RNA-ha basato riprogrammazione dei fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte

Lavorare in condizioni di RNAsi-libera e utilizzare tecniche asettiche quando possibile. Effettuare tutte le manipolazioni di legate alla cultura delle cellule in un armadietto utilizzando tecniche asettiche di sicurezza biologica. Seguire le norme di biosicurezza istituzionale per il lavoro con le cellule umane. 1. reagenti e attrezzature per la preparazione di riprogrammazione iniziazione Preparare i fattori riprogrammazione codifica cocktail di mRNA per volta. Seguire il protocollo precedentemente pubblicato10 per eseguire la trascrizione in vitro , tappatura e defosforilazione procedure per ogni modificate mRNA che codifica per il fattore individuale di riprogrammazione. Dopo la fase di purificazione finale, eluire il mRNA modificate con acqua priva di nucleasi, integrare la soluzione purificata di mRNA modificate con 1 inibitore di RNAsi U / µ l, quantificare i mRNAs modificati utilizzando uno spettrofotometro e conservare a-80 ° C fino a 6 mesi. Preparare diverse aliquote di ogni mRNA modificate per ridurre al minimo il numero di cicli di gelo-disgelo.Nota: Protocolli simili per modificate mRNA produzione sono stati segnalati altrove5,8,11. Modelli per trascrizione in vitro possono essere generati dall’amplificazione di PCR da corrispondenti modelli del plasmide utilizzando primers elencati nella Tabella materiali secondo il protocollo precedentemente pubblicato10. Modelli del plasmide per ogni fattore di riprogrammazione (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) e mWasabi (controllo per la transfezione) sono disponibili da Addgene, un repository di plasmide senza scopo di lucro. Mescolare insieme tutti i mRNA modificati con un rapporto molare di 3:1:1:1:1:1 (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) e includono il 10% mWasabi per volta mRNA come controllo per l’efficienza di trasfezione. Regolare la concentrazione del mRNA modificate completa riprogrammazione mix per una concentrazione finale di 100 ng / µ l con l’aggiunta di acqua priva di nucleasi completato con 1 inibitore di RNAsi U / µ l. Preparare sette 33 aliquote µ l dei completi per volta mRNA cocktail. Conservare le aliquote di riprogrammazione miste a-80 ° C.Nota: per ogni trasfezione, 1.000 ng del cocktail modificate mRNA viene aggiunto per pozzetto (cioè, un totale di 3.000 ng per 3 pozzi). Ogni 33 µ l aliquota viene ridimensionato per transfect 3 pozzetti di una piastra di formato da 6 pozzetti e include 3 µ l di volume in eccesso di compensare errori di pipettaggio. Preparare sette 33 aliquote µ l è sufficiente per completare una riprogrammazione del fibroblasto completo di 3 pozzetti in una piastra di formato da 6 pozzetti. Preparare il cocktail di riprogrammazione miRNA imita. Sciogliere liofilizzato miRNA imita (Syn-ha-miR-302a – 3P, Syn-ha-miR-302b – 3P, Syn-ha-miR – 302c – 3P, Syn-ha-miR-302d-3 p, Syn-ha-miR-367-3 p.) a una concentrazione finale di 5 pmol / µ l (5 µM) in acqua privo di nucleasi completata con 1 U / µ l di inibitore di RNAsi. Preparare diverse aliquote di ogni mimica di miRNA e conservare a-80 ° C per la conservazione a lungo termine. Mescolare tutti i miRNA imita in un rapporto molare di 1:1:1:1:1 ad una concentrazione finale di 5 pmol / µ l (5 µM). Preparare sette 14 aliquote µ l del quieto imita mix. Conservare le aliquote miste a-80 ° C.Nota: Per ogni trasfezione, 20 pmol del miRNA imita mix viene aggiunto per pozzetto (cioè, un totale di 60 pmol per 3 pozzi). Ogni 14 µ l aliquota viene ridimensionato per transfect 3 pozzetti di una piastra di formato da 6 pozzetti e include 2 µ l di volume in eccesso di compensare errori di pipettaggio. Preparare sette 14 aliquote µ l è sufficiente per completare una riprogrammazione del fibroblasto completo di 3 pozzetti in una piastra di formato da 6 pozzetti. Preparare il tampone di transfezione. Pre-riscaldare una bottiglia da 500 mL e una bottiglia da 100 mL di terreno nuovo siero ridotto a temperatura ambiente (TA) per circa 2 h. Non utilizzare un bagno d’acqua. Trasferire un pH-metro a una cappa di biosicurezza. Lavare l’elettrodo di vetro con acqua priva di nucleasi. Calibrare il misuratore di pH secondo le istruzioni del produttore. Lavare l’elettrodo nuovo con acqua priva di nucleasi. Trasferire entrambe le bottiglie del siero ridotto mezzo nella cappa di biosicurezza. Utilizzare la bottiglia da 500 mL RT per aggiustare il pH. Misurare il pH di base del mezzo siero ridotto inserendo elettrodo di pH-metro vetro nel buffer. Attendere fino a 1 min prima di leggere il pH sul misuratore. Aggiungere 3-4 mL di NaOH M 1 in 500 mL di siero ridotto medio, chiudere la bottiglia e mescolare bene. Attendere fino a 5 min prima apertura del flacone per la misurazione del pH. Inserire l’elettrodo di pH nel buffer e attendere che si stabilizzi la lettura il pH-metro. Continuare ad aggiungere piccoli volumi di 1 M NaOH fino a quando il pH del mezzo di siero ridotto raggiunge 8,15 – 8,17. Tarare il pH-metro più volte durante il processo. Se in qualsiasi punto il pH diventa superiore a 8,18, ridurre aggiungendo mezzo ridotto-siero fresco dalla bottiglia 100ml pre-riscaldato (punto 1.3.1).Nota: Il pH del tampone siero ridotto medium-basato transfezione è fondamentale. Riprogrammazione avrà esito positivo se il pH del tampone transfezione è circa 8,2 ± 0,05 ma potrebbe non riuscire se il pH è superiore a 8,25. Pertanto, si consiglia di interrompere l’aggiunta di NaOH pH di tampone raggiunge 8,15 – 8,17. Questo farà sì che il pH finale del buffer transfezione è circa 8,2 – 8,22 dopo la sterilizzazione. Filtro sterilizzare il buffer di transfezione utilizzando un sistema di filtrazione sotto vuoto 0,22 µm. Aliquota buffer sterilizzato in provette da 5 o 15 mL con uno spazio minimo di aria. Conservare le aliquote del buffer transfezione per fino a 3 mesi a 4 ° C. Misurare periodicamente il pH delle aliquote. Scartare le aliquote se il pH è superiore a 8,25. Limitare l’utilizzo aliquota a 2 transfezioni solo dal momento che l’esposizione del buffer transfezione di aria atmosferica aumenta il pH del tampone. Preparare il supporto di espansione del fibroblasto (FEM): minimo essenziale supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 1 x 1 x penna/mal/fungizone, 55 µM 2-mercaptoetanolo, 1 integratore di glutammina x, gli aminoacidi non essenziali. Memorizzare la FEM a 4 ° C. Preparare il supporto di riprogrammazione: DMEM/F12 (nessun HEPES) completati con knockout 20% siero sostituzione (KOSR), 0,5 x gli aminoacidi non essenziali, integratore di glutammina x 0,5, 55 µM 2-mercaptoetanolo, 50 µ g/mL di acido ascorbico, 1 x penna/mal/fungizone, bFGF 100 ng/mL e 200 ng/mL B18R. Preparare il supporto all’inizio della riprogrammazione senza bFGF e B18R e conservarlo a 4 ° C. Non utilizzarlo oltre 1 mese dopo la preparazione. Aggiungere bFGF e B18R immediatamente prima di ogni utilizzo ad un’aliquota dimensionata per l’uso di quel giorno. Preparare il supporto di placcatura con l’aggiunta di 5% inattivati al calore (HI) FBS nel mezzo di riprogrammazione contenente 20% KOSR senza bFGF e B18R da passo 1,5. Preparare il medium fresco il giorno della destinazione d’uso. Aggiungere bFGF e B18R immediatamente prima dell’uso il giorno 0 di riprogrammazione. Calibrare le incubatrici di coltura del tessuto prima dell’inizio della riprogrammazione secondo le istruzioni del produttore utilizzando un palmare digitale CO2 analyzer. Utilizzare un incubatore di basso-O2 per la procedura di riprogrammazione per garantire la generazione di successo iPSC. 2. coltura fibroblasti per riprogrammazione Preparare i fibroblasti prima dell’inizio della riprogrammazione (giorno -2). Cappotto una nuova piastra di coltura del tessuto di 10 cm con 5 mL di 0,1% di gelatina. Tocca o la piastra per garantire che l’intera superficie è rivestita di turbinio. Incubare per 15 min a 37 ° C. Aspirare la gelatina e aggiungere 10 mL di FEM. Set da parte. Non consentono la superficie rivestita della piastra ad asciugare prima di aggiungere FEM. Aspirare accuratamente il medio speso dai fibroblasti. Sciacquare le cellule una volta con 5 mL di DPBS per rimuovere il siero residuo. Aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA. Scuotere delicatamente la piastra per garantire una copertura completa sulle celle. Aspirare il liquido in eccesso, lasciando ~ 500 µ l di tripsina. Non aspirare troppo, poiché questo può asciugare e uccidere i fibroblasti. Incubare i fibroblasti con tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C. Rimuovere la piastra dall’incubatrice e con fermezza, ma delicatamente toccare il lato della piastra per sloggiare le cellule. Controllare le cellule sotto il microscopio. Se le cellule sono staccati e galleggianti, procedere. Se le cellule sono ancora collegate, incubare per altri 3 min. Risciacquo/raccogliere rapidamente le cellule indipendenti con 5 mL di soluzione FEM per neutralizzare la tripsina-EDTA. Spostare la sospensione del fibroblasto in una provetta conica da 15 mL. Assicurarsi che le celle siano ben miscelate. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per rompere grandi ciuffi di celle, quindi contare su un emocitometro. Trasferimento 2.5 x 105 celle nel piatto di 10 cm rivestite con gelatina preparata al punto 2.1.1. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO2 incubatrice umidificata coltura del tessuto normale.Nota: La densità delle cellule è critica per ottenere alta efficienza riprogramma, come è importante che i fibroblasti sono sani e rapida divisione. Placcatura di 2.5 x 105 cellule produce una confluenza di 40-60% 2 giorni più tardi per la maggior parte dei campioni del fibroblasto. Regolare di conseguenza l’importo per le cellule malate o senescenti raggiungere il desiderato 40-60% confluency 48 ore più tardi. Sostituire il mezzo con 10 mL di FEM fresco il giorno seguente (giorno -1). Piastra i fibroblasti per avviare riprogrammare (giorno 0). Verificare che i fibroblasti di essere riprogrammate sono al confluency di 40 – 60% (Figura 2, giorno 0). Se le celle sono sovra – o sotto-confluenti, passaggio i fibroblasti come descritto al punto 2.1 e regolare di conseguenza la densità di placcatura. Cultura per altri 2 giorni. Trasferire 4 mL di DPBS in una provetta conica da 15 mL. Aggiungere 100 µ l di ricombinante umano (rh) laminin-521. Pipettare su e giù per mescolare accuratamente. Aggiungere 1 ml per pozzetto di rhLaminin-521 diluito in 3 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Incubare la piastra rivestita a 37 ° C per 2 h. Scaldare 6 mL di FEM e 4 mL di placcatura medio a 37 ° C. Integrare il mezzo di placcatura con bFGF ad una concentrazione finale di 100 ng/mL e B18R a una concentrazione finale di 200 ng/mL. Aspirare accuratamente il mezzo esaurito da fibroblasti (punto 2.2.1). Lavare le cellule con 5 mL di DPBS e aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA. Scuotere delicatamente la piastra per coprire le cellule con tripsina-EDTA. Aspirare il liquido in eccesso, lasciando ~ 500 µ l di tripsina, come fatto nel punto 2.1.3. Incubare i fibroblasti con tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C. Rimuovere la piastra dall’incubatrice e con fermezza, ma delicatamente toccare il lato della piastra per sloggiare le cellule. Controllare le cellule sotto il microscopio. Se le cellule sono staccati e galleggianti, procedere. Se le cellule sono ancora collegate, incubare per altri 3 min. Risciacquo/raccogliere le cellule indipendenti con 5 mL di soluzione FEM per neutralizzare la tripsina-EDTA. Spostare la sospensione del fibroblasto in una provetta conica da 15 mL. Assicurarsi che le celle sono ben miscelate e contano su un emocitometro. Pipetta 12.000 celle in 4 mL di terreno di placcatura preriscaldata dal punto 2.2.4.Nota: Non centrifugare le cellule in qualsiasi punto. Il numero di celle placcate può essere registrato su o giù come richiesto per le linee o veloce-crescita lenta, rispettivamente. Rimuovere la piastra rivestita dall’incubatrice ed aspirare diluito rhLaminin-521 dai pozzetti rivestiti. Non lasciare la superficie dei pozzetti per asciugare. Risospendere delicatamente le cellule nel mezzo di placcatura. Pipettare 1 mL di sospensione cellulare in ogni rivestito bene (cioè, 3.000 cellule per pozzetto). Inserire le cellule placcate in un incubatore di coltura tissutale tri-gas con O2 al 5% (basso-O2). Una volta impostata la piastra verso il basso, delicatamente ma accuratamente disperdere le cellule dall’alternanza tra un movimento su/giù poi a sinistra/destra. Ripetere i movimenti 2 volte. Incubare le cellule durante la notte. Non agitare la piastra per mescolare. Dispensare 4 mL di riprogrammazione medio e una provetta conica da 15 mL e posizionarla nell’incubatrice basso-O2 con un tappo allentato per equilibrare durante la notte. Non aggiungere bFGF e B18R fino al giorno seguente. 3. l’inizio della riprogrammazione (giorno 1) Nota: Una volta avviata la riprogrammazione, manutenzione giornaliera è necessaria per circa 1 mese. Essere sicuri di pianificare di conseguenza. Tutte le incubazioni successiva delle cellule devono essere eseguite in condizioni di basso-O2 in 37 ° C, 5% CO2, incubatore di coltura del tessuto di 5% O2 umidificata tri-gas. Sostituire il mezzo di placcatura almeno 1 h prima del transfezione. Rimuovere il mezzo di riprogrammazione equilibrato dall’incubatrice basso-O2 . Aggiungere bFGF ad una concentrazione finale di 100 ng/mL e B18R a una concentrazione finale di 200 ng/mL. Mescolare bene. Procedendo con 1 bene in un momento, utilizzare una pipetta da 1 mL per rimuovere il mezzo esaurito e sostituirlo con 1 mL di riprogrammazione supplementato con bFGF e B18R. Ripetere questa operazione per ciascun pozzetto. Non utilizzare aspirazione a vuoto, che asciuga le cellule eccessivamente, è causa di stress e riduce l’efficienza di riprogrammazione. Riportare la piastra con le cellule nella incubatrice basso-O2 . Transfect fibroblasti con 5 µ l di reagente di transfezione di RNAiMax a 1 µ g di mRNA modificate, e 1 µ l di reagente di transfezione per 6 pmoli di miRNA imita per trasfezione.Nota: Risultati ottimali si ottengono quando transfezioni procedere per h 16 – 20. Il reagente di transfezione è diluito 10 x; 100 ng / µ l mRNA modificate cocktail è diluito 5 volte; e i 5 Mimic di miRNA pmol / µ l mix è diluito 8,33 x con il buffer di transfezione prima di complessazione. Vedere la tabella 1 per un riepilogo dell’installazione transfezione. Mentre prepara la transfezione mescola, minimizzare l’esposizione potenziale dei reagenti di RNAsi seguendo la pratica di laboratorio standard. Equilibrare una parte aliquota del buffer transfezione (punto 1.3) per circa 1 h a TA. Non utilizzare un bagno di acqua di 37 ° C o in un incubatore per scaldare il buffer di transfezione. Rimuovere una singola aliquota dei mRNAs modificate (33 µ l) e miRNA imita (14 µ l) da-80 ° C e caldo a RT per circa 3-5 min, fino a che sciolto. Non scongelare le aliquote a 37 ° C. Spin loro giù brevemente in un microfuge. Riscaldare il reagente di transfezione di RT per circa 3-5 min. Non utilizzare un bagno di acqua di 37 ° C o in un incubatore. Capovolgere il tubo chiuso 2 – 3 volte per mescolare il reagente. Rallentare brevemente in un microfuge. Trasferire 279 µ l di buffer di transfezione di RT in un tubo del microcentrifuge RNAsi-libera. 31 µ l di reagente di transfezione per ottenere un volume finale di 310 µ l. Mix accuratamente pipettando. Non centrifugare. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 1 min.Nota: Questo volume del reagente di transfezione diluito è sufficiente al complesso sia il mRNA e miRNA modificati imita aliquote dal punto 3.2.3. Aggiungere 132 µ l di buffer di transfezione di RT ad l’aliquota 33 µ l di mRNA modificate. Pipettare delicatamente per mescolare: volume finale è 165 µ l. Aggiungere 102,6 µ l di buffer di transfezione di RT per l’aliquota di 14 µ l di miRNA mimici. Pipettare delicatamente per mescolare: volume finale è 116,6 µ l. Aggiungere 165 µ l del reagente di transfezione diluito dal punto 3.2.5 per il diluito per volta mRNA dal punto 3.2.6. Pipetta per mescolare: volume finale è di 330 µ l. Aggiungere 116,6 µ l del reagente di transfezione diluito dal punto 3.2.5 per il mix di imita miRNA diluito dal punto 3.2.7. Mescolare bene (volume finale è di 233,2 µ l). Incubare per 15 min a RT per permettere al tampone di transfezione di complessi con i mRNAs modificati e miRNA imita. Rimuovere la piastra con le cellule dall’incubatrice basso-O2 . Aggiungere 100 µ l (1 µ g) del complessato per volta mix di transfezione di mRNA in ciascun pozzetto, goccia a goccia attraverso il pozzo. Disperdere i complessi di transfezione di delicatamente ma accuratamente agitando la piastra con un movimento su/giù poi a sinistra/destra. Non agitare la piastra per mescolare. Aggiungere 66,7 µ l (20 pmol) del miRNA complessato imita transfezione mix in ciascun pozzetto, goccia a goccia attraverso il pozzo. Disperdere complessi di transfezione di delicatamente ma accuratamente agitando la piastra con un movimento su/giù poi a sinistra/destra. Non agitare la piastra per mescolare. Inserire l’incubatrice di tri-gas cellule transfected con O2 al 5% (basso-O2). Una volta impostata la piastra verso il basso, disperdere i complessi di transfezione nuovamente delicatamente ma accuratamente agitando la piastra con un movimento su/giù poi a sinistra/destra. Dispensare 4 mL di riprogrammazione medio in una provetta conica da 15 mL e posizionarla nell’incubatrice basso-O2 con tappo allentato per equilibrare durante la notte. Non aggiungere bFGF e B18R fino al giorno seguente. Tubo 1 – RNAiMax diluizione (1 ° mix) Reagente Concentrazione Volume Buffer di transfezione Μ L 279 RNAiMax (aggiungere 2 °) 10 x Μ L 31 Totale: 310 µ l (Incubare 1 min a temperatura ambiente) Tubo 2 – mRNA modificate mescolare (2 ° mix) Reagente Concentrazione Volume modificate mRNA mix 100 ng / µ l (5x) Μ L 33 Buffer di transfezione Μ L 132 Totale: 165 µ l (aggiungere volume uguale di RNAiMax diluito da 1 tubo) Tubo 3 – miRNA imita mescolare (3 ° mix) Reagente Concentrazione Volume miRNA imita mix 5 pmol / µ l (8,33 x) 14 Μ l Buffer di transfezione 102,6 Μ l Totale: 116,6 µ l (aggiungere volume uguale di RNAiMax diluito da 1 tubo) Tabella 1: Preparazione della miscela di transfezione. 4. sostituzione di riprogrammazione di mezzo tra transfezioni (giorni 2, 4, 6, 8, 10 e 12) Sostituire la post-transfezione media 16 – 20 h come descritto in 3.1.1–3.1.2. Aggiungere bFGF ad una concentrazione finale di 100 ng/mL e B18R a una concentrazione finale di 200 ng/mL in riprogrammazione aliquote medie. Monitorare mWasabi espressione ogni giorno per confermare la qualità di transfezione usando un microscopio configurato per visualizzare EGFP.Nota: mWasabi espressione dovrebbe essere minimamente apparente il giorno 2 e aumentare in luminosità con ogni ulteriore transfezione. 5. ogni-altro-giorno transfezioni (giorni 3, 5, 7, 9, 11 e 13) Eseguire la transfezione come descritto al punto 3.2. Non cambiare il mezzo giorni di transfezione. Preparare un’aliquota di 4 mL di riprogrammazione medio e posizionarla nell’incubatrice basso-O2 per equilibrare per il cambiamento medio il giorno seguente. Non aggiungere bFGF e B18R fino al giorno seguente. 6. le procedure da eseguire dopo la trasfezione finale Eseguire variazioni medie giornaliere dal giorno 14 attraverso circa giorno 17. Caldo 7 mL di riprogrammazione medio a 37 ° C. Aggiungere bFGF ad una concentrazione finale di 100 ng/mL.Nota: B18R non è più necessaria dopo la trasfezione finale. Di là di giorno 14, non è più necessario per equilibrare il mezzo durante la notte nell’incubatrice basso-O2 . Rimuovere il mezzo da tutti i pozzetti usando una pipetta sierologica. Continuare a evitare l’uso di aspirazione. Aggiungere 2 mL di riprogrammazione supplementato con bFGF per pozzetto. Nei giorni 17 e 18, analizzare i pozzetti riprogrammati sotto un microscopio invertito o dissezione. Se colonie si formano nella prossimità vicina a vicenda a causa di alta efficienza di riprogrammazione e non possono essere isolati manualmente, è possibile separare le colonie eseguendo un passaggio facoltativo riprogrammate pozzi descritto nel passaggio 7 qui sotto. Se le colonie sono radi e ben separati, selezionare manualmente i cloni direttamente dalla riprogrammate bene come descritto nel passaggio 8 e sottocultura iPSCs secondo protocolli standard. 7. procedura opzionale: Cellule di passaggio da pozzi riprogrammato con EDTA Preparare 0,5 mM EDTA in DPBS (EDTA) diluendo la soluzione di riserva di EDTA 0.5 M. Filtro sterilizzare EDTA utilizzando un sistema di filtrazione sotto vuoto da 0,22 µm. Preparare privo di alimentatore pluripotenti staminali (PSC) supporto (ad esempio, mTeSR1) secondo le istruzioni del produttore. Pre-riscaldare 32 mL di terreno PSC a 37 ° C. Ricoprire tutti i pozzetti di due piastre di formato 6-pozzetti con hESC-qualificati di matrice extracellulare (ECM) seguendo le istruzioni del produttore. Piastre con film di paraffina ed li Incubare per 1 h a TA. Aspirare la soluzione di ECM dalle piastre pre-riscaldate e sostituirlo con 2 mL di terreno PSC per pozzetto. Non lasciare la superficie dei pozzetti per asciugare. Metterle da parte. Aspirare la riprogrammazione medio da 2 pozzi riprogrammate in un giorno quando le colonie sono grandi e ben formate (solitamente giorno 18). Sciacquare una volta con 1 mL di EDTA e aspirato. Aggiungere 1 mL di EDTA per pozzetto. Incubare per 4 min a 37 ° C. Delicatamente rimuovere la piastra dall’incubatrice e inserirlo nella biosicurezza armadietto.Nota: A questo punto, le cellule possono essere molto liberamente aderito e si spostano facilmente. Aspirare accuratamente EDTA da entrambi i pozzetti. Aggiungere 3 mL di terreno PSC pre-riscaldato a ogni ben curati con EDTA. Utilizzare un cellulare-raschietto per delicatamente ma accuratamente sloggiare le cellule da entrambi i pozzetti. Utilizzare una pipetta sierologica dispensare la sospensione cellulare e spezzare grandi ciuffi delicatamente. Non pipettare fino a quando tutti i grumi di cellule sono andati. Preservare i cluster iPSC.Nota: Grandi ciuffi di placcatura non influenzerà la conseguenza Colonia iPSC. Se ci sono grumi eccessivamente grande cellula, semplicemente evitare di trasferirli nel piatto successivo. Utilizzando una pipetta sierologica, distribuire uniformemente le celle da ogni pozzetto EDTA-trattati di pipettaggio 0,5 mL in ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti rivestite con ECM.Nota: Non si combinano le cellule dai pozzetti riprogrammate (cioè, riprogrammato ben 1 deve essere uniformemente distribuita nella prima piastra 6 pozzetti e riprogrammate bene 2 dovrebbe essere uniformemente distribuite nella seconda piastra 6 pozzetti). Riportare le cellule placcate in incubatrice basso-O2 . Per distribuire uniformemente le cellule, agitare ogni piastra avanti e indietro e di lato a lato. Non agitare. Sostituire il mezzo PSC al giorno. 8. prelievo iPSC colonie Pre-riscaldare 15 mL di terreno PSC a 37 ° C. Cappotto tutti i pozzetti di una piastra singola di 6 pozzetti con ECM hESC-qualificato seguendo le istruzioni del produttore. Sigillare le piastre con la pellicola di paraffina e li Incubare per 1 h a TA. Aspirare il terreno di coltura da pozzi utilizzati per raccogliere iPSCs. Sciacquare una volta con 1 mL di EDTA e aspirato. Aggiungere 1 mL di EDTA per pozzetto. Incubare per 4 min a 37° C. Mentre sono incubando le cellule, aspirare la soluzione di ECM dalle piastre pre-riscaldate e sostituire con 2 mL di terreno PSC per pozzetto. Mettere da parte le piastre. Rimuovere delicatamente la piastra con iPSCs per essere raccolti dall’incubatrice e posizionarlo nella biosicurezza armadietto.Nota: A questo punto, le cellule possono essere molto liberamente aderito e si spostano facilmente. Aspirare accuratamente EDTA. Molto delicatamente aggiungere 3 mL di terreno PSC pre-riscaldato, facendo attenzione a non per staccare iPSC colonie. Spostare la piastra di un ambito di dissezione o invertito per meglio visualizzare colonie. Preparare una pipetta da 1 mL con punta sterile. Premere lo stantuffo completamente, quindi utilizzare la punta della pipetta per raschiare delicatamente una colonia mentre si disegna lentamente il liquido nella punta a raccogliere la Colonia. Disegnare come mezzo piccolo come possibile mentre raccogliendo la colonia di iPSC. Per trasferire la Colonia, pipettare su e giù 3 – 4 volte in un singolo pozzo della piastra rivestita con ECM dal punto 8.2. Ripetere fino a 6 colonie sono stati raccolti e trasferiti nei singoli pozzetti. Scegliere non più di 2 colonie ogni singolo pozzo se un passaggio opzionale descritto nel passaggio 7 è stata eseguita. Utilizzare un protocollo standard sulle cellule staminali umane per congelare giù tutti i restanti pozzetti. Scongelare e ri-piastra gli stock congelati se altre colonie devono essere raccolte più tardi. 9. caratterizzazione delle iPSCs Eseguire TRA-1-60 di colorazione per l’analisi della riprogrammazione efficienza (giorno 18).Nota: 2 su 3 riprogrammato pozzi sono attraversate per picking futura colonia. Bene il rimanente può essere utilizzato per la colorazione del TRA-1-60. Questa procedura può essere eseguita sulla parte superiore del banco di laboratorio. Lavare il riprogrammate bene con 1 mL di PBS. Fissare le cellule con metanolo ghiacciato a-20 ° C per 5 min. Aspirare il metanolo. Secco il pozzo per circa 2 min. fare attenzione a non asciugare troppo. Le cellule sono asciugati abbastanza quando diventano un colore traslucido/opaco. Lavare il ben 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti con agitazione delicata. Durante i lavaggi, preparare 3 mL di perossido di idrogeno 3% in PBS. Aspirare il PBS. Aggiungere 2 mL di soluzione diluita di perossido. Incubare per 15 min a RT con agitazione delicata. Preparare 4 mL di soluzione bloccante: 10% albumina di siero bovino (BSA) in PBS. Aspirare la soluzione di perossido. Lavare le ben 2 volte con 1 mL di PBS per 5 min. Aspirare la PBS e aggiungere 2 mL di soluzione di blocco nel pozzo. Incubare per 1 h a RT. Lavare il ben 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti con agitazione delicata. Diluire l’anticorpo primario anti-TRA-1-60 a 1: 100 in soluzione bloccante completata con sodio azide 0.05%. Preparare 1 mL della diluizione di anticorpo per 1 bene di un piatto formato da 6 pozzetti. Aggiungere la diluizione dell’anticorpo e avvolgere la piastra con parafilm per evitare l’evaporazione. Incubare per una notte a 4 ° C con agitazione delicata.Nota: Se necessario, l’incubazione con anticorpo primario può essere fatto per 1h a RT con agitazione delicata. La diluizione di anticorpo primario può essere riutilizzata fino a 5 volte. Dopo incubazione con anticorpo primario, lavare il ben 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti con agitazione delicata. Diluire l’anticorpo secondario di HRP-coniugato anti-topo a 1: 200 in soluzione bloccante. Incubare il pozzo con la diluizione di anticorpo secondario per 2 h a temperatura ambiente con agitazione delicata. La diluizione di anticorpo secondario di aspirare e lavare i ben 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti con agitazione delicata. Durante il terzo lavaggio, preparare la soluzione di substrato seguendo le istruzioni del fabbricante. Dopo il lavaggio finale, aspirare PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione substrato e incubare fino a quando il colore desiderato si sviluppa (circa 10 min). Aspirare la soluzione di substrato. Sciacquare bene con acqua per 5 minuti agitando delicatamente. Contare le colonie, se lo si desidera. Riprogrammazione di efficienza = (numero di colonie) / (numero dei fibroblasti placcati) x 100%. Per l’archiviazione a lungo termine, aspirare acqua dalla piastra macchiata e asciugare durante la notte sulla RT. tenuta la piastra secca con parafilm e conservare a 4 ° C fino a 2 anni valutare l’efficienza riprogramma più tardi.