bemonstering op de bovenkant van de sampler en gebruiken van de test modules binnen de sampler voor het meten van de deeltjesgrootte van elke PM. Vervolgens worden de gegevens automatisch opgeslagen. Alle bovenstaande processen kunnen automatisch worden uitgevoerd na de relatieve parameters, met inbegrip van de bemonstering en bereik tellen, zijn ingesteld maar de mini touch displayer van de airborne laser deeltjes teller.Opmerking: Deze deeltjes teller is een kantoorautomatiseringsapparatuur te bevorderen en het test modules die het aantal PM van verschillende deeltjes grootteklassen heeft. Om te beoordelen experimentele standaardfout, zien erop toe dat de verschillende deeltjes grootteklassen met ten minste 15 replicaties worden geteld. Zorg ervoor dat de lezingen worden opgeslagen in het interne geheugen van het instrument en vervolgens geanalyseerd. Controleer of de analyse van de primaire gegevens PM nummer concentratie, de ANOVA-test en het percentage van PM in elke grootteklasse bevat. Bijvoorbeeld, zoals blijkt uit figuur 1A, de concentraties PM nummer in December (237.6 deeltjes/cm3) waren aanzienlijk hoger dan die in oktober (gemiddelde: 110.2 deeltjes/cm3) (ANOVA; P-value < 0,05). Figuur 1B blijkt dat het aantal deeltjes kleiner dan 3 μm, goed voor meer dan 99% van het totale aantal. Gebruikt u de teller van de laser-deeltje te controleren van het aantal concentraties van PM en de gegevens worden automatisch opgeslagen. Gebruik een USB flash-schijf te exporteren van de gegevens in de computer en het uitvoeren van de ANOVA-test. 2. PM collectie door Cyclonische Aerosol Samplers De PM bemonstering in een open ruimte zonder een nabijgelegen belangrijke bronnen van verontreiniging op ∼2 m boven de grond uit te voeren. De positie van de bemonstering plaats opnemen. Bijvoorbeeld, de campus van de Beijing Institute of Technology is de volgende: 39 ° 57′ 51,0 ” N; 116 ° 19′ 38,5 ” E. Gebruik een Cyclonische aërosol sampler lucht monsters te verzamelen. Gebruik een sampler doorstroming van 323 L/min, en een collectie tijd van 6 h.Opmerking: Het debiet van de sampler is vast en kan niet worden gewijzigd. De afhaaltijd wordt gecontroleerd door handmatige tijd-houden, aangezien er slechts een knop starten en stoppen op deze sampler. Steriel water te wassen van de binnenkant van de Cyclonische aërosol sampler 3 keer voordat collectie gebruiken en de functie Automatische reiniging 3 keer door continu te drukken op de knop verzamelen 3 keer. Druk op de knop om te beginnen van bemonstering en druk op de pompknop te stoppen bemonstering verzamelen. Zet de sampler op een plank of vloer met niemand die het op zijn plaats. Behouden alle monsters in het donker bij-20 ° C tot de latere analyses. 3. PM collectie door Filters De PM bemonstering in een open ruimte zonder een nabijgelegen belangrijke bronnen van verontreiniging op ∼2 m boven de grond uit te voeren. De positie van de bemonstering plaats opnemen. De campus van de Beijing Institute of Technology is bijvoorbeeld als volgt: 39 ° 57′ 51,0 ” N; 116 ° 19′ 38,5 ” E. De PM-monsters bij 20.32 × 25,4 cm2 filters (Zie Tabel van materialen) verzamelen met behulp van een hoog-volume lucht sampler (Zie Tabel van materialen) instellen op een debiet van 1.000 L/min. het tarief en collectie doorstroomtijd relatieve auto-programmering. Behouden alle bemonsterde filters in het donker bij-20 ° C tot de latere analyses. 4. biologische samenstelling analyse Voor de analyse van biologische samenstelling, elk vloeibare monster uit de Cyclonische aërosol sampler of filter monster te gebruiken voor DNA-extractie door een multisource DNA-extractie Kit (Zie Tabel van materialen) volgens de protocollen van de fabrikant. Voor monsters van de hoog-volume lucht sampler met filters, gebruikt u 1/8 van elk monster filter voor DNA-extractie. Zet het filter in een tube van 50 mL met het monster geconfronteerd met naar binnen en de achterkant naar de buiswand gericht. Voeg 10 kralen in de centrale sites naar de zijde van het filter met het monster. Vortex de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Pipetteer de vloeistof in de buis in een centrifugebuis schone 50 mL de DNA-extractieproces voort te zetten. Uittreksel van het DNA van het monster door de processen als volgt. Centrifugeer het monster van de bacteriën bij 2.000 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en schorten bacteriën in 2 mL steriele PBS buffer. De schorsing van bacteriën in een centrifugebuis 2 mL verzamelen en vervolgens Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 5 min te ontdoen van de bovenstaande oplossing. Voeg 350 l steriele PBS buffer met de zwevende bacteriën aan de oplossing. Voeg 0.8 mL RNase A. Voeg 150 μl van Buffer CL en 8 μL van proteïnase K, en onmiddellijk meng door vortex schudden voor 1 min. Na kort centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 30 s (geen residuen op de muur), zet de centrifugaal buis in 56 ° C water gedurende 10 minuten. 350 μL van Buffer PD, en mix voor 30 s en vervolgens centrifuge voor 10 min op 12.000 x g toevoegen. Plaats de buis van de voorbereiding DNA in een centrifugebuis 2 mL, en breng het mengsel in stap 4.2.6 hebt gemaakt aan de voorbereiding buis. Vervolgens gedurende 1 minuut op 12.000 x g centrifugeren. Negeren van het filtraat, de inhoud van de tube voorbereiding terug te zetten in de oorspronkelijke centrifugebuis van 2 mL en voeg 50 l Buffer W1. Het mengsel voor 1 min op 12.000 x g centrifugeren. Negeren van het filtraat, de inhoud van de tube voorbereiding terug te zetten in de oorspronkelijke centrifugebuis van 2 mL en 700 μL van Buffer W2 toevoegen. Centrifugeer het mengsel gedurende 1 minuut op 12.000 x g. Herhaal deze stap om te wassen opnieuw met 700 μL van Buffer W2. Negeren van de afval vloeistof, en de inhoud van de tube voorbereiding terug te zetten in de oorspronkelijke centrifugebuis van 2 mL. Het mengsel voor 1 min op 12.000 x g centrifugeren. De inhoud van de DNA voorbereiding buis gestoken met een andere schone 1,5 mL centrifugebuis, en voeg 100 μl van het eluens of gedeïoniseerd water naar het midden van het membraan in de voorbereiding buis (gedeïoniseerd water of eluens werd verwarmd tot 65 ° C). Laat het mengsel staan bij kamertemperatuur voor 1 min en het mengsel gedurende 1 min. bij 12.000 x g centrifugeren. Het uitvoeren van kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (Q-RT-PCR) te kwantificeren van de relatieve abundanties van bacteriën en schimmels op de bemonsteringsfilters wordt geleid. Inleidingen als volgt gebruiken: voor bacteriële 16S rDNA, 515F (5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′) en 806R (5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′); en voor de schimmel ITS, ITS1 (5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′) en ITS1 (5′-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3′). De Q-RT-PCR-tests uitvoeren op een systeem Real-Time PCR (Zie Tabel van materialen). RT-PCR voorwaarde: predegeneration, 95 ° C, 10 min; degeneratie, 95 ° C, 15 s; anneal en uitbreiding, 60 ° C, 1 min; 40 cycli van degeneratie te gloeien en uitbreiding. Voor de analyse van de structuur van de bacteriële en schimmelinfecties Gemeenschap, versterken de V1-V3-regio van de bacteriële 16S rDNA en de ITS -regio van de schimmel rRNA operon door PCR. De inleidingen als volgt gebruiken: voor bacteriën, V1-9F (5 ‘-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3 ‘) en V3-541R (5 ‘-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-barcode-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3 ‘); en voor schimmels, ITS-3F (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3′) en ITS-4R (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-barcode-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3’). Zorgen dat het mengsel 20 μL van PCRs 2 μL van 2.5 mM dNTPs, 4 μL van 5 × FastPfu Buffer, 0.8 μL van elke primer (5 μM), 0.4 μL van de Polymerase van FastPfu opgenomen, en 10 ng van sjabloon DNA (Zie Tabel van materialen). Gebruik van het PCR-programma als volgt: 94 ° C gedurende 5 minuten; gevolgd door 10 cycli van 94 ° C voor 30 s, 55-60 ° C gedurende 45 s, en 72 ° C gedurende 90 s; 20 cycli van 94 ° C voor 30 s, 55 ° C voor 45 s en 72 ° C gedurende 90 s; en een laatste uitbreiding bij 72 ° C gedurende 5 minuten. Het uitvoeren van DNA zuivering, DNA kwantificering en pyrosequencing zoals beschreven in een eerdere studie 21. 5. Bioaerosol bemonstering en teelt Gebruik van een internationale standaard Andersen zes-traps sampler (Zie Tabel van materialen) om te proeven van de culturable airborne bacteriën en schimmels op een debiet van 28.3 L/min. gebruik een bemonsteringstijd van 35 min. Zet de plaat van de cultuur in elke fase van de sampler. Voldoende Desinfecteer de sampler met 75% ethylalcohol na elke bemonstering.Opmerking: Het debiet van de sampler is vastgesteld en de afhaaltijd wordt beheerd door handmatige tijd te houden. Monster de zes fasen met de Andersen zes-traps sampler, die wordt gedefinieerd door de aerodynamische diameter van de deeltjes in de lucht, met inbegrip van etappe VI (0,65-1,1 μm), fase V (1.1-2.1 μm), fase IV (2.1-3.3 μm), fase III (3.3-4.7 μm), fase II (4.7-7.0 μm) en fase I (≥7.0 μm). De bacteriële deeltjes verzamelen en storten op het bord van de cultuur in elke fase met soja-caseïne Digest Agar (Zie Tabel van materialen). Er is een container met veel lucht inname aan de bovenkant in elke fase van de sampler. Cultuur van de bacteriën collectie platen bij 37 ° C gedurende 24-48 uur; dan tellen de kolonie aantallen bacteriën op de monster-schotel voor elke fase. Om te voorkomen dat de deeltjes verzameld door de Andersen zes-traps sampler overlappen, het aantal kolonies op elk niveau van de sampler te corrigeren door de volgende formule:waar Pr: gecorrigeerd aantal kolonies op elk niveau,N: aantal gaten van de sampler op alle niveaus (400), bemonstering enr: het werkelijke aantal kolonies. De eenheid van kolonies per m3 lucht als volgt berekenen:waar C: concentratie (CFU/m3),N1-N6: het gecorrigeerde aantal kolonies op elk niveau,T: bemonstering (min), enF: bemonstering debiet (28.3 L/min). Het gebruik van methoden uit de stappen 5.1 – 5.3 te bestuderen van de bioaerosol in vee boerderij, met inbegrip van vier soorten varkensstallen.Opmerking: Deze vee boerderij is gelegen in Changchun in China. De centrale ligging van 2 m boven de grond in elke zuivelkudde werd geselecteerd als de bemonstering van de locatie.) Na cultuur van bacteriën, trakteren alle kolonies in de platen zoals beschreven in stappen 6.1 – 6.2. 6. identificatie van Culturable bacteriën Na 48u of 72 h van kweken, plaatst u de bacteriën in een centrifugebuis 2 mL. Het DNA van deze bacteriën of schimmels uitpakken met behulp van een multisource DNA-extractie Kit (Zie Tabel van materialen). Het DNA-extractieproces is beschreven in punt 4.2. Gebruik 200 μl extractie steekproef van DNA voor het 16S rDNA rangschikken. Gebruik dezelfde processen zoals beschreven in stappen 4.2, 4.3 en 4.4 op biologische samenstelling analyse.

Representative Results

In deze studie, wij uitgevoerd een evaluatie van de algehele PM verdeling en een uitgebreide analyse van de bioaerosols in een melkveebedrijf van September tot December. Veel milieu-factoren dragen bij aan de verdeling van de deeltjes van het aërosol. Wij onderzocht de verdelingen van de concentratie en de grootte van PM in het huis van een koe met behulp van een TSI laser deeltjes teller. Zoals blijkt uit figuur 1A, was de concentratie van aërosol deeltjes hoogste in December en het laagst in oktober, die kan worden veroorzaakt door veranderingen in temperatuur en luchtvochtigheid (tabel 1). De concentratie van inhaleerbare aërosol deeltjes (0.3-3.0 µm) goed voor meer dan 99% van de totale deeltje concentratie (figuur 1B), en de deeltjes in dit bereik bereikten de diepe luchtwegen, waardoor ernstige gevaren voor de mens en dieren. Biologische samenstelling analyse van monsters kan worden uitgevoerd door DNA extractie, bacteriële 16SrDNA en schimmel ITS regio sequentiebepaling in plaats van de cultuur van het micro-organisme. Uit de biologische analyse van bioaerosol monsters verzameld met behulp van een sampler Cyclonische aërosol of een sampler van grote hoeveelheden lucht met filters, kunnen we de efficiëntie van deze twee methoden voor het verzamelen van bacteriën en schimmels preliminair vergelijken. Figuur 2 toonde de analyseresultaten van de monsters van de bioaerosol die tijdens de wazig dagen van de Beijing in de campus van de Beijing Institute of Technology in 20 December 2016. Voor bacteriën collectie, de resultaten aangegeven dat de Cyclonische aërosol sampler verzameld veel meer genera dan de hoogvolume lucht sampler met filters (figuur 2A). Voor schimmels collectie toonde deze samplers gelijke collectie efficiëntie en bijna de zelfde geslacht abundanties (figuur 2B). Uit de resultaten gepresenteerd in Figuur 2, konden we voor het meten van de efficiency van de verschillende collectie van deze twee methoden voor bacteriën en schimmels. Voor bacteriën collectie, de Cyclonische aërosol sampler verricht veel beter dan de hoogvolume air sampler met filters omdat de monsters van de voormalige toonde een hogere geslacht overvloed (figuur 2A). Echter de schimmel sequencing analyse van de twee steekproeven uit verschillende bemonsteringsmethoden bleek bijna identiek communautaire structuren (figuur 2B). We studeerde culturable bacteriën met behulp van een zes-traps sampler van Andersen. Zoals afgebeeld in Figuur 3, worden de nummers van de kolonie van culturable bacteriën voor fase-VI deeltjes werd verminderd. Fase I deeltjes (deeltjes grootte > 8.2 µm) had de hoogste aantallen van culturable bacteriën kolonies. Het percentage van fase I kolonies in vier verschillende soorten varkensstallen inclusief zogende house, zwangere zeug huis, mesten huis en spenen huis was 33%, 30%, 26% en 34%, respectievelijk. Het percentage van fase II kolonies in vier verschillende soorten varkensstallen bedroeg 20%, 22%, 19% en 20% respectievelijk. Het percentage stadium III kolonies in vier verschillende soorten varkensstallen was 18%, 18%, 18% en 19% respectievelijk. Het percentage stadium IV kolonies in vier verschillende soorten varkensstallen was 17%, 16%, 16% en 16% respectievelijk. Het percentage van fase V kolonies in vier verschillende soorten varkensstallen bedroeg respectievelijk 10%, 10%, 14% en 6%. Etappe VI deeltjes (deeltjes grootte < 1.0 µm) had de laagste aantallen culturable bacteriën kolonies. Het percentage stadium VI kolonies in de vier verschillende soorten varkensstallen was 3%, 5%, 6% en 5%, respectievelijk. De lucht-monsters werden verzameld in vier verschillende soorten varkensstallen met behulp van een zes-traps sampler van Andersen en vervolgens gekweekt onder geschikte omstandigheden. Het geheel-genoom-DNA van de culturable bacteriën verzameld uit elk deeltje stadium was uitgepakt en gedetecteerd door bacteriële 16S rDNA en schimmel ITS regio sequentiebepaling. Totaal 91 geslachten en 158 soorten bacteriën werden geïdentificeerd in de culturable bacteriën in varkensstallen. De communautaire structuren van culturable bacteriën in vier verschillende soorten varkensstallen, met inbegrip van huis, zwangere zogende zaaien huis, mesten huis en spenen huis zijn opgenomen in Figuur 4 met gegevens uit de fase I naar fase VI. De inhoud van verschillende overheersende bacteriële geslachten is niet hetzelfde onder verschillende varkensstallen. Figuur 1: de concentratie en de omvang verdeling van PM in vier verschillende maanden. (A) Boxplot tijdens de onderzoeksperiode aantal PM. Elke boxplot bevat de Maximum, minimum, mediaan, twee kwartielen en abnormale waarde van de database. (B) de kaarten van de distributie van het gemiddelde grootte van PM. Er waren 80 koeien in het huis van September tot December. Het percentage van PM (≥ 3 µm) in vier maanden (September, oktober, November en December) was 0.005 0.005, 0.002 en 0.002 respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: biologische analyse van bioaerosol monsters verzameld door twee samplers. (A) en (B) de abundanties van bacteriële of schimmel geslachten in bioaerosol monsters met verschillende vergaringsmethoden weergeven. Bevochtigd-muur Air Sampler vertegenwoordigt de Cyclonische aërosol sampler. Quartz-Filters vertegenwoordigt de hoogvolume lucht sampler met filters. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: gemiddelde hiërarchische distributie kaarten van culturable bacteriën in vier soorten varkensstallen. De vier soorten varkensstallen zijn zogende house, zwangere zeug huis, huis mesten en spenen van huis. S1 aan S6 vertegenwoordigen de stadia van de zes deeltje (I tot VI) verzameld door de Andersen zes-traps sampler. De fasen zijn gedefinieerd door de aerodynamische diameter van de deeltjes in de lucht, met inbegrip van etappe VI (0,65-1.1 µm), V (1.1-2.1 µm) fase, fase IV (2.1-3.3 µm), fase III (3.3-4.7 µm), fase II (4.7-7.0 µm) en fase I (7.0 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: bacteriële communautaire structuren met verschillende abundanties in de lucht monsters. De lucht-monsters werden verzameld in vier verschillende soorten varkensstallen met behulp van een zes-traps sampler van Andersen en vervolgens gekweekt onder geschikte omstandigheden. Het geheel-genoom-DNA van de culturable bacteriën in elke deeltje fase die zijn verzameld door de Andersen zes-traps sampler was uitgepakt en gedetecteerd door bacteriële 16S rDNA sequentiebepaling. De nummers 1 tot en met 6 voor elk soort zuivelkudde vertegenwoordigen deeltjes fasen I tot en met VI gemeten door de Andersen zes-traps sampler. De geslachtsnaam voor iedere bacterie bevat de tekst aan de rechterkant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

In deze studie voorzien we enkele representatieve resultaten die zijn verkregen tijdens mistige dagen en in veehouderijen. De resultaten van bioaerosol monsters die zijn genomen tijdens de Beijing wazig dagen vergemakkelijkt een beter begrip van de biologische composities van de biologische samenstelling van PM zonder PM bij Beijing wazig dagen aanwezig. De resultaten van monsters van veehouderijen zorgt ook basisgegevens voor milieu lucht kwaliteitscontrole in varkensstallen en een theoretische stichting en de technische ondersteuning voor het fokken van gezonde en veilige productie in veehouderijen. Vele omgevingsfactoren, zoals temperatuur, vochtigheid en windsnelheid, kunnen bijdragen tot de distributie van spuitbussen deeltjes in het huis van de koe (Figuur 1). Eerdere studies is gebleken dat de PM in veehouderijen voornamelijk afkomstig is van het voeder, ontlasting, bont en veren, die kan worden gerelateerd aan de dierlijke activiteiten. Omgevingsfactoren kunnen beïnvloeden niet alleen dierlijke activiteiten, maar ook de aggregatie en verspreiding van PM in het huis van een relatief gesloten koe. Daarom sporen wij verschillende concentraties en grootte distributies van PM in vier verschillende maanden. Bovendien, waren de sanitaire conditie, voeding methode en dierlijke activiteit verschillend tussen de vier soorten varkensstallen, die ook gevolgen voor de structuur van hun gemeenschap van culturable bacteriën in de lucht (Figuur 4 hebben kunnen).

Echter in deze studie, we voornamelijk gericht op de beschikbare methoden die we gebruiken kunnen om het onderzoek naar de samenstelling en verdeling van de bioaerosols onder verschillende omgevingsomstandigheden. Vergeleken met andere microbiële monsters, die van airborne micro-organismen hebben zeer lage concentraties en worden vermengd met een groot aantal onzuiverheden, zoals anorganische stofdeeltjes, die de invoering van bepaalde moeilijkheden tijdens het verzamelen en de detectie van dergelijke micro-organismen21. Daarom moeten passende methoden voor de verzameling en detectie worden geselecteerd voor microbiële aërosolen. Microbiële aërosol monsters wordt over het algemeen uitgevoerd met behulp van de methode van de neerslag of gespecialiseerde apparatuur voor het verzamelen van de micro-organismen in de bemonstering van vloeibare, semi-vaste of vaste middellange22,23,24 . Vervolgens, sommige bijbehorende technische behandeling en specifieke testen en analyse worden vervolgens uitgevoerd25. Het medium van de bemonstering moet behouden micro-organismen te verminderen de fout detectie en analyse26is gekoppeld. Verschillende aërosol micro-organisme samplers hebben echter verschillende gevolgen voor de integriteit van monsters als gevolg van hun verschillende bemonstering beginselen en de media. Mensen hebben vele soorten bioaerosol samplers die gebruikmaken van verschillende bemonstering beginselen, zoals het traagheids impactie, filtratie weerstand en elektrostatische neerslag27ontworpen.

Invloed van samplers kunt duwen lucht PM in het medium van de bemonstering op hoge snelheid met behulp van extractie apparatuur. Er zijn twee soorten invloed samplers: vast en vloeibaar. Solid samplers invloed kan worden gebruikt om te monster bioaerosols met een lage concentratie en kan bijna ongevoelig voor lucht28stromen. Aërosol deeltjes van verschillende grootte kunnen eveneens worden gescreend en microben kunnen rechtstreeks in het kweekmedium, waardoor de overlevingskans van culturable micro-organismen10worden bemonsterd. Gevolge van inertial microbiële aërosol deeltjes collide gemakkelijk op hetzelfde terrein en kolonies gemakkelijk na cultuur kunnen overlappen. Op dit moment is de meest voorkomende solide impacting sampler de Andersen-6 microbiële aërosol sampler. In deze studie gebruikten we een zes-traps sampler van Andersen om te studeren het culturable bacteriën verdeeld in lucht PM van verschillende grootte.

Cyclonische aërosol samplers gebruiken cyclonen spiraal lucht op hoge snelheid in een cilinder of kegel. Bioaerosol deeltjes kunnen worden gescheiden van de luchtstroom door de middelpuntvliedende kracht, wat betekent dat microben kunnen hobbel in de binnenwand van de sampler en vervolgens worden verzameld door de buffer van de bemonstering. Deze methode is handig en kan worden gebruikt voor lange tijden in grote stroom bemonstering en bemonstering van de operaties. Echter kan niet deze methode worden uitgevoerd bij lage temperaturen, omdat de werking afhankelijk van de vloeistof is. De Cyclonische aërosol sampler gebruikt in deze studie is een Cyclonische bevochtigd-muur aërosol sampler die kan uitpakken en Pipetteer airborne pathogenen en deeltjes uit bemonsterde lucht in een kleine hoeveelheid water voor analyse29.

Filter samplers onder lage temperatuursomstandigheden kunnen werken en kunnen genieten van deeltjes boven een bepaalde grootte. Echter, ze hebben een grote impact op de microbiële activiteit en zijn gevoelig voor schade, dat zal grote invloed hebben op latere studies over de bemonstering van de activiteit. In deze studie werden bioaerosol monsters van Beijing wazig dagen verzameld met behulp van zowel een sampler van grote hoeveelheden lucht met filters en een Cyclonische aërosol sampler. Het doel van dit experiment was analyseert de biologische samenstelling van PM zonder de scheiding en kweken van airborne microben. Daarom waren deze twee bemonsteringsmethoden geschikt voor deze studie. Voor de Cyclonische aërosol sampler methode, airborne microben met een lage concentratie, gemakkelijk in de lopende buffer kunnen worden geëxtraheerd en vervolgens kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd zonder de extra behandeling die meestal voor filter monsters gebruikt wordt. In deze studie, deze twee bemonsteringsmethoden, cyclonische aërosol sampler en filter sampler, toonde verschillende bemonstering efficiëntie. De extra behandeling die meestal voor filter monsters gebruikt wordt, zoals het herstellen van het monster van het filter, is een van de belangrijkste verschillen tussen deze twee methoden. Bovendien werden de lucht monsters verzameld rechtstreeks in de lopende buffer door Cyclonische aërosol sampler terwijl de andere methode monsters op filters verzamelde. De kenmerken van verschillende soort bemonsteringsmethode kunnen bijdragen tot de efficiëntie van deze verschillende bemonstering. We kunnen aannemen dat de Cyclonische aërosol sampler de betere keuze voor micro-organisme collectie is, en deze veronderstelling nog een bevestiging moet.

In deze studie, werden bacteriële 16S rDNA en schimmel ITS regio sequencing gebruikt voor het uitvoeren van de biologische analyse van bioaerosols. 16SrDNA rangschikken is de bepaling van het 16S rDNA segmenten in de microbiële genoom30. 16S rDNA bestaat alom in prokaryoten hoge instandhoudings-en specificiteit, waardoor het nuttig is voor de identificatie van microbiële soorten31. Geheel-genoom sequencing vereist alleen de winning van genomic DNA en de daaropvolgende sequencing. Naast het produceren van een grote hoeveelheid gegevens, zorgt dit proces ook voor een meer uitgebreide analyse van microbiële communautaire structuur. Bovendien, metagenomics kan ook worden gebruikt in dit vakgebied door meer informatie in de toekomst. Handelsman et al. het concept van de metagenome in een paper van 1998 over microben in bodem32voor het eerst voorgesteld. In latere studies, het concept van de metagenome werd geleidelijk aanvaard en veel onderzoek werd uitgevoerd op de microben in de menselijke darm, de Oceaan en de bodem33,34,35opgenomen. Met de steun van high-throughput sequencing technologie, metagenomics snel heeft ontwikkeld en het speelt een steeds belangrijkere rol in de studie van pathogenen opsporen. Traditionele microbiële onderzoeksmethoden is voornamelijk afhankelijk van cultuur voor scheiding en zuivering. Worden echter, veel studies kunnen niet uitgevoerd omdat meer dan 99% van de microben kan niet worden gekweekt. In tegenstelling tot de traditionele methoden kun metagenomics je de genetische informatie van alle de microben in de omgeving zijn geheel zonder de noodzaak om te scheiden van de individuele organismen36. Een uitgebreide analyse van alle de resulterende micro-organismen kan direct worden uitgevoerd.

Kortom, deze studie toonde verschillende detectie-, bemonsterings- en analysemethoden die worden voor studies naar de biologische samenstelling van milieu PM gebruikt kunnen, met inbegrip van PM toezicht; PM bemonstering door een zes-traps sampler van Andersen, een sampler van grote hoeveelheden lucht met filters of Cyclonische aërosol sampler; en latere biologische analyse gebaseerd op DNA sequencing. In de praktijk kunnen deze methoden worden gebruikt onder verschillende omgevingscondities, zoals vele soorten veehouderijen. Onze protocollen en resultaten kunnen andere onderzoekers over de hele wereld de gezondheidsgevolgen van schimmel en bacteriële bioaerosols in de omgeving verder te verkennen.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiële steun voor deze studie kwamen uit de nationale Natural Science Foundation van China (nr. 41775148). De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

Materials

airborne laser particle counter TSI Inc, MN, USA model 9306
Andersen six-stage sampler Tisch Inc, USA TE-20-600
AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit Axygen, NY, USA AP-MN-MIS-GDNA-50G
FastPfu Polymerase TransGen Inc., Beijing, China AP221-01
High-volume air sampler Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China HH02-LS120
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific, USA Applied Biosystems® 7500
Soybean-Casein Digest Agar Becton, Dickinson and company, MD, USA 211043
Tissuquartz filters Pall, NY, USA 7204
Wetted-Wall Air Sampler Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE
Monroe, Washington 98272-1034 USA		 SASS 2300
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations–a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
  2. Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
  3. Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
  4. Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
  5. Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
  6. Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
  7. Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
  8. Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
  9. Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
  10. Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
  11. Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226 (2013).
  12. Wery, N. Bioaerosols from composting facilities–a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42 (2014).
  13. Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
  14. Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
  15. Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
  16. Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
  17. Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
  18. Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing’s PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
  19. Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
  20. Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
  21. Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
  22. Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
  23. Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
  24. Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
  25. Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
  26. Lednicky, J., et al. . Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
  27. Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
  28. Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
  29. Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
  30. Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
  31. Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059 (2018).
  32. Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
  33. Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677 (2018).
  34. Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
  35. Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
  36. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).

Tags

BioaerosolEnvironmental Particulate MatterAirborne Pathogen DetectionAirborne Laser Particle CounterCyclonic Aerosol SamplerHigh Volume Air SamplerBiological Composition Analysis16S Recombinant DNAITS RegionFungal Recombinant RNA OperonPolymerase Chain ReactionCulturable Airborne BacteriaCulturable Airborne FungiAndersen Six-stage Sampler

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Wang, Z., Li, J., Qian, L., Liu, L., Qian, J., Lu, B., Guo, Z. Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions. J. Vis. Exp. (143), e58795, doi:10.3791/58795 (2019).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image