Un sistema di BW Reporter per lo studio di interazioni recettore-ligando

1. generazione di un plasmide che esprime il costruire chimerico Nota: L’obiettivo è di generare un plasmide che esprime il dominio extracellulare del recettore di interesse fusa per i domini transmembrana e intracellulari del mouse CD3ζ catena (Figura 2A). Recuperare la sequenza del dominio extracellulare del recettore di interesse, tra cui il peptide di segnale. Ottenere materiale di DNA che dovrebbe esprimere questo recettore (ad es., cDNA o un plasmide). Ottenere materiale di DNA che esprime la transmembrana e i domini intracellulari del mouse CD3ζ catena (ad es., cDNA o un plasmide). Progettare la sequenza della proteina di fusione basata sulla struttura generica illustrata nella Figura 2A. Assicurarsi che l’intera sequenza è all’interno della cornice di lettura del codone stesso. Questa sequenza viene utilizzata per disegnare primers appropriato e verificare il prodotto finale. Progettare due reazioni di PCR per amplificare ciascuno dei frammenti di proteine di fusione separatamente (Figura 2B, 2C)10.Nota: Le condizioni specifiche per le reazioni di PCR (ad es., allungamento tempo e temperatura di annealing) dipendono dalla natura degli iniettori, che sono progettati per uno specifico recettore. Amplificare il segmento extracellulare del recettore. Progettare un primer 5′ che include parte del peptide segnale del recettore, una sequenza di consenso di Kozak e un sito di restrizione appropriato (Figura 2B). Progettare un primer 3′ che fiancheggia entrambe le parti della proteina di fusione (Figura 2B). Ad esempio, per la progettazione iniziale questo primer 3′ possa includere le ultime 20 coppie di basi del segmento extracellulare del recettore e le prime 9 coppie di basi del segmento CD3ζ.Nota: È necessario aggiungere un sito di restrizione per il primer 3′ poiché questo primer verrà utilizzato per generare la sequenza di fusa e non viene utilizzato per la legatura. Amplificare il segmento CD3ζ. Progettare un primer 5′ che fiancheggia entrambe le parti della proteina di fusione (Figura 2). Ad esempio, per la progettazione iniziale il primer 5′ può includere le ultime 9 coppie di basi del segmento extracellulare del recettore e le prime 20 coppie di basi del segmento CD3ζ.Nota: È necessario aggiungere un sito di restrizione per il primer 5′ poiché questo primer verrà utilizzato per generare la sequenza di fusa e non viene utilizzato per la legatura. Progettare un primer 3′ che comprende la fine della sequenza di CD3ζ così come un sito di restrizione appropriato (Figura 2). Correggere le sequenze dell’iniettore in ciascuna di queste due reazioni in modo che la temperatura di annealing è simile in ogni coppia (si noti che il primer, che comprende sequenze delle due parti della proteina di fusione, si accoppia solo con parte della sequenza in ogni reazione). Eseguire un ulteriore PCR in cui viene utilizzata una miscela dei prodotti di PCR delle prime due reazioni come il modello di DNA con il primer 5′ del segmento extracellulare del recettore (punto 1.4.1.1) e 3′ del segmento CD3ζ (punto 1.4.2.2) (Figura 2D)10 . Questa reazione deve generare la sequenza finale di fusa. Procedere come al solito per la clonazione. Legare il prodotto PCR finale alla destinazione taglio vettoriale (il vettore di destinazione è di solito pcDNA3 che esprime la resistenza G418 e ampicillina). Trasformare il vettore dei batteri competenti11. Scongelare i 50 µ l di batteri competenti sul ghiaccio. Aggiungere il vettore legato ai batteri e incubare in ghiaccio per 20 min. Incubare a 42 ° C per 45 s. Aggiungere 200 µ l di LB senza antibiotici. Incubare per 1h a 37 ° C con agitazione continua. Seme su una piastra LB con gli antibiotici adatti (ad es., ampicillina soluzione con una concentrazione finale di 0,1 mg/mL). Raccogliere e coltivare diverse colonie batteriche in 5 mL di LB (in provette da 15 mL). Il giorno successivo, estrarre plasmidi con un mini kit di preparazione. Analizzare l’inserto di gene con enzimi di restrizione. Sequenza le relative colonie e verificare che la sequenza e la struttura di lettura siano corrette (come indicato al punto 1.3). Trasformare il plasmide verificato in batteri competenti11. Scongelare i 20 µ l di batteri competenti sul ghiaccio. Aggiungere 1 µ l del plasmide ai batteri e incubare in ghiaccio per 20 min. Incubare a 42 ° C per 45 s. Aggiungere 200 µ l di LB senza antibiotici. Incubare per 1h a 37 ° C con agitazione continua. Seme su una piastra di crescita batterica con gli antibiotici adatti (ad es., ampicillina soluzione con una concentrazione finale di 0,1 mg/mL). Il giorno successivo, crescere una colonia batterica in un grande contenitore LB con ampicillina 0,1 mg/mL (~ 250 mL). Il giorno successivo, eseguire maxi prep secondo le istruzioni specifiche fornite dal kit.Nota: Per la procedura di elettroporazione, una grande quantità di plasmide è necessaria, come dettagliato di seguito. 2. transfezione del plasmide che esprime la proteina chimerica nelle cellule di BW Nota: Diversi metodi possono essere impiegati anche per la transfezione (ad es., da infezione lentivirale). Prima l’elettroporazione, eseguire precipitazione dell’etanolo del DNA come descritto di seguito. I prossimi passi richiedono condizioni di sterilità. Il giorno prima, preparare la BW5147 cellule (“BW”) per l’elettroporazione. Piastra 10 piastre (di 10 cm) con 10 mL di 100.000 BW5147 cellule/mL (cioè, un totale di 10 x 106 cellule) con RPMI completato con 10% siero fetale del vitello (FCS), piruvato di sodio 1%, 1% L-Glutammina, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% penicillina-streptomicina (“medium completo”). Mettere 100 µ g del plasmide pcDNA3 che esprime la proteina di fusione in un tubo da 1,5-2 mL e aggiungere 3 M sodio acetato a pH 5.3-5.5 ad esso. Il volume dell’acetato di sodio dovrebbe corrispondere a 0,1 (10%) del volume di 100 µ g plasmide; titolare il pH dell’acetato di sodio con un pH-metro con l’aggiunta di NaOH o HCl. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 100% alla miscela del plasmide e l’acetato di sodio, come descritto in passaggio 2.2 (2,5 volte il volume totale del plasmide e sodio acetato). Incubare per una notte a-20 ° C o per 2 ore a 70 ° C. 2.4. 24h dopo le cellule di BW sono state placcate, raccogliere tutte le celle di BW (~ 100 mL) in provette 2 50 mL. Centrifugare le cellule per 5 min a 515 x g e scartare il surnatante. Risospendere il pellet da entrambi i tubi in 25 mL di RPMI – in una provetta singola 50 mL. Ad esempio, risospendere il pellet di uno tubo con 25 mL di RPMI – e quindi utilizzare questo fluido per risospendere il fluido nell’altro tubo 50 mL affinché il pellet totale dalle cellule BW è nuovamente sospeso in 25 mL di terreno in un singolo tubo.Nota: Il mezzo dovrebbe essere senza aggiunte, dato che il siero potrebbe interferire con l’elettroporazione. Centrifugare le cellule ancora per 5 min a 515 x g. Risospendere il pellet in 1 mL di RPMI e trasferire il contenuto in una cuvetta di 0,4 cm sul ghiaccio. Centrifugare il plasmide che ha subito la precipitazione dell’etanolo (punto 2.3) per 30 min a 16.000 x g e a 4 ° C. Lavare una volta con 1 mL di etanolo al 70% e centrifugare per un altro 20 min a 16.000 x g e a 4 ° C (per lavare fuori il sale). Rimuovere tutto l’etanolo e asciugare leggermente il pellet (cioè, in un tubo aperto nella coltura del tessuto cappa). Risospendere il pellet con 100 µ l di RPMI-precedentemente riscaldata a 60 ° C. Aggiungere il plasmide ri-sospensione (passo 2.8) per le cellule in provetta e incubare per 5 minuti sul ghiaccio. Electroporate le cellule alle 0.23 kV, 250 capacitazione. Questo dovrebbe prendere ~ 4 ms. Trasferire le cellule elettroporate a un tubo da 50 mL, aggiungere 50 mL di terreno completo e centrifugare per 5 min a 515 x g. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule con 50 mL di terreno completo. Piastra le cellule elettroporate in piastre di coltura 24 pozzetti (1 mL / Beh, per un totale di ~ 50 pozzi) e incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 48 h. Selezionare le celle transfected con antibiotici. Dopo 48 h aggiungere 1 mL di completa supplementato con 10 mg/mL G418 in ogni pozzetto (in questa fase il volume finale in ciascuna è ben 2 mL e la concentrazione finale di G418 in ogni bene è 5 mg/mL).Nota: Se il plasmide contiene una diversa resistenza antibiotica, determinare la concentrazione di antibiotico necessaria per uccidere le cellule untransfected BW prima di questo passaggio. Ogni 48 h, scartare con attenzione 1 mL del volume superiore di ciascun pozzetto senza mescolare il mezzo nel pozzo (le cellule di BW tendono ad essere nella parte inferiore del pozzo). Aggiungere completa supplementato con 5 mg/mL G418 in ciascun pozzetto, in modo che il volume finale in ciascun pozzetto è ancora 2 mL. Esaminare regolarmente le piastre di coltura per la crescita delle cellule in tutti i pozzetti.Nota: Un cambiamento nel colore del mezzo al giallo può contribuire ad identificare le cellule in crescita; Tuttavia, all’inizio il mezzo sarà giallo a causa il G418 stessa. Identificare i pozzetti positivi (pozzi con la crescita delle cellule). Questi pozzi sono G418 resistente e pertanto sono tenuti a esprimere la proteina di fusione. Questo processo richiede in genere circa 3 settimane. 3. Verifica dell’espressione del recettore trasfettato in cellule nei pozzetti positivi. Macchia le celle transfected BW con un anticorpo specifico contro il recettore che era trasfettato. Confrontare il livello di espressione del recettore tramite flusso cytometry per l’espressione delle cellule di controllo (cellule untransfected BW). Dopo la verifica di uno o più pozzetti, utilizzare immediatamente le cellule per scopi sperimentali, crescere in coltura o congelare per future applicazioni. Verificare l’espressione del recettore trasfettato prima di eseguire un nuovo esperimento. Dopo alcune settimane di crescita, le cellule con G418 con espressione del recettore stabile, G418 può essere omesso dal terreno di coltura. 4. incubazione delle cellule trasfettate BW con target Nota: Quando si utilizza cellule transfected BW per la prima volta, è preferibile di testarli su bersagli che esprimono un noto ligando del recettore di interesse o su piastra associato anticorpi specificamente diretti contro il recettore di interesse (cross-linking esperimenti; Vedi sotto, sezione 4.2.1.3). Preferibilmente, dividere le celle di BW 24 h prima dell’esperimento (ad esempio, con l’aggiunta di 10 mL di terreno completo a 2 mL di cellule in coltura in una nuova piastra di coltura di 10 cm). Incubare le cellule transfected BW con i loro obiettivi. Eseguire contemporaneamente l’esperimento sulle cellule di controllo BW che esprimono un vettore vuoto (o cellule parentali di BW). 96F piastre sono preferibili (ma utilizzabile anche 96U piastre). Eseguire l’esperimento in triplice copia. Sospendere tutte le celle nel medium completo. Preparare i bersagli. Il tipo di destinazione varia in funzione dell’obiettivo e può essere cellule, cellule che sono state pre-incubate con anticorpi, o anticorpi da solo. Questo sistema è stato utilizzato anche con i batteri come obiettivi5. Se gli obiettivi sono divisione delle cellule (cioè, linee cellulari), li irradiare alle 6.000 rad prima del dosaggio. Posto 50.000 delle cellule bersaglio in un singolo pozzo di una piastra 96 (in un volume di 100 µ l). Per esperimenti con anticorpi e cellule di BW che esprimono umano FcγRs, incubare le cellule bersaglio con un anticorpo sul ghiaccio in un piatto ben 96 (ad esempio, 50 µ l di cellule bersaglio e 50 µ l di anticorpo; le dosi differenti dell’anticorpo possono essere testate). Se usando gli anticorpi da soli come bersagli (esperimenti di cross-linking), dovrebbero essere associati a piastra. A tale scopo, prima di Incubare gli anticorpi in un mezzo completo in un piatto di 96F per 1-2 h a 37 ° C e 5% CO2 (una tipica dose iniziale è di 0,5 μg di un anticorpo specifico in 50 µ l). Lavare la piastra per rimuovere gli anticorpi non legati.Nota: In questo caso, un piatto di 96F consentirà legame dell’anticorpo alla piastra, che dopo l’aggiunta di cellule transfected BW porterà alla attivazione del recettore trasfettato. Aggiungere le cellule BW (cellule effettrici). Cellule di luogo 50.000 BW in un singolo pozzo di una piastra 96 (in un volume di 100 µ l). Completano il volume in ogni pozzetto a 200 µ l se necessario. Incubare le piastre a 37 ° C e 5% di CO2 per 48 h (questo periodo di tempo può essere calibrato). Dopo 48 h, congelare le piastre a-20 ° C e disgelo prima ELISA, o utilizzare immediatamente per ELISA (vedere passaggi successivi). 5. ELISA Cappotto una piastra ELISA con un anticorpo anti-IL-2 (anti-mIL-2). Inserire 0,05 µ g di anti-mIL-2 in un volume di 50 µ l di PBS 1X per pozzetto. Incubare la piastra ELISA rivestita con l’anticorpo anti-mIL-2 a 4 ° C durante la notte o a 37 ° C per 2 h.Nota: Per eseguire ELISA direttamente dopo la fase di incubazione, piastra ELISA dovrebbe essere ricoperto 24h prima della fine del periodo d’incubazione delle cellule BW. Scartare il liquido nella piastra ELISA e aggiungere una soluzione bloccante (200 µ l per pozzetto), che si compone di 1X PBS e 1% albumina di siero bovino (BSA). Incubare la piastra ELISA per 2 h a temperatura ambiente. Lavare la piastra ELISA tre volte con PBS Tween soluzione allo 0,05% (cioè, 0,5 mL di Tween-20 in 1 litro di PBS 1X). Prendere la piastra 96 che ha le cellule di BW che sono state incubate con i loro obiettivi (4.3). Se la piastra è stata congelata, scongelare completamente (ad es., di breve incubazione a 37 ° C). Centrifugare la piastra 96 (5 min, 515 x g) e attentamente trasferire 100 µ l del surnatante in ciascun pozzetto alla piastra ELISA prepatinata e bloccata.Nota: Il surnatante dovrebbe essere raccolti dai lati di ciascun pozzetto per evitare di prendere le cellule. Se lo si desidera, è possibile aggiungere ricombinante mIL-2 con concentrazioni definite in una delle righe vuote della piastra ELISA rivestita per generare una curva standard di mIL-2. Ad esempio, a partire da una concentrazione di 2 mIL di 2.500 pg/mL e quindi diminuire del 50% in tutti i pozzetti successivi; non aggiungere mIL-2 all’ultimo bene. Incubare la piastra ELISA a 4 ° C durante la notte o a 37 ° C per 2 h. Lavare la piastra ELISA quattro volte con PBS Tween. Aggiungere biotina anti-topo IL-2 piastra ELISA. Utilizzare una concentrazione di 1 µ g anticorpo in 1 mL di PBS 1x con BSA 1% e si dividono in 100 µ l per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 1 h. Lavare la piastra ELISA sei volte con PBS Tween. Aggiungere HRP coniugato streptavidina. Utilizzare una concentrazione di 1 µ l streptavidina in 1 mL di PBSX1 con BSA 1% e dividerlo in 100 µ l per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 30 min. Lavare la piastra ELISA sei volte con PBS Tween. Aggiungere 100 µ l di soluzione TMB. Completare questa fase rapidamente per ridurre al minimo le differenze tra i pozzetti a causa di ritardi quando si aggiunge il TMB. Leggere la piastra ELISA con un lettore di piastra ELISA a 650 nm (la lettura può essere ripetuta se il segnale è debole).