Summary

Generation von Krebs Zellklonen Telomeric Repeat-haltigen RNA TERRA von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt zu visualisieren

Published: January 17, 2019
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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Krebs Zellklonen mit einem MS2 Sequenz Beschriftung auf einer einzigen Produktlinie zu generieren. Dieser Ansatz, unter Berufung auf das MS2-GFP-System ermöglicht die Visualisierung der endogenen Abschriften der telomeric Repeat-haltigen RNA (TERRA) von einem einzigen Telomere in lebenden Zellen ausgedrückt.

Abstract

Telomere sind transkribiert telomeric Repeat-haltigen lange forensisches RNAs (TERRA), verursachend, die sind vorgeschlagen worden, eine wichtige Rolle in der Telomere Biologie, einschließlich Heterochromatin Bildung und Telomere Länge Homöostase spielen. Neue Erkenntnissen zufolge TERRA Moleküle auch mit inneren chromosomalen Regionen zur Regulierung der Genexpression in Mauszellen embryonaler Stammzellen (ES) interagieren. Im Einklang mit dieser Beweis RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch) Analysen haben gezeigt, dass nur eine Teilmenge von TERRA Abschriften an Chromosomenenden lokalisieren. Ein besseres Verständnis der Dynamik von Molekülen TERRA hilft, ihre Funktion und Wirkmechanismen zu definieren. Hier beschreiben wir eine Methode zum Beschriften und Single-Telomere TERRA Transkripte in Krebszellen mit dem MS2-GFP-System zu visualisieren. Zu diesem Zweck präsentieren wir ein Protokoll, um stabile Klone zu erzeugen mit Hilfe der AGS menschlichen Magen Krebs Zell-Linie mit MS2 Sequenzen zu einer einzigen Produktlinie integriert. Transkription von TERRA von MS2-Tags Telomere ergibt sich in der Expression von MS2-Tags TERRA-Moleküle, die durch live-Cell-Fluoreszenz-Mikroskopie auf Co Ausdruck ein MS2-RNA-bindende Protein mit GFP (MS2-GFP) verschmolzen visualisiert werden. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die Dynamik des Single-Telomere TERRA Moleküle in Krebszellen zu studieren, und es kann auf andere Zelllinien angewendet werden.

Introduction

Die lange nichtcodierender RNA-TERRA ist aus der Region subtelomerischen Chromosomen transkribiert und seine Transkription verläuft in Richtung der Chromosomenenden, beendet in der telomeric repeat Trakt1,2. Aus diesem Grund TERRA Abschriften bestehen aus subtelomeric stammenden Sequenzen an ihrem 5′-Ende und beenden mit telomeric Wiederholungen (UUAGGG bei Wirbeltieren)3. Wichtige Rollen vorgeschlagen worden für TERRA, einschließlich Heterochromatin Bildung Telomere4,5, DNA-Replikation6, Förderung der homologen Rekombination zwischen Chromosom7,8 endet , 9, Regulierung der Telomere Struktur10und Telomere Länge Homöostase2,11,12,13. Darüber hinaus interagieren TERRA Transkripte mit zahlreichen Extratelomeric Websites, weit verbreitete Genexpression in Maus embryonaler Stammzellen (ES) Zellen14zu regulieren. Im Einklang mit diesen Beweis, RNA Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (RNA-Fisch) Analysen haben gezeigt, dass nur eine Teilmenge der TERRA Transkripte lokalisieren Telomere1,2,15. Darüber hinaus wurde TERRA Form nuklearen Aggregate Lokalisierung auf der X und Y Chromosomen in Maus Zellen2,16berichtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass TERRA Transkripte komplexe Dynamik innerhalb des Zellkerns zu unterziehen. Verständnis der Dynamik von Molekülen TERRA wird dazu beitragen, ihre Funktion und Wirkmechanismen zu definieren.

Das MS2-GFP-System hat verbreitet, RNA-Moleküle in lebenden Zellen aus verschiedenen Organismen17,18zu visualisieren. Dieses System hat früher zu markieren und zu visualisieren Single-Telomere TERRA Moleküle in S. Cerevisiae12,19. Mit diesem System vor kurzem zeigte sich, dass Hefe TERRA Transkripte lokalisieren innerhalb des Zytoplasmas während der Phase der Post-Diauxic-Schicht darauf hindeutet, dass TERRA extranuclear Funktionen20ausüben kann. Wir haben vor kurzem MS2-GFP-System verwendet, um Single-Telomere TERRA Transkripte in Krebs Zellen21zu studieren. Zu diesem Zweck wir beschäftigt die CRISPR/Cas9-Genom-editing-Tool, MS2 Sequenzen an ein einzelnes Telomer (Telomere 15q, im folgenden Tel15q) zu integrieren und erhalten Klone MS2-Tags endogenen Tel15q TERRA (TERRA-MS2 Klone) zum Ausdruck zu bringen. Co Ausdruck ein GLP-verschmolzen MS2-RNA-bindende Protein (MS2-GFP), das erkennt und bindet MS2-RNA Sequenzen ermöglicht Visualisierung von Single-Telomere TERRA Transkripte in lebenden Zellen21. Das hier abgebildete Protokoll soll für die Generation von TERRA-MS2 Klonen erforderlichen Schritte im Detail zu beschreiben.

Um TERRA-MS2 Klone zu erzeugen, ist eine MS2 Kassette innerhalb der subtelomerischen Region der Telomere 15q, integriert der TERRA Promotor Region und Transkription Startsite nachgeschaltet. Die MS2-Kassette enthält eine Neomycin-Resistenz-Gen von Lox-p Seiten flankiert, und seine Integration in die Produktlinie 15q erfolgt über CRISPR/Cas9 System22. Nach Transfektion von der MS2 Kassette, einzelnen Klone ausgewählt sind und subtelomerischen Integration der Kassette wird verifiziert durch PCR, DNA Sequenzierung und Southern blot. Positive Klone sind mit einem Cre exprimierenden Adenovirus infiziert, um die Auswahlmarkierung in der Kassette entfernen nur MS2 Sequenzen und eine einzelne Lox-p vor Ort bei der Produktlinie 15q verlassen. Ausdruck der MS2-Tags TERRA Abschriften von Tel15q wird von RT-qPCR überprüft. Zu guter Letzt drückt sich die MS2-GFP Fusionsprotein in TERRA-MS2 Klone über retroviralen Infektion um MS2-TERRA Transkripte von Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. TERRA Transkripte von RNA-Fisch leicht nachweisbar und live Cell Imaging mit telomeric Repeat-spezifische Sonden1,2,15,23. Diese Ansätze liefern wichtige Informationen über die Lokalisation der Gesamtbevölkerung von TERRA Moleküle in einzelne Zelle Auflösung. Die Generation der Klone mit MS2 Sequenzen zu einer einzigen Produktlinie ermöglicht es Forscher studieren die Dynamik des Single-Telomere TERRA Transkripte in lebenden Zellen, die helfen die Funktion und die Mechanismen der Wirkung von TERRA zu definieren.

Protocol

1. Auswahl von Neomycin resistente Klone Wachsen Sie AGS-Zellen in Ham es F-12_K (Kaighn) Medium ergänzt mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (0,5 Einheiten pro mL Medium) und Streptomycin (0,2 µg pro mL Medium) bei 37 ° C und 5 % CO2. Die Zellen mit einem 50-60 % Zusammenfluss mit dem SgRNA/Cas9 mit dem Ausdruck Vektor und der MS2-Kassette auf eine 01:10 transfizieren Molverhältnis21.Hinweis: In einer parallelen Programmierung überprüfen …

Representative Results

Abbildung 1 stellt einen Überblick über die experimentelle Strategie. Die wichtigsten Schritte des Protokolls und einer indikativen Zeitlinie zur Erzeugung von TERRA-MS2 Klone in AGS Zellen werden (Abb. 1A) angezeigt. Am 1. Tag sind mehrere Brunnen von einem 6-well-Platte mit der MS2 Kassette und SgRNA/Cas9 zum Ausdruck zu bringen (siehe Abbildung 1B)…

Discussion

In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine Methode, um Krebserkrankungen Zellklonen mit MS2 Sequenzen innerhalb Produktlinie 15q integriert zu generieren. Diese Klone verwenden, werden die MS2-Tags TERRA-Moleküle aus der Produktlinie 15q transkribiert durch Fluoreszenz-Mikroskopie von Co Ausdruck ein MS2-GFP Fusionsprotein erkannt. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die Dynamik der TERRA von einem einzigen ausgedrückt zu studieren Telomere in lebenden Zellen21. In diesem Protokoll werde…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind dankbar für das Personal der die erweiterte Bildgebung von CIBIO an der Universität Trient und BioOptics Licht Mikroskopie Facility bei Max F. Perutz Laboratories (MFPL) in Wien. Die Forschung führt zu diesen Ergebnissen wird finanziell von der Mahlke-Obermann-Stiftung und der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms für Forschung, technologische Entwicklung und Demonstration unter Finanzhilfevereinbarung keine 609431 EG EG wird unterstützt durch ein Rita Levi Montalcini-Stipendium vom italienischen Ministerium für Bildung, Universität und Forschung (MIUR).

Materials

AGS cells Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X GIBCO 21127022 Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine  CORNING MT25005CI Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution CORNING 30-002-CI Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 Component of cell culturing medium
DMEM 1X GIBCO 21068028 culturing medium for phoenix cell
CaCl2 Sigma Aldrich C1016 used in phoenix cell transfection
HEPES Sigma Aldrich H3375 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl Sigma Aldrich P9333 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose Sigma Aldrich D9434 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl Sigma Aldrich S7653 used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X CORNING 59430C used in cell split
DPBS 1X GIBCO 14190250 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO Sigma Aldrich D8418 Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate Formedium G4185 selection drug for 
Gelatin solution Bioreagent Sigma Aldrich G1393 cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base Fisher BioReagents 10376743 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA Sigma Aldrich E6758 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS Sigma Aldrich 71729 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K Thermo Fisher AM2546 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A Thermo Fisher 12091021 RNA degradation during DNA extraction
Agarose Sigma Aldrich A5304 DNA gel preparation
Atlas ClearSight Bioatlas BH40501 Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol Fisher BioReagents BP28184 DNA precipitation
Sodium Acetate  Sigma Aldrich 71196 Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system Promega A9282 Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol AMBION 15596018 Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I THERMO SCIENTIFIC 89836 degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mix Invitrogen 10297018 used in RT and PCR reactions
DTT Invitrogen 707265ML used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock Thermo Fisher EO0381 RNase inhibitor
MOPS Sigma Aldrich M9381 preparation of RNA gel
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen 18080-093 Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant) Thermo Scientific EP0501 PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX PCR BIOSYSTEMS PB 20.14 qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887 used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000 Sigma Aldrich 89510 Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom Ibidi 81158 used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

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Diesen Artikel zitieren
Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).

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