小鼠边缘区 b 细胞剪切流诱导迁移的体外分析

免疫细胞是人体中运动最强的细胞, 往往必须与血液和淋巴流动的剪切力抗衡。然而, 关于白细胞^{1、2、3、4、5}的剪切力诱导迁移的研究相对较少。我们在这里提出了一个可靠的定量协议, 以分析免疫细胞在体外流动的反应。执行检测不需要制造组件, 所有设备和耗材均可在市场上获得。该协议, 包括细胞纯化和迁移分析, 可以在一天内完成。最后, 尽管我们描述了边缘区 b 细胞 (mzb) 的迁移, 但该协议可以用来分析其他类型免疫细胞的迁移。因此, 使用该方法系统地分析广泛的白细胞, 并对其进行全面的条件分析是可行的。

mzb 是 b 细胞的群体, 在小鼠体内, 仅存在于毛囊内部和边缘区 6^、7、8、9之间的脾脏和穿梭。边缘区域是一层大约5-10 个厚的免疫细胞。细胞层包裹毛囊, 主要由 mzb 和巨噬细胞组成, 但也包括不变的自然杀手 t (inkt) 细胞、树突状细胞 (dc) 和中性粒细胞等¹⁰。边缘区域的细胞暴露在来自脾动脉的单向血流中, 这些血流终止于卵泡周围的边缘窦。血液从边缘窦的洞中通过边缘区域流动, 然后收集在红色果肉中的静脉窦, 并恢复到循环¹¹。血液的自由流动在 mzb 上冲走, 使它们暴露在血液中携带的抗原中。mzb 通过在边缘区域和毛囊内部之间自动穿梭, 将抗原带入毛囊, 而毛囊不受血液影响。因此, 当 mzb 向毛囊穿梭时, 它们必须迁移血流12的剪切力 (图 1a).

在这个协议中, 我们描述了如何定量地确定免疫细胞 (如 mzb) 在体外对无流动或高流量的反应, 以揭示它们是如何被编程在体内迁移的。在第一步中, mzb 从老鼠脾脏中纯化, 使用磁珠与市售试剂盒中的抗体结合。新隔离的 mzb 被引入流动室滑块的井中, 允许安装在整合素配体上, 并使用泵系统暴露在迁移缓冲流中 (图 2 a)。这些细胞是使用延时视频显微镜系统成像的。然后使用免费的 imagej 插件 mtrack2 13, 14^对图像进行分析, 以自动跟踪细胞。然后, 可以使用免费的 ibidi 趋化工具¹⁵对轨迹进行量化, 以确定各种参数, 包括速度、直线度和迁移指数。这些值可用于确定迁移抑制剂、细胞刺激器、趋化因子和其他影响迁移的化学品对剪切流诱导迁移的影响, 以了解控制体内免疫细胞运动的力量。