Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

Apesar da terapia de antiretroviral eficaz a longo prazo, HIV persiste em estado latente, como um provirus integrado em memória de células T CD4 +¹. A estrutura da cromatina do HIV-1 5′ promotor de repetição tempo terminal (LTR) e modificações epigenéticas como metilação de histonas e deacetilação de histona por DNA metiltransferases (DNMT) e histona deacetilases (HDAC) são mecanismos importantes, levando a repressão transcriptional e, assim, a latência de pós-integração^2,3. Uma grande variedade de agentes de inversão de latência (órgãos) foi investigada por sua eficácia induzir a produção de vírus in vitro e in vivo de Latentemente infectadas descanso T CD4 + células^{4,5,6,7 ,8}. Entre os órgãos testados, HDACi (inibidores HDAC) e aposta contem inibidores (BETis) induzem ocorre descondensação da cromatina e lançamento da transcrição positivo alongamento fator b (P-TEFb), respectivamente, levando a subsequente aliviar do transcriptional repressão em 5′ LTR e ativação de HIV expressão^{9,10,11,12,13}. No entanto, a magnitude da reativação alcançada por esses órgãos foi limitada apenas um aumento modesto na célula associada unspliced HIV mRNA (RNA nos), indicativo de transcrição viral, observou-se ex vivo^14,15. Importante, estes órgãos também conseguiram induzir uma redução da frequência de células Latentemente infectadas.

Expressão de HIV pode ser ainda mais restrito por ineficiente emenda¹⁶ , bem como defeitos de exportação nuclear de multiplicar emendados HIV RNA (RNA MS)¹⁷. Assim, identificando novas classes de órgãos que são mais potentes e podem afetar aspectos distintos da vírus produção pós integração são necessários. Além disso, o desenvolvimento de novos ensaios que ajudam a definir os compostos ideais para eficientemente reverter a latência é necessário.

Aqui, é apresentado um protocolo, que utiliza uma abordagem de alto rendimento para avaliação funcional do impacto das intervenções na transcrição orientada por HIV LTR e emenda. Em breve, um novo dual LTR-driven cor repórter sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figura 1) é usado para avaliar a reativação de HIV por citometria de fluxo. Este repórter fluorescente, a expressão do mRNA de HIV unspliced (4kb) leva à expressão da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP), enquanto a expressão do mRNA emendados (2KB) levaria a expressão de proteínas fluorescentes de Discosoma SP. vermelho (DsRed). Brevemente, usamos uma proteína fluorescente de fusão Env-EGFP, gp140unc. EGFP, onde a sequência de codificação da EGFP foi colocada no quadro com um formulário truncado e un-entalhado do envelope (Env). As alterações foram introduzidas para ablate o local de clivagem, impedindo a dissociação do Env em gp120 e gp41-EGFP e truncar a proteína gp160 antes do domínio transmembrana criando um análogo solúvel de Env, que facilita o correto dobramento e expressão de EGFP. Sobre a expressão dentro de uma célula, Rev localiza-se no núcleo, onde ele Medeia a exportação nuclear citoplasmática de 4KB env mRNA através da interação com o elemento responsivo rev (RRE). Truncamento de Env não compromete a RRE, que se situa entre gp120 e gp41, A7 3′ site da tala. Neste sistema, emendando a HIV-1 splice doador 4 (SD4) e splice aceitador 7 (AE7) resultados na produção de um 2KB mRNA codificação de uma proteína não-funcional de Rev truncada no aminoácido 38 fundido a DsRed proteína fluorescente, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed foi inserido o exon 2^nd de Rev no aminoácido 38 por sobreposição extensão¹⁸. Para facilitar a exportação nuclear de unspliced mRNA, um vetor de expressão mamíferos codificação Rev (pCMV-Rev^NL4.3) foi co transfected com construção de repórter fluorescente (Figura 2). Essa construção único repórter descrita aqui é útil na avaliação da elevado-produção de HIV transcrição e emenda, sem a necessidade de usar vetores virais.