JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Репродуктивные методы мониторинга и контроля яичников у амфибий

Published: May 12, 2019
doi:
10.3791/58675
, , , ,
1Reproductive Sciences,San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 2Recovery Ecology,San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 3Menagerie du Jardin des Plantes,Museum National d’Histoire Naturelle, 4Cincinnati Zoo & Botanical Garden,Center for Conservation and Research of Endangered Wildlife

Summary

Изучение биологии амфибий дает ценную информацию о репродуктивных, физиологических, эмбриологических и развития процессах, которые управляют организмами многих таксономических групп. Здесь мы представляем всеобъемлющее руководство по различным методологиям, которые могут быть использованы для изучения контроля яичников и мониторинга в земноводных.

Abstract

Контроль яичников и мониторинг у земноводных требуют многогранного подхода. Есть несколько приложений, которые могут успешно вызвать репродуктивное поведение и приобретение гамет и эмбрионов для физиологических или молекулярных исследований. Амфибии вносят свой вклад в одну четверть до одной трети исследований позвоночных, и интерес в этом контексте представляет их вклад в знания научного сообщества о репродуктивных процессах и эмбриональном развитии. Тем не менее, большая часть этих знаний происходит от небольшого числа видов. В последнее время уничтожение земноводных по всему миру потребовало все более широкого вмешательства со стороны защитников природы. Колонии восстановления и обеспечения в неволе, которые продолжают появляться в ответ на риск исчезновения, делают существующие исследования и клинические приложения бесценными для выживания и воспроизводства земноводных, нахаемых под присмотром человека. Успех любой популяции в неволе основан на ее здоровье и воспроизводстве и способности развивать жизнеспособное потомство, которое переносит наиболее разнообразное генетическое представление их видов. Поэтому для исследователей и ветеринаров способность контролировать и контролировать развитие и здоровье яичников является императивом. Основное внимание в этой статье, чтобы выделить различные вспомогательные репродуктивные методы, которые могут быть использованы для мониторинга и, где это уместно или необходимо, контроль яичников функции в земноводных. В идеале, любые вопросы репродуктивного здоровья должны быть сокращены за счет надлежащего неволе, но, как и с любым животным, вопросы здоровья и репродуктивной патологии неизбежны. Неинвазивные методы включают поведенческие оценки, визуальный осмотр и пальпацию и морфометрические измерения для расчета показателей состояния тела и ультразвука. Инвазивные методы включают гормональные инъекции, анализ крови и хирургическое вмешательство. Контроль яичников может осуществляться несколькими способами в зависимости от требуемого применения и видов, представляющих интерес.

Introduction

Амфибии уже давно признаны в качестве важных биологических и медицинских моделей по широкому кругу научно-исследовательских дисциплин. Данные, полученные путем изучения конкретных видов, таких как Xenopus laevis и X. tropicalis, леопардовая лягушка (Ранее Рана) pipiens) и аксолотл (Ambystoma mexicanum) были применены к ряда других видов позвоночных, включая людей. Ветеринарные, животноводства и вспомогательные репродуктивные методы, возникшие в результате изучения этих и других земноводных, оказывают помощь тем, кому поручено успешное лечение, содержание и устойчивость более редких популяций в неволе 1 , 2 , 3 , 4.

Интерес приобретает для одновременного использования в и ex situ сохранения на основе подходов, чтобы обратить вспять волну вымирания для многих в опасности амфибий видов1,2. В этой статье представлены методологии, доступные в настоящее время для мониторинга и контроля функции яичников-амфибий в модельных видах ануран и каудат. Кроме того, представлены существующие методы для решения общей репродуктивной патологии удержания яйцеклеток.

Как и во многих таксономических группах, контроль яичников-амфибий включает в себя ряд тесно синхронизированных взаимодействий между окружающей средой и физиологией. Температура и фотопериод (известный как неподанные сигналы) расшифровываются глазом и мозгом, где они быстро преобразуются в генетические, гормональные и циркадные процессы (конечные сигналы)3,4. Методы мониторинга и контроля функции яичников, охватываемые в этой статье включают инвазивные и неинвазивные методы. Институциональные уход за животными и использования комитета (IACUC) научно-исследовательских и учебных требований определить неинвазивные методы, как те, которые вызовут минимальные без каких-либо физической боли или психического расстройства и не требуют обезболивающих препаратов5. Здесь неинвазивные методы включают визуальный осмотр и пальпацию, поведенческие наблюдения, морфометрические оценки и УЗИ. Напротив, методы сбора крови, гормонального введения и хирургии (овариэктомия и удаление сохраненных яйцеклеток) классифицируются как инвазивные, поскольку они могут привести к некоторой боли или дискомфорту и требуют анестезии или пост-процедурной медикаментозной терапии.

Неинвазивные методы мониторинга яичников могут быть легко включены в повседневную процедуру ухода для большинства пленных земноводных. В зависимости от вида, гравидность яичников часто может быть определена простым визуальным осмотром (стеклянная лягушка). В других случаях, пальпация может указывать, является ли самка gravid. Различные показатели состояния тела (BCI), такие как вес, морда urostyle длина (SUL), морда-вентиляционные длины (SVL) и стандартный индекс массы (SMI) доступны для прогнозирования наличия или отсутствия яиц4,6,7, 8,9. Тем не менее, следует принимать меры с интерпретацией результатов, поскольку большинство из них не учитывают возраст, форму тела или состав (например, вода сохраняется по сравнению с массой яичников или жира)6. Окончательные репродуктивные диагнозы могут быть достигнуты с помощью ультразвука с более глубокими знаниями, полученными в отношении развития яйцеклеток и постановки яичников цикла4,7. Ультразвук также предоставляет средства для подтверждения и мониторинга репродуктивных патологий и связанных с ними физиологических условий4,8.

В дополнение к предоставлению информации о состоянии здоровья, анализ крови может быть использован для измерения репродуктивных гормонов. Если гормон профилирования является конечной целью, важно, чтобы избежать стресса, связанных с влияниями, которые могут свести с ума системные данные стероидов. В то время как потенциально мощный инструмент мониторинга, есть еще предстоит исследование, демонстрирующее врожденные эндокринологические ответы на экзогенные гормоны администрации в любой амфибии видов. Кровь можно безопасно взять с нескольких участков; у лягушек это включает в себя вентральную брюшную вену, лингвистовое сплетение, бедренную вену и сердце9,10. В Каудатах кровь собирается из венальной хвостовой вены. Степень инвазивности, количество удерживающих требуется, необходимость анестезии, деликатность органа мишенью, и размер животного являются факторами, которые должны быть рассмотрены при выборе метода сбора для амфибии пациента. В этой статье будет представлена техника сбора крови из лицевой верхнечелюстной или мускуластной вены лягушек, как первоначально описано Forzan et al.9.

Контроль яичников специфичен для видов и, как таковой, гормональные протоколы должны быть проверены и оптимизированы. Помимо сезонности и связанных циркулирующих гормонов среды, контроль яичников также может быть тесно связана с возрастом, время, проведенное в неволе и воздействие повторных гормональных администраций, для которых мало информации в литературе11 , 12 Лет , 13. Внедрение гормональной терапии для выяснения репродуктивного поведения, производства гамет, созревания и овисты стало широко известный подход к решению общих репродуктивных проблем, связанных с неволем4, 8,14,15,16. Поскольку механизмы контроля воспроизводства позвоночных сильно сохраняются, существует ряд гормонов, нейропептидов и коммерчески доступных препаратов, используемых терапевтически в других таксономических группах, которые также могут быть надежно использованы в ряде видов амфибий(таблица 1). Гонадотропин высвобождая гормон (GnRH) и человека хорионический гонадотропин (ХГЧ) (или вариации из них, т.е., PMSG и ЭКГ)17,18, либо индивидуально или в комбинации, были широко использованы в амфибии в неволе программы разведения в том числе: южной Скалистых горах бореальной(Anaxyrus boreas)4,19,20; жаба, Dusky Gopher лягушки, Рана севоза (Langhorne и др., неопубликованные)7; побережье Мексиканского залива Уотердог, Нектурус Бейери20; Вайоминг жаба, Anaxyrus baxteri18; бык, Рана catesbiana21; американская жада, Anaxyrus americanus22; трава лягушки, Lymnodyaster tasmaniensis23; Coqui, Eleutherodactactylus coqui24; Ксенопус, Ксенопус лаевис25; жабо Гюнтера, Pseduophryne guentheri26; Северная лягушка леопарда, Lithobates pipiens; аргентинский рогатый лягушка, Ceratophrys богато; рогатая лягушка Крэнуэлла, C. cranwelli; американская земляная лягушка, Odontophrynus americanus27; и пожарная саламандра (Саламандра )228. Стероидные гормоны, как прогестерон (P4), реже сообщается, но продемонстрировали хорошую эффективность в вызвавов овуляции и овипозиции у некоторых видов ануран16,18,29. Простагландин (особенно Простагландин 2-альфа (PGF2 )участвуют в овуляции вместе с кортикостероидами30,31,32,34 и достичь высокого уровня во время овуляторная фаза31.

В исследованиях in vitro, PGF2 “является мощным индуктором овуляции31, в то время как in vivo это может вызвать овиспозицию сохраненных яиц в Rana muscosa4,30,32. Гипофизэкстракты экстракты также эффективны индукторов овуляции15,16,34; однако, проблемы, связанные с биобезопасностью и потенциалом для передачи болезни, часто являются сдерживающим фактором для колоний размножения в неволе при рассмотрении этого подхода35.

В последнем разделе этой статьи подробно описаны хирургические процедуры и предусмотрены альтернативные подходы к расширению исследований яичников или помощи с разрешением репродуктивных патологий. Обариэктомии чаще всего выполняются в амфибии для получения яйцеклеток для эмбриональных исследований. Тем не менее, он также может обеспечить средство для сохраненных яиц, когда другие варианты неудачу. Хотя эта процедура является инвазивной, требуя полной анестезии и разрезов, чтобы разоблачить яйцеклетки массы, она не требует эвтаназии. Кроме того, после частичной овариэктомии, животные могут сделать полное выздоровление и продолжать быть репродуктивно активной после операции8,36.

В описанных ниже протоколах излагаются инвазивные и неинвазивные методы контроля и мониторинга яичников в Ануранах и Каудатах. Конкретные виды, выбранные для иллюстрации методов в Anurans включают R. слизистой оболочки и X. laevis. Necturus maculosus, N. beyeri, N. alabamensis, и A. mexicanum составляют виды, используемые для аналогичного описания методов в Каудатах.

Protocol

Процедуры Саламандры были одобрены Цинциннати зоопарк и ботанический сад (КЗБГ) Институциональный уход и использование комитета (IACUC) протоколы 11-106, 13-110, 14-133, и 15-138. Все процедуры лягушки и жабы были одобрены Сан-Диего зоопарк Глобальный (SD’G), институционального ухода и использования комитета (IACUC) протоколы: 15-001, 16-005 и 18-003. Уход и обращение с животными был одобрен Этическим комитетом Национального музея естественной истории (Париж) (Национальный музей истории Природы-Меньевери дю Джардин де Плантс (MNHN)), в соответствии с институциональными и национальными руководящими принципами (Комиссия де Гюни Гюнетик, Направление Департементал де Услуги Ветеринеры, Директива Европейского союза 2010/63/ЕС, решение о соглашении No. C75-05-01-2 для Европейской конвенции для позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Все протоколы, использованные в данном исследовании, были утверждены под номером 68-037. 1. Неинвазивные методы мониторинга яичников Визуальный осмотр и пальпация Держите самку Ануран в одном из трех способов, описанных ниже. Закрепите лягушку или жабы ноги с кольцом и мизинцем, поддерживая сторону доза (брюшной полости) тела лягушки с указательным и средним пальцем и брюшной стороны с большим пальцем (Рисунок 1A). Держите лягушку или жаду в доминирующей руке с большим пальцем на животе, а остальные пальцы обеспечения задней части животного. Использование недоминирующей стороны, чтобы пальпировать живот животного, чувствовать, если есть субдермальная неровность(рисунок 1B). Отдых лягушки или живота жабы на ладони, передние руки драпированные над указательным пальцем и большой палец на верхней части спины. Поскольку Каудеты полностью водные по своему характеру, выполнять визуальный осмотр одним из двух методов, описанных ниже. Переместите животное в отдельный контейнер 4 L, содержащий воду из резервуара. Держите контейнер (крышка защищены) и блеск фонарик на нижней, чтобы визуализировать наличие / отсутствие яиц. Анестезия в MS222 (0,5 г/л; Трикатиновый метанесульфонат, буферизированный с 0,5 М NaHCO3). После индукции поверните животное на спину и осмотрите живот. Морфометрические оценки АнураныПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия не требуется. Использование калиперов, измерить животное от кончика рта, вдоль центра тела к кончику хвоста, чтобы получить SUL и SVL(Рисунок 2A, B). Таре пластиковый контейнер в цифровом масштабе точности. Поместите животное в tared контейнер и весят(рисунок 2C). Для более крупных животных, таких как быки, или при получении веса в поле, используйте висячие масштабы(рисунок 2D). Как и во многих видах ануран, отличить R. muscosa взрослых самок от мужчин по их большему размеру и отсутствие брачных (большой палец) колодки на руках (Рисунок 3). Рассчитайте состояние тела, как базовую оценку общего состояния здоровья по следующей формуле:Индекс Фултона: K и масса длина3ПРИМЕЧАНИЕ: Fulton’s Index использует мерный баланс объема, связанный с массой и длиной, где 3 является масштабирование экспонента, который относится масса и длина изометрически. Каудат Tare масштаба с пустой мешок, прежде чем поместить не анестезируется животное внутри. Позаботьтесь, чтобы не вводить избыток воды(Рисунок 2D) и действовать быстро, как животные выделяют слизь в качестве реакции на стресс на время сдержан. Получить взрослых мер путем обездвиживания лиц в прямом положении в нижней части повторно герметичной полиэтиленовый пакет или в отдельном пластиковом контейнере, который может вместить расширенные calipers. Измерьте длину тела с помощью калиперов(рисунок 2E). Измерьте каудат от кончика моники до кончика хвоста (SVL) для мониторинга роста. Поведенческие наблюдения Физически наблюдать за животными в режиме реального времени или использовать видеокамеру для записи поведения. Запись наблюдений животных классифицировать поведения и построить этаграмму(Рисунок 4). Классификация репродуктивного поведенияПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 4 иллюстрирует один тип репродуктивного поведения наблюдается у ануранов. УльтразвукПРИМЕЧАНИЕ: Ультразвуковой преобразователь выбора, в данном случае, 7,5 МГц линейный или многочастотный (10-6 МГц) микро-выпуклость, рекомендуется для Нектура и 10 МГц зонд и водорастворимый, без соли гель для R. muscosa. Проведение УЛЬТРАЗвука на саламандры может потребовать анестезии (см. раздел 1.5 для инструкций). Анураны Выполните УЗИ на R. muscosa с использованием двух человек(рисунок 5A). От первого лица: Держите животное доминирующей рукой и нанесите растворимый водорастворимый гель на брюшную полость животного. Второй человек (ультра-сонограф): Возьмите зонд 10 МГц в доминирующей руке и применить его к животу убедившись, чтобы сделать хороший контакт между зондом и гель. Слайд внутрь чуть ниже руки яму к центру живота среднего животного, чтобы визуализировать весь яичник. Ультра-сонограф: Используйте недоминирующую руку, чтобы заморозить рамку и захватить желаемые изображения на УЗИ. Категоризировать стадию цикла яичников по системе классификации, установленной для рода4 (Таблица2, Рисунок 5B-F). Промыть любой гель от животного в конце процедуры. Каудат Передача неанестезируемого Нектура в 4 L прямоугольный контейнер, наполненный 2 l бака воды. Свести к минимуму движение животных, выключив свет в комнате и/или чашку одной рукой над головой животного. Расположите преобразователь на расстоянии 1-2 см от стенки тела. Найдите сердце на брюшной средней линии уровня на передних конечностях, а затем двигаться преобразователя дистально и изучить ткани яичников7. Категоризировать самок в соответствии с системой классификации, установленной для рода4 (Рисунок6A,B, C). Получить точные показатели яиц в середине до позднего гравид стадии путем захвата изображения, когда тело животного находится под углом к преобразователю (т.е. не линейной, но небольшой дуги; Рисунок 6B). В противном случае, перекрывающиеся фолликулы затрудняют дифференцировать индивидуальный размер яйца. Анестетик индукция и восстановление Анураны Анестезия в MS222 (0,5 г/л; Трикатина метанесульфонат буферизирован (0,5 М NaHCO3), как описано ранее. Используйте выправительный рефлекс в качестве основного индикатора степени, в которой животное стало обезболеващим. Полная потеря рефлекса свидетельствует о состоянии глубокой анестезии. Удалите животное из водной ванны на основе анестезии (MS-222) после того, как выправной рефлекс теряется. Поместите животное на мокрое (с безосветной дехлорированной водой) полотенце. Убедитесь в том, чтобы держать животное влажным в течение всей хирургической процедуры. Интубировать маленьких амфибий красными резиновыми катетерами, незавки трубками или классическими манжетами эндотрахеялевых трубок без надувания манжеты. Обеспечить низкий приток кислорода (0,5-0,75 л/мин) с 0,5-1% изофлуран. Остановите изофлюран после процедуры, но держите поток кислорода в течение 1 минуты. Вынзять животное и тщательно промыть животное безобездоненциной дехлорированной водой в течение 2 минут. Положите животное в неглубокое количество дехлорированной воды или на мокрое полотенце. Оцените выздоровление животного, осторожно потянув на заднюю конечность, чтобы удлинить. Любое отвечая сжатие конечности указывает на вывод рефлекс. Мониторинг других показателей восстановления, таких как гулярное дыхание (горло движения) и выправляющий рефлекс. Рассмотрим амфибии восстановлены, когда все рефлексы вернулись, и сердце и дыхание ставки вернулись к до-анестезии значения. Каудат Анестезия Нектурус и Амбистома в MS222 (0,5 г/л трикатина метанесульфонат, буферизированный с 0,5 М NaHCO3, (MS222) в 4 L прямоугольный бак. Поместите воздушный камень (1 дюйм) и воздушный насос в бак и включите его в постоянный поток, чтобы обеспечить адекватную оксигенацию. Когда функции конечностей и выправляющийся рефлекс теряются, удалите животное из анестезии на основе водяной ванны (MS-222) и поставьте животное на мокрое (с анестезией без дехлорированной воды) полотенце. Поддерживайте кожу и жаберную влагу с помощью выжимки бутылки баковой воды. Чтобы восстановить животное, аккуратно поместите его вентральный стороной вниз в 4 l пластиковый контейнер, наполненный 2 л воды бака с воздушным камнем.ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановление начинается с мигающего жаберного, а затем возможность двигать хвостом и двигать вперед и, наконец, функциональное движение конечностей. Верните животное в исходный резервуар для жилья и внимательно следите за ним в течение следующих 24 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Другие методы анестезии для земноводных существуют, и они описаны в Райт и Уитакер8. 2. Инвазивные методы мониторинга и контроля яичников ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была адаптирована из Форзон и др.10. Держите лягушку в доминирующей руке, и мазок сухой venipuncture стороне лица лягушки с стерильной салфеткой или марлей. Сухие лица, чтобы избежать крови от рассеивания по всей коже слишком много. Вставьте иглу (26 G 1’2″ и 27 G 1’2), с скотом лицом вверх, через кожу, где поднял кожу вокруг глаза и верхней челюсти хребта встретиться, чтобы сформировать точку треугольника (желтый план) (Рисунок 7A) доступ к вене facialis рядом вена orbitalis задний. Проколлицать лицевой вену ниже правого глаза и выше верхней челюсти хребта, начиная между 1-2 мм назад от средней линии глаза(рисунок 7A).ПРИМЕЧАНИЕ: Для меньших лягушек (до 20 г) переместите точку вставки ближе к положению прямо ниже средней линии глаза. Угол микрогематокрит трубки вниз, чтобы гравитация, чтобы помочь приток крови в трубку. Кровь должна течь сразу после прокола(рисунок 7B,C). При первых признаках кровотока, поместите кончик микрогематокритной трубки в месте прокола и соберите 1-2 полных микрогематокритных трубки крови и поместите трубки в подходящие сосуды для сбора(рисунок 7B,C). Если кровь не течет легко, или объем очень низкий, сдвиг вставки иглы немного или вставить иглу в другую сторону лица. Остановить кровотечение, нажав марли твердо к проколовой сайте, по крайней мере 20 с. Оставьте лягушку из воды на 10 минут, чтобы подтвердить, что место прокола не открывается повторно. Используйте новую иглу и новые микрогематократные трубки для каждой лягушки. 3. Индукция гормонов Гормональный препарат Подготовка инъекций гормонов непосредственно перед использованием для обеспечения максимального эффекта. Выберите гормон из выбора, указанного в таблице1. Определите концентрацию гормона, который нужно вводить с помощью Л/ или МЛ/г массы тела16. Разбавить гормон в одном из следующих: вода, фосфат буферный солен (PBS), соленовый раствор амфибии Ringer (SARS) или сосуд. Не превышать объем инъекций 200 л для лягушек весом 30-70 г и 300 л для лягушек весом 80-110 г (личное наблюдение)16. Для правильного удержания животного во время гормонального введения любого животного в диапазоне от 10-100 г используйте любой из соответствующих методов для удержания, описанные в разделе 1.1. Анураны Рассчитайте концентрацию, требуемую на человека, используя грамм на расчет веса тела (г/вес тела). Незадолго до введения, воссоздать в стерильных разбавителя выбора. Убедитесь, что пузырьки не остаются в шприц перед инъекцией. Держите животное надежно в недоминирующей руки и управлять инъекции с доминирующей рукой. Администрирование инъекций в соответствии с гормональными характеристиками. Наиболее распространенными инъекциями у ануранов являются подкожные, внутриперитонеальные или внутримышечные(рисунок 8). Администрирование инъекций IP в нижней части живота или в нижней части спинной стороны тела вблизи задней ноги(рисунок 9). Управлять внутримышечными инъекциями предпочтительно в задние лапы. Каудат(Нектурус) Восстановите гормон выбора в стерильной воде в соответствии с граммом на метод веса тела, описанный выше. В случае нектура, используйте дозы 1,7-2,3 мкг gnRH/g массы тела. Удалить Нектур из анестезии камеры и поместить на 45 “поверхность, покрытую хирургической драпировкой. Расположите животное с головой, указывающей вниз. Подход к задней квадранте живота (каудал задней ноги) под углом 15-20 градусов. Будьте осторожны, чтобы не ввести воздух в шприц. Вводить (IP) с помощью инсулинового шприца и 27-30 G иглы. Вводят гормон с помощью инсулинового шприца и 27-30 G иглы. 4. Хирургия Общая хирургическая подготовка и процедура Для поддержания асептических процедур используйте прозрачные стерильные пластиковые шторы для изоляции хирургического участка. Уменьшите испарение, сохраняя окружающую кожу влажной. Смочите любые материалы, которые соприкасатся с кожей животного стерильной водой. Сделайте разрез кожи с помощью лезвия скальпеля под номером 15 или 11.ПРИМЕЧАНИЕ: Сочетание холодной стали, радиохирургии или диодного лазера. Гемостаз при легкой геморрагической процедуре может быть достигнут электрокаутером или диодным лазером. Используйте копья с наконечником хлопка или аппликаторы, чтобы позволить применение локализованного давления к мелким судам, отслеживая кровопотерю. Используйте копья с наконечником хлопка или аппликаторы для управления небольшими ограниченными пространствами вместо стандартных марлевых квадратов. Используйте микро-инструменты, такие как офтальмологические инструменты, с тонкими, маленькими наконечниками, при выполнении операции на животных весом менее 1 кг. Используйте пластиковые, самосохраняющиеся ретракторы (например, ретрактор Lone Star) для приспособления различных размеров разрезов. Используйте втягивающие веко для втягивания куеломных разрезов. Используйте приборы увеличения, когда это необходимо для выполнения операции на маленьких пациентов.ПРИМЕЧАНИЕ: Анальгезия требуется с любой хирургической процедуры у земноводных. Неспособность вводить адекватную обезболивающую во время операции была связана с задержкой возвращения нормальных функций. Кроме того, анальгезия потенцирует эффекты анестезирующих препаратов(Таблица 3)34. Анураны После того, как X. laevis был анестезируется, как описано в шаге 1.5.1, положение животного в царской recumbency(Рисунок 10A, C). Подготовка хирургического поля асептически путем вытирая влажную стерильную марлю с разбавленным повид-йодным раствором (1/10) на месте для 10-15 с или 0,75% раствора хлоргексидина на хирургическом участке в течение не менее 10 минут до операции35. Сделайте 3 мм парамедианный разрез кожи в середине колома (между плечами и клоака) одним смелым ударом, оставляя чистый разрез с помощью no 15 или No 11 скальпеля.ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать диодный лазер также для разрезов кожи. Поднимите брюшную мембрану, сделайте и разрез и тщательно вскрыть с помощью No 15 или No 11 скальпель. (Рисунок 10B,D). Уречку coelomic разрезы с век и втягивает (или любое соответствующее оборудование). Акциз часть яичной массы без лигата каких-либо кровеносных сосудов. Для полной овариэктомии прижимайте окружающие кровеносные сосуды электрокаутерией или лазерным диодом(рисунок 11). Используя монофиломентный шов, закройте разрез celiotomy с прерванным, вечно йежебным узором швов. Каудат Однажды А. Mexicanum был под анаксетом, поместите его в правой боковой recumbency, с левой тазовой конечности просто размещены против хвоста базы. Подготовка хирургического поля асептически путем размещения влажной стерильной марли с разбавленным повид-йодным раствором (1:10) на участке в течение 10-15 с. В качестве альтернативы используйте стерильную марлю, пропитанную раствором хлоргексидина 0,75%, и поместите на хирургическое место не менее 10 мин. до операции(рисунок 12A)36,37 . Нарисуйте линию между плечом и задними конечностями, чтобы разделить тело на три равные части(рисунок 12B). Сделайте место разреза между второй и третьей частями. Возьмитесь за основную мышцу и поднимитеот от куеломической внутренности. Аккуратно заусилите небольшие гемостаты через коеломическую мускулатуру и в коеломную полость. Уречку coelomic разрезы с век и втягивает (или любой соответствующий материал)(Рисунок 12C). Для полной овариэктомии прижимайте окружающие кровеносные сосуды электрокаутерией или лазерным диодом(рисунок 12D). Используя монофиломентный шов, закройте разрез celiotomy с прерванным, вечно йежебным узором швов.

Representative Results

Морфометрия и размножение Визуализация репродуктивного статуса женщин у земноводных варьируется в зависимости от вида. Наиболее эффективным методом является УЗИ; однако, некоторые виды могут показать различную степень прозрачности их кожи (рисунок 13A,B,C ). Визуальный осмотр часто может ясно проиллюстрировать разницы между gravid и non-gravid женщиной когда кожа semi-полупрозрачно как наблюдаемо еженедельник в N. alabamensis и N. maculosus (Рисунок13A,B); или полупрозрачный, как показано на стеклянной лягушки(рисунок 13C). Темная пятнистая окраска кожи на животе N. beyeri запрещает эту оценку быть сделанной. В R. muscosa, кожа не полупрозрачные, но заметные различия могут быть обнаружены между самками, которые gravid по сравнению с теми, которые недавно oviposited, потому что кожа вялая, и животное выглядит тоньше (желтая линия) по сравнению с женщина, которая gravid (синяя линия)(Рисунок 13D). С опытом обработчик может ознакомиться с разницей между большой женщиной и gravid один, но подтверждение gravid этапе потребует ультразвука. Индексы массы тела у земноводных можно вычислить с помощью ряда формул, но их применение в качестве прогностического инструмента для размножения является спорным. В случае r. muscosa, корреляция между индексом Фултона, здоровье и репродуктивный статус остается неясным. Репродуктивное поведение и УЗИ Наши результаты показывают, как охарактеризовать репродуктивное поведение в R. muscosa для прогнозирования яйцизмы (рисунок4). Несколько этапов, длящихся от нескольких часов до нескольких недель включают, ухаживания, где мужчина активно гонится за женщиной(рисунок 4A), самец монтирует и твердо застегивает на спине женщины, называется амлексивеля (Рисунок 4B). После того, как amplexed, пара может оставаться в усиливатель в течение 1 – 5 недель, и пара будет отображать другие поведения в дополнение к амлексуса. Amplexus является очень активным поведением, которое включает в себя самца сжимая самку в мягкой накачки образом(рисунок 4C); женщина перемещается и начинает отображать поведение рук-стойки с перерывами(рисунок4D,E); и ближе к времени овиспозиции, самка, в ручной стойке, будет прислоняться к поверхностям, что она может придерживаться яйца на то время как мужчина насосы живот анимированно (в данном случае можно также наблюдать женщины трения живота вниз из-под ее рука ямы к клоака. Это может быть механическим способом, с помощью которого можно толкать яйца вниз яйцеклетки)(Рисунок 4F,G). Это исследование иллюстрирует, как ультразвук может предоставить информацию, с которой установить репродуктивный статус у самки R. muscosa и Necturus. Четыре этапа развития представлены в R. muscosa (рисунок 5C,D,E,F) и аналогичным образом характеризуются в Necturus4 (рисунок6A,B,C). Кроме того, остаточные яйца могут не быть исключены, что приводит к задержке яйцеклеток(рисунок 5G, Рисунок 15A,B). Этап 1 показывает яичник сразу после яйцы, где фолликулы трудно визуализировать(Рисунок 5C). Этап 2 представлен появлением эхогенных точек (белых пятен), рассеянных по всему яичникову(рисунок 5D). Этап 2 и 3 представлены более крупными, округлыми эхогенными точками с темными центрами, которые представляют yoked средних и больших фолликулов(рисунок 5E,F). В 2013-2017 годах пленная самка Нектура ежемесячно обследовалась с помощью ультрасонографии. Во время каждого экзамена людям присваивались оценки в соответствии с репродуктивными критериями, установленными для рода(таблица 2). Процент женщин, разрабатывая новые яйца каждый год в среднем 88,2 и 3,01%(Таблица 5). В то время как развитие яйцеклеток было высоким, овиспозиция не была обеспечена(рисунок 16). Большинство женщин, которые прошли овиспозиции депонированных полный комплект яиц, в то время как некоторые люди откладывают только часть яиц, которые развивались. Те R. muscosa и самок necturus с сохраненными яичками сопутствуя с увеличением жидкости в полости тела были наружно визуально увеличены с красными пятнами на коже согласно с рваными кровеносными сосудами (Рисунок 14A,B ) . Степень удержания жидкости может быть дополнительно оценена с помощью ультразвука(рисунок 15B). В обоих видах, сохраненные яйца прошли атризии или взял на себя более эхогенный вид(Рисунок 14C, D, Рисунок 15A). Гормональная администрация В зависимости от глубины типа инъекции угол и глубина иглы будут меняться. Для большинства инъекций глубина иглы не должна быть более 1 -2 мм глубиной при работе с видами, такими как R. muscosa, но будет меняться в пределах угла проникновения. Простагландин инъекции требуетвнутри-мышечной (им) иглы вставки под углом на 90 “, в заднюю ногу R. muscosa в то время как внутриперитонеальные (ip) инъекции, с аналогичной глубиной внутримышечных инъекций, вводились в области coelomic полости на 45 “(Рисунок 10). Администрация Amphiplex не оказала существенного влияния на увеличение количества яйцеклеток, отложенных гормонами, по сравнению с контрольными (P 0.547), и не было никаких различий в количестве эмбрионов, которые расщеплялись (P 0.673) или выжили до головастика (P 0.629)(Таблица 4). В целом, доля женщин овипоза снизилась с 80% в 2011 году до 28% в 2014 году. Число самок овипоза в 2015 году было значительно выше, чем в 2013 году (P 0,0002), 2013 (P 0,0001) и 2014 (P 0,0026), но не 2011 (P 0,0885), подтверждая идею о том, что женщины этого вида не могут размножаться ежегодно и протоколы, которые протоколы nement. Для самок R. muscosa с признаками удержания яйцеклеток, внутримышечные инъекции PGF2 ‘имели 60% успеха в индуцируя изгнание вырождающихся яйцеклеток. Тем не менее, в 1 из 5 женщин вводили, PGF2 “не было достаточно, чтобы вызвать полное изгнание и некоторые яйца остались внутри женщины до следующего сезона размножения. Семнадцать самок Necturus получили LHRH/(GnRH) и 13 получили фиктивную инъекцию стерильной воды, чтобы служить в качестве контроля(Таблица 5). В общей сложности, семь женщин Нектур (n No 4 alabamensis, n 2 beyeri, n no 1 maculosus) пошли на овипозит одиннадцать полных муфт, которые были отнесены к как GnRH лечение (n No 6) и контроля (n no 5) лиц. Три самки (n no 2 beyeri, n no 1 maculosus) oviposited пять частичных сцеплений (рисунок13). Это явление, как представляется, не связано с экзогенным гормональным лечением, как три контрольные женщины аналогичным образом откладываются частичные сцепления (Таблица 5). Овипозиция произошла в течение 37 дней (3/31-5/7) таймфрейма в течение пяти лет(таблица 5). Не было никакой разницы (P 0.194) в показателях овипозиции между обработанными LHRH/GnRH (41 и 13.08%, диапазон 17-67%) и контроль (66,75 и 11,79%, диапазон 50-100%) Женщин. LHRH/GnRH лечили женщин на хранение яйцеклеток в среднем 7,44 и 1,41 (диапазон 3-13) дней после инъекции. Учитывая полностью водный характер вида и неспособность вручную сдерживать без анестезии необходимо было обеспечить соответствующий уровень седанности перед выполнением инъекций искрометного гормона (см. раздел 3.2 для инструкций по анестезии). Сбор крови, анестезия и хирургия Метод отбора проб крови в этой статье был взят из Forzan et al. 201310 и доказал эффективный способ сбора крови из R. muscosa с минимальной инвазивностью и стрессом. Используя микрогематокритные трубки, можно собрать примерно 35-45 л плазмы или сыворотки крови на 70 л цельной крови(рисунок 7). Максимальный объем сбора в R. muscosa составил 1 полную микрогематокритную трубку на 10 г лягушки, до 4 трубок на лягушку для лягушек 40 г и больше. Это был консервативный объем сбора 0,7 мл на 100 г, 70% от максимальной рекомендации 1,0 мл на 100 г (адаптированы из Аллендер и Фрай, 2008)13. Анестезия и хирургия у земноводных редко сообщается, но важно отметить, что дозы и эффективность будет варьироваться в видов-специфических образом. В Bombina orientalis, например, MS222 имеет очень низкий эффект, даже с высокими дозами (1 г/л), в то время как в Boreal жаб, Anaxyrus boreas boreas, 1 г/ л быстро (вещество минут) и длительный (3 “h) (Calatayud, личное наблюдение). В R. muscosa, анестезия требует дозы сообщили для A. boreas boreas и имеет аналогичный эффект и время восстановления. Пост амфибий до анестезии обычно не требуется, так как их гортань остается плотно закрытой даже под общим наркозом. Однако, если это сочтено необходимым, особенно если анестезиологическая процедура включает в себя меломическую хирургию, животные могут быть поститься 24 ч до анестезии. Во время операции, выправлия рефлекс является основным показателем того, что животное стало анестезирующим. Выправив рефлекс является способность и степень легкости, с которой животное может вернуться в вертикальном положении после размещения на спине. Потеря рефлекса предполагает легкую стадию анестезии. Хирургическая плоскость указываетна на потерю абстинентного рефлекса, который включает в себя слегка потянув на конечности, чтобы выпрямить его и животное не-больше быть способным втягивать его7. Репродуктивная хирургия не имеет непреодолимых препятствий и амфибии пациентов преимущественно исцелить хорошо терпимо кровопотери больше, чем выше позвоночных. Хирургия должна продолжаться быстро, продолжительностью около 15 минут от начала до конца. Шаги должны быть приурочены примерно следующим образом: lt;1 минута для первоначального разреза и lt;2 минуты для celiotomy и вставки ретрактора, злт; 2-3 минуты для изоляции на яичник и lt;1 минута для шва или каши и швы кожи lt; 4 минуты. Общее время восстановления после операции с протоколами MS222 составляет примерно 45 минут, но это может быть специфичным для видов. В A. boreas boreas и R. muscosa время восстановления может быть больше, до 1 – 2 ч. При выполнении операции необходимо проявлять осторожность, чтобы избежать прокола легких, желудочно-кишечного тракта или расщепляемого мочевого пузыря, а также не повредить макроскопические железы, лимфатические сердца и кровеносные сосуды, особенно среднебрюшной вены. В зависимости от сезона, наличие больших жировых тел может сделать визуализацию других органов трудно. После того, как заметно проснулся, реакции животного на стимуляцию конечностей, такие как устойчивость к нежной растяжения задней конечности или мигает, когда область вокруг глаза стимулируется (личное наблюдение), классифицируются как отказ ответов. Резильный рефлекс наряду с другими показателями восстановления, включая, рефлексы вывода и гулярные движения, являются важными показателями восстановления. Администрирования Общее имя Видов Гормона Процедуры Первобытное соединение Priming доза сообщили Количество приземищих доз Сроки (hr до овуляторной дозы) Соединение (ы) вводят для окончательного овуляторного / овипозиции Дозы Ссылки Пуэрто-Рика скола Пелтофрин лемур GnRH и HCG Ip Hcg 1,5 МЕ/г 2 ХГЧ – 48 GnRH; ХГЧ; Гнржа и ХГЧ 0,2 мкг; 4 МЕ; 0,5 мкг и 4 МЕ Калатаюд и др. Горная желтоногая лягушка Рана мускоса Амхиплекс, Лют Ip GnRHa (des-Gly10, D- Ala6, Pro-NHEt9-GnRH) 0,4 мкг/г 1 24 GnRH и MET 1 х 0,4 мкг/г 10 мкг/г Калатаюд и др., 2018 PGF2 Im PGF2 5 нг/г 1 48 PGF2 5 нг/г Саут-Рокки Маунтин бореальная жаба Анаксирус борес ХГЧ, GnRH Ip Hcg 3.7 МЕ/г 2 96, 24 хГК – Гнржа 13,5 МЕ/г – 0,4 мкг/г Калатаюд и др., 2015 Северная лягушка крикет Акрис крепитан Амфиплекс добавлено в воду (10 мл) Ни один Ни один 0.00 Na GnRH и MET 0,17 мкг и 0,42 мкг / л Снайдер и др., 2012 Северная лягушка леопарда Литхобатпиенс пипиенс Амфиплекс Ip Ни один Ни один 0.00 24 GnRH и MET 1 х 0,4 мкг/г 10 мкг/г Трюдо и др., 2010 Аргентинская рогатая лягушка Цератофиры орната Амфиплекс Ip Ни один Ни один 0.00 24 GnRH и MET 1 х 0,4 мкг/г 10 мкг/г Рогатая лягушка Крэнуэлла Ceratophrys cranwelli Амфиплекс Ip Ни один Ни один 0.00 24 GnRH и MET 1 х 0,4 мкг/г 10 мкг/г Американская земляная лягушка Odontophrynus americanus Амфиплекс Ip Ни один Ни один 0.00 24 GnRH и MET 1 х 0,4 мкг/г 10 мкг/г Пуски Gopher лягушки Рана Севоза ХГЧ, GnRH Ip Hcg 3.7 МЕ/г 2 96 , 24 GnRH и HCG 1 х 0,4 мкг/г 13,5 МЕ/г Грэм и др., 2018 Общие коки Eleutherodactylus coqui Рыба, птичка, млекопитающих и GnRH (D-Ала, де-Gly, эт LHRH), ХГЧ Sc mLHRH;  aLHR; fLHRH; Гнха; Hcg Ни один 0.00 Na mLHRH;  aLHR; fLHRH; Гнха; Hcg 7 мкг, 33 мкг; 28 мкг; 7 мкг, 20 мкг; 5, 10, 15, 20 мкг; 165 МЕ Майкл и др. Тобыла Гюнтера Псевдофрин Гентери Gnrh Гнржа 0,4 мкг/г 1 26 GnRHa с или без премьера 0,4 мкг/г Силла 2010 Корробори лягушка Псевдофрин корробори Лусрин Sc Лусрин 1 мкг 1 26 Лусрин 5 мкг Бирн и Силла, 2010 Северная лягушка Корробори Псевдофрине пенгиллей GnRHa GnRH (D-Ala, des-Gly, eth LHRH) Ta Ни один Ни один 0.00 Na Гнржа 0,5 -2,0 мкг/г Силла и др., 2017 Водный погон на побережье Мексиканского залива Нектурус Бейери «des-Gly10, D- Ala6»-LhRH-RH этиламид ацетата соляного гидрата Ip Ни один Ни один 0.00 Na LHRH 100 мкг / 500 л Stoops et al., 2014 лягушка южного колокола / рычатравая травяная лягушка Литория раниформис des-Gly10, D- Ala6-LHRH Sc Ни один Ни один 0.00 Na des-Gly10, D- Ala6-LHRH 50 мкг Манн и др., 2010 Фаулер в яму Анаксирус фаулери GnRH, ХГЧ, P4 Ip Hcg 3.7 МЕ/г Браун и др., 2006 Аксолотл (мексиканская саламандра) Амбистома мексиканка Фолликулостимулирующие гормоны Im Ни один Ни один 0.00 Na Фсг 400IU Троттье и Армстронг, 1974 Африканская когтяная лягушка Ксенопус Лаевис ХГЧ и P4 добавленной воды; Ip PMSG, HCG Маркес , 2016 Тигровая саламандра Амбистома тигринум ХГЧ, LH Вайоминг жабы Анаксирус Бакстери хГЧ, Гнха, P4 Ip хГК – Гнржа 100 МЕ и 0,8 мкг 1 72 год хГК – Гнржа 100 МЕ и 0,8 мкг Браун и др., 2006 Северная лягушка леопарда Литхобатпиенс пипиенс Экстракт гипофиза (PE), P4, тестостерон (T), кортикостерон ,C, Амфиплекс, домперидон (D) SC, IP Ни один Ни один 0.00 Na ПЭ, ПЭЗТ, ПЭЗП4, ПЭЗК; Амфиплекс, Гнrh и D 100 МЕ (LHRH) в 1 мл; PE-0.002 мкг/Л; PE-0.01mg/50mL; PE-0.1mg/50mL; 0,4 мкг/г – 10 мкг/г;  0,4 мкг/г Райт, 1961; Форт, 2000; Трюдо и др., 2013 Молотая лягушка Lymnodynastes tasmeniensis Гипофиз экстракты, ХГЧ, GnRHa, ПЗ Ip Гнржа 0,9-1,2 мкг/г – 10 мкг/г 1 20 PE; ПЭ и ХГЧ; Гнрхи и ПЗ PE vol; PE vol 100 IU hCG; GnRH (0,9-1,2 мкг/г) Clulow et al., 2018 Зеленый и Золотой Колокол лягушки Литойя ауреа Gnrh Ip Гнржа 10 мкг 1 72 год Гнржа и ХГЧ 20 мкг и 300 МЕ Clulow et al., 2018 Великий Запрещенная лягушка Миксофис фасциолатус ХГЧ и PMSG Sc PMSG, HCG 50 МЕ и 25 МЕ; 1×100 МЕ 2; 2 PMSG-144 и 96;  ХГЧ-24 Hcg 100IU Clulow et al., 2012 Для больше протоколов инкрети и видов видят Wright и Whitaker, 2001 Таблица 1: Виды амфибий и некоторые из экзогенных гормонов, протестированных на них, как сообщается в литературе. Хорионический гонадотропин человека (ХГЧ); Гонадотропин высвобождение-гормон (GnRH); Лютенизация гормоносвобита гормона (LHRH); буквы m, a и f представляют «млекопитающие», «авиановые» и «рыба»; беременная кобыла сыворотка гонадотропин (PMSG); прогестерон (P4); Фолликулостимулирующий гормон ФСГ); экстракт гипофиза (PE); тестостерон (T); кортикостерон (C). Допамин антагонисты перечислены включают в себя: домперидон (D); Пимозид (P); метоклопрамид (MET). Амфиплекс – это название соединения, состоящего из GnRH и Metoclopramide27. Lucrin является коммерчески доступным GnRH агонист с активным ингредиентом leuprorelin ацетат. 4 , 7 (г. , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20 , 26 , 27 , 38 , 39 , 40 г. , 41 год , 42 г. , 43 , 44 , 45 г. Класса Репродуктивный статус Описание 0.00 Не-гравид Яйца не видны. 1 Ранний gravid Яйца видимые (1-2 мм в размерах) не имеют четкой эхогенной линии, связанной с яйцом. 2 Середина gravid Яйца размером 2-3 мм, различные эхогенной линии (ы), связанные с каждым яйцом. 3 Поздний gravid Яйца размером 4-5 мм, эхогенные линии все еще видны, заметное увеличение анехоичного появления яйца. 4 Сохраненные яйца Различные степени эхогенного материала, присутствуют во внутренней структуре яйцеклеток, принимают аморфную форму. Некоторые из них могут стать очень эхогенные и связанные с задержкой жидкости в полости тела. Таблица 2: Система оценки, используемая для оценки репродуктивного состояния нектура в неволе и Рана мускоса по ультрасонографии. Наркотиков Дозировка и маршрут Комментарии – ссылка Бупренорфин 50 мг/кг (интрейсломия) Экспериментальное исследование в восточной красно-пятнистый тритон (Notophthalmus viridescens). Анальгезия должна быть дана до операции. (Келлер, 2009) Буторфанол 1 – 10 мг/кг (IM или intracelomic) Существуют различные конкретные respons. Рекомендуется начинать с 1 мг/кг. Буторфанол 0,5 мг/л (ванна) Экспериментальное исследование в восточной красно-пятнистый тритон (Notophthalmus viridescens). (Келлер, 2009) Фентанил 1 мг/кг Анальгезия , 4 ч, антагонизированный налтрексон (Стивенс, 1997) Мелоксикам от 0,1 до 0,2 мг/кг (IM) (Минтер, 2011) Таблица 3: Протоколы обезболивании у земноводных. Рана мускоса Год 2014 год 2015 год Нет, ♀ 18 лет 18 лет Развитие яйцеклеток 61% 94% Контрольный ♀ 4 6 Амфиплекс ♀ 4 7 (г. Средний день после Амфиплекс аовипоза 10.5 10.9 Для того, чтобы Коэффициент овипозиции (Амфиплекс) 22.20% 33,33% Коэффициент овипозиции (контроль) 22.20% 38,88% Таблица 4: Сравнение репродуктивных параметров между обработанными амхиплексами по сравнению с контрольной женщиной в неволе Рана мускоса в 2014 и 2015 годах. Нектур sp. Год 1 2 3 4 5 Нет, ♀ 6 евро 7 (г. 7 евро 7 евро 7 евро Развитие яйцеклеток 83% 100% 86% 86% 86% LHRH ♀ 3 5 3 6 0.00 Контрольный ♀ 2 2 3 0.00 6 День пост-LHRH в Oviposit 5 7 (г. 5.5 (диапазон 3 – 8) 13 Год n/a Коэффициент овипозиции (LHRH) 60% 20% 67% 17% n/a Коэффициент овипозиции (контроль) 50% 50% 100% n/a 67% No 1 ♀ без развития яйцеклеток Таблица 5: Сравнение репродуктивных параметров между LHRH (GnRH) -Лечение и контроль (стерильнаявода) в неволе женщина Нектур от трех видов в течение 5-летнего периода времени (2012-2017). Рисунок 1: Три способа проведения лягушки. (A) Процедура 1. (B) Процедура 2. (C) Процедура 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Морфометрические оценки. (A, B) SVL/SUL (C, D). вес, в R. muscosa и D. Necturus. (E). Измерение размера с калиперами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Сексуальный диморфизм отличается брачных прокладок большого пальца на взрослых R. muscosa мужчин по сравнению с женщинами. (A) самка (B) Мужчины. Нижняя панель показывает длину мужчины против женщины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Характеристика репродуктивного поведения, приводящая к овистам в R. muscosa (A) ухаживания. (B) Амплекс. (C) Самец сжимая женщину в то время как в усиливатель. (D, E) Смазанный самкой в стойке к руке. (F, G) Абдоминальных сокращений и овисты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Ультразвук выполняется на R. muscosa A-B с репродуктивным статусом в соответствии с стадией развития4. (A, B) Выполнение ультразвука на Рана мускоза. (C) Оценка 0. (D) Оценка 1. (E) Оценка 2. (F) Оценка 3. (G) Оценка 4 (овуляция и сохраненные яйца) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 6: Ультразвуковые изображения Нектура. (A) Оценка 1. (B) Класс 2. (C) 3 класс яйца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 7: Сбор крови в R. muscosa. (A) Сбор крови путем прокола вены orbitalis задней лицевой вены чуть выше челюсти в середине орбиты. (B, C) Кровь высвобождается на поверхность кожи и собирается с помощью гепаринной капиллярной трубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 8: Методы инъекций у земноводных. В зависимости от глубины типа инъекции угол и глубина иглы будут меняться. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 9: Гормональная инъекция в R. muscosa. Индукция овипов гормональным лечением у самок из -рана-мускозы вводится амфиплексом внутриперитонеалли. Яичники можно найти в coelomic полости Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 10: Подготовка перед операцией. ()Асептический препарат хирургической области с использованием разбавленного повидоно-йодного раствора (1/10), Trachycephalus resinifictrix. (B) Чистый скальпель разрез в Xenopus laevis или, (C) лазерно-диодный разрез кожи, Lithobates catesbeianus. (D) Избегайте повреждения средней вены, Trachycephalus resinifictrix. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 11: Обиэктомия в Ксенопусла. (A) Разоблачить и переместить большие жировые тела, чтобы раскрыть яичную массу. (B) Акциз часть яичной массы без лигата каких-либо кровеносных сосудов. (C) Каутериз окружающих кровеносных сосудов электрокаутерии для полной овариэктомии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 12: Предоперационная подготовка и овариэктомия в A. mexicanum. (A) Стерильная марля, пропитанная, 0,75% раствор хлоргексидина применяется к хирургическому участку (B). Линия между плечом и задними конечностями делит животное на три равные части, и синее пятно отмечает место на разрезе. (C) Уречку coelomic разрезы с век ивена втягивает. (D) Для полной овразиэктомии, приживать окружающие кровеносные сосуды электрокаутерией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 13: Визуальная оценка репродуктивных стадий. (A, B) Визуальные оценки репродуктивной стадии через полупрозрачную кожу, Нектур. (C) Полупрозрачная кожа, Hyalinobatrachium (Стеклянная лягушка). (D) Визуальная оценка R. muscosa до (правая, синяя линия) и после oviposition (левая – желтая линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 14: Удержание яйцеклеток. (A, B) Самка Рана мускоза с тяжелым случаем задержки яйцеклетки. (C) Ультразвук показывает старые вырождающиеся, яйца (вверху) и большие яйца (средняя и нижняя панель) овуляции и в ловушке в колеме. (D) Сохраненные яйца, извлеченные вручную зачистки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 15: Ультразвуковые изображения сохраненных яйцеклеток в Нектуре, которые (A) стали эхогенными по внешнему виду (круг) и были связаны с (B) задержка жидкости в полости тела (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 16: Процент пленных самки Нектура, который оипозитировал полные или частичные лапы (2013-2017) по сравнению с теми, которые не оипозалить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Непосредственное обращение, визуальное наблюдение и морфометрические меры обеспечивают неинвазивные методы и являются первыми критериями оценки для определения репродуктивной стадии женщин. Тем не менее, это исследование показывает, что gravid яичников не всегда могут быть надежно определены пальпации. В зависимости от вида, gravid яичников иногда может быть визуально обнаружены через полупрозрачные(рисунок 13A, B) или полностью полупрозрачной кожи на брюшной стороне животного (Рисунок 13C). Самки, которые завершили овипозиции может показать очевидные изменения в их внешний вид по сравнению с gravid женщин (например, свободная кожа и потеря до 30% от их массы тела, Рисунок 13D). Во время размножения, мужчины и женщины будут отображать определенные поведения, которые предоставляют информацию о близости к овуляции и овики. В случае R. muscosa указывает на то, что самка близка к овиспозиции начать с женщины ввода handstands.

Применение ультразвуковой технологии к ануранам и каудатам позволяет диагностировать наличие или отсутствие яйцеклеток и связано ли яйцеклетка с полным или частичным высвобожденным яйцеклетки. Таким образом, этот метод обеспечивает более полную и точную оценку репродуктивного статуса, не ограничиваясь определением статуса gravid/non-gravid с помощью метода визуализации, которая варьируется в зависимости от прозрачности брюшной кожи, или эпидермальной консистенции среди различных видов земноводных. Ультразвук может быть выполнен с относительной легкостью и с небольшим стрессом для животных(Рисунок 5 и Рисунок 13)и может быть использован для характеристики репродуктивных циклов и для определения репродуктивного статуса4. Очень важно ознакомиться с видами; однако, это исследование показало, что Necturus и R. muscosa имеют общие признаки развития в их репродуктивной модели, позволяющие для аналогичной классификации репродуктивной стадии (Рисунок 5). Благодаря этой технологии в настоящее время доказательства того, что развитие яйцеклеток является высоким в неволе Нектур и R. muscosa и что оба этих вида следуют сезонной модели. Хотя причины этих явлений неизвестны и требуют дальнейшего изучения, без использования ультразвука, несколько областей дисфункции яичников, таких как задержка яйцеклеток и частичная овипозиция, остались бы незамеченными. Будущие применения к этому методу будут использованы для того чтобы обусловить должны ли женщины быть выбраны для разводить в любом, котор дали годе и ли oviposition вполне.

Протокол сбора крови, как, например, представленный в R. muscosa, который является одновременно эффективным и вызывает минимальный уровень бедствия для животного, является оптимальным для изучения гормональных профилей в неволе и дико пойманных ануранов (Calatayud, неопубликованный). На сегодняшний день нет никакой информации о ежегодных гормональных профилей плена R. muscosa и, следовательно, никаких знаний о том, как гормоны влияют на их здоровье и размножение. Кроме того, с доказательствами того, что самки этого вида не могут быть годовыми заводчиками, гормональное профилирование будет еще одним методом для отслеживания циклов яичников. Вместе с ультразвуком, анализ инкрети может вести к более лучшему прогнозированию чего женщины будут готовы для oviposition. Кроме того, в прошлом году было зарегистрировано два случая интерсекса в популяции Р. Мускозы. Кроме того, развитие большого пальца колодки было отмечено на некоторых из старших женщин-основателей. Причины этого в настоящее время находятся под следствием, но первоначальные результаты показывают, что это может относиться к изменениям в уровнях тестостерона (Calatayud, неопубликованные). Различание гормональных циклов у женщин разных возрастов поможет нам понять, почему у женщин могут развиваться вторичные половые характеристики, связанные с мужчинами, и следует ли этого ожидать в стареющей популяции.

Экзогенная гормональная терапия была использована для преодоления репродуктивной дисфункции часто встречаются в неволе земноводных. Однако, для как R. muscosa, так и для популяций Нектура в этом исследовании, никаких значительных различий в яичке между гормонами и контрольных самок не было обнаружено в течение 2 и 5-летнего периода времени, соответственно. Это может означать, что гормональный протокол администрации, дозы, грунтовки и комбинации гормонов используется не было адекватного для вида. Более близкий анализ индивидуальных женских репродуктивных историй предполагает, что R. muscosa может не испытывать ежегодного размножения, что также может объяснить отсутствие гормонального эффекта, наблюдаемого у обработанных самок. Потому что определенный процент самок последовательно пропустил размножения каждый год, понимание естественной истории вида может помочь определить, есть ли необходимость в экзогенных гормонов и когда они могут быть наиболее эффективными. Процедуры, изложенные в этой статье, могут применяться к ряду видов (таблица 1) и для ануранов в диапазоне от 5 г до 150 г; более крупным животным могут потребоваться различные шприцы и иглы датчиков. Расположение инъекции варьируется с некоторыми гормонами, требующими внутримышечной, внутриперитонеальной, субкожной или интрейдерской инъекции(рисунок 7).

Хирургия для целей овариэктомии является распространенным методом, используемым в различных видах амфибий для получения яйцеклеток для эмбриональных исследований. Обариэктомия также может быть указана для контроля населения и медицинских вопросов, таких как задержка яйцеклеток. В случае частичной овариэктомии, в которой, сбор яйцеклеток выполняется в исследовательских целях, операция должна гарантировать, что животное остается репродуктивным. Администрация PGF2 “показал некоторые перспективы в решении удержания яйцеклеток у женщин R. muscosa. В нескольких физических лиц, PGF2 “вызвало полное осаждение ранее сохраненных яиц, но в других только частичное осаждение произошло требующих ручной зачистки, чтобы удалить все яйца. В то время как PGF2 “может служить альтернативой хирургии для удержания яйцеклеток в R. muscosa, его способность исправить аналогичные патологические условия у других земноводных потребует видов конкретных проверки. Когда хирургическое вмешательство санкционировано для пациента Anuran или Caudate, необходимо обеспечить адекватную плоскость анестезии прежде чем разрезы сделаны. Для оценки и мониторинга нормативных индукций и ответов на восстановление, изложенных в данном исследовании для каждой из таксонов, необходимы навыки наблюдения. После того, как один знакомы с конкретной анатомии, соответствующий хирургический подход, гемостаз, мягкие манипуляции ткани и адекватного послеоперационного управления, репродуктивные операции не представляют собой подавляющее препятствия.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Натали Calatayud хотел бы поблагодарить д-р Барбара Дюрант для обучения и помощи с ультразвуком и Exploradora де Immuebles, S.A. (EISA) для предоставления финансовой помощи на мою должность научного сотрудника в SD’G. Спасибо доктору Кайли Кейн за комментарии к рукописи, а также официальным рецензентам (кем бы они ни были). Благодаря Джонатан Dain наш 2018 Летний сотрудник, Сан-Диего зоопарк Институт исследований по сохранению для предоставления фотографий(Рисунок 1A, B). Моника Ступс выражает признательность Ассоциации зоопарков и аквариумов Фонда охраны природы и Всемирного фонда охраны природы Диснея за предоставление финансовой поддержки для создания популяции нектуруса в плене. Кроме того, поддержка была также получена за счет частных пожертвований от адвоката-амфибии г-жи Айрис де ла Мотт. Спасибо, дается г-н Кристофер DeChant и д-р Марк Кэмпбелл за их значительный вклад в исследования.

Materials

GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems GE medical systems GE logiq Book XP Ultrasound
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex GE medical systems 8C-RS (10 MHz) Ultrasound probe
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) Mettler Electronics Corp CA Sonigel Ultrasound gel (water soluble, salt-free)
Hormone
Gonadotropin releasing hormone BACHEM 4012028 synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate
abbreviation: GnRH
Lutenizing hormone releasing hormone BACHEM, Sigma-Aldrich 4033013;     L1898 synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt;
[D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate
abbreviation: LHRH
Human chorionic gonadotropin BACHEM, Sigma-Aldrich 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU)
abbreviation: hCG
Prostaglandin 2α Sigma-Aldrich P40424; synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris;
abbreviation: PGF2α
Follicle-stimulating hormone Sigma-Aldrich F4021, F8174 synonym: porcine, sheep
abbreviation: FSH
Progesterone Sigma-Aldrich 46665;      P7556 synonym: Vetranal; P4 water soluble
abbreviation: P4
Pituitary extract na synonym: Check papers for amphibian species derivation
abbreviation: PE
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec;       Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich HOR-272;    493-10; 9002-70-4 synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin
abbreviation: PMSG
Metaclopromide Sigma-Aldrich M0763 synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide
abbreviation: MET
Lucrin BACHEM; Sigma-Aldrich 4033014;   L0399 synonym: Leuprorelin acetate
abbreviation: Lucrin
Lutalyse Pfizer synonym: PGF2α – Dinoprost tromethamine
abbreviation: Lut
Pimozide Sigma-Aldrich P1793 synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one
abbreviation: PZ
Amphiplex see above synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide
abbreviation: GnRH + MET
Ovopel Ovopel na synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg)
abbreviation: Ovo
Ovaprim Pentair aquatic eco-systems Ova10 synonym: Salmon gonadotropin + domperidone
abbreviation: Ova
Domperidone Sigma-Aldrich D122 synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine
abbreviation: DOM
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Conde, D. A., Flesness, N., Colchero, F., Jones, O. R., Scheuerlein, A. An emerging role of zoos to conserve biodiversity. Science. 331 (6023), 1390-1391 (2011).
  2. Conde, D. A., et al. Zoos through the Lens of the IUCN Red List: A Global Metapopulation Approach to Support Conservation Breeding Programs. PLoS ONE. 8 (12), e80311 (2013).
  3. Morrison, C., Hero, J. -. M. Geographic variation in life-history characteristics of amphibians: a review. Journal of Animal Ecology. 72 (2), 270-279 (2003).
  4. Calatayud, N. E., Stoops, M., Durrant, B. S. Ovarian control and monitoring in amphibians. Theriogenology. , 70-81 (2018).
  5. National Research Council. . Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook. , (2010).
  6. Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
  7. Graham, K. M., Langhorne, C. J., Vance, C. K., Willard, S. T., Kouba, A. J. Ultrasound imaging improves hormone therapy strategies for induction of ovulation and in vitro fertilization in the endangered dusky gopher frog (Lithobates sevosa). Conservation Physiology. 6 (1), coy020 (2018).
  8. Wright, K. M., Whitaker, B. R. . Amphibian Medicine and Captive Husbandry. , (2001).
  9. Forzán, M. J., Vanderstichel, R. V., Ogbuah, C. T., Barta, J. R., Smith, T. G. Blood collection from the facial (maxillary)/musculo-cutaneous vein in true frogs (family Ranidae). Journal of Wildlife Diseases. 48 (1), 176-180 (2012).
  10. Allender, M. C., Fry, M. M. Amphibian hematology. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 11 (3), 463-480 (2008).
  11. Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (3), 64-67 (2007).
  12. Jorgensen, C. B. External and internal control of patterns of feeding, growth and gonadal function in a temperate zone anuran, the toad Bufo bufo. Journal of Zoology. 210 (2), 211-241 (1986).
  13. Jørgensen, C. B. Growth and reproduction. Environmental Physiology of the Amphibians. , 439-466 (1992).
  14. Vu, M., Trudeau, V. L. Neuroendocrine control of spawning in amphibians and its practical applications. General and Comparative Endocrinology. 234, 28-39 (2016).
  15. Clulow, J., Trudeau, V. L., Kouba, A. J. Amphibian declines in the twenty-first century: why we need assisted reproductive technologies. Reproductive Sciences in Animal Conservation. , 275-316 (2014).
  16. Kouba, A., et al. Assisted reproductive technologies (ART) for amphibians. Amphibian Husbandry Resource Guide. 2, 60-118 (2012).
  17. Clulow, J., et al. Optimisation of an oviposition protocol employing human chorionic and pregnant mare serum gonadotropins in the Barred Frog Mixophyes fasciolatus (Myobatrachidae). Reproductive Biology and Endocrinology. 10 (1), 60 (2012).
  18. Browne, R. K., Seratt, J., Vance, C., Kouba, A. Hormonal priming, induction of ovulation and in-vitro fertilization of the endangered Wyoming toad (Bufo baxteri). Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 34 (2006).
  19. Calatayud, N. E., et al. A hormone priming regimen and hibernation affect oviposition in the boreal toad (Anaxyrus boreas boreas). Theriogenology. 84 (4), 600-607 (2015).
  20. Stoops, M. A., Campbell, M. K., Dechant, C. J. Successful captive breeding of Necturus beyeri through manipulation of environmental cues and exogenous hormone administration: a model for endangered Necturus. Herpetological Review. 45 (2), 251-256 (2014).
  21. Mc Creery, B. R., Licht, P. Induced ovulation and changes in pituitary responsiveness to continuous infusion of gonadotropin-releasing hormone during the ovarian cycle in the bullfrog, Rana catesbeiana. Biology of Reproduction. 29 (4), 863-871 (1983).
  22. Johnson, C. J., Vance, C. K., Roth, T. L., Kouba, A. J. Oviposition and ultrasound monitoring of American toads (Bufo americanus) treated with exogenous hormones. Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 299, 301 (2002).
  23. Herbert, D. . Studies of assisted reproduction in the spotted grass frog Limnodynastes tasmaniensis: ovulation, early development and microinjection (ICSI). , (2004).
  24. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2, 6 (2004).
  25. Ogawa, A., Dake, J., Iwashina, Y., Tokumoto, T. Induction of ovulation in Xenopus without hCG injection: the effect of adding steroids into the aquatic environment. Reproductive Biology and Endocrinology. 9 (1), 11 (2011).
  26. Silla, A. J. Effects of luteinizing hormone-releasing hormone and arginine-vasotocin on the sperm-release response of Günther’s Toadlet, Pseudophryne guentheri. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 139 (2010).
  27. Trudeau, V. L., et al. Hormonal induction of spawning in 4 species of frogs by coinjection with a gonadotropin-releasing hormone agonist and a dopamine antagonist. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 36 (2010).
  28. Krause, E. T., von Engelhardt, N., Steinfartz, S., Trosien, R., Caspers, B. A. Ultrasonography as a minimally invasive method to assess pregnancy in the fire salamanders (Salamandra salamandra). Salamandra. 49, 211-214 (2013).
  29. Browne, R. K., Li, H., Seratt, J., Kouba, A. Progesterone improves the number and quality of hormone induced Fowler toad (Bufo fowleri) oocytes. Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 3 (2006).
  30. Bramucci, M., et al. Different modulation of steroidogenesis and prostaglandin production in frog ovary in vitro by ACE and ANG II. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 273 (6), R2089-R2096 (1997).
  31. Gobbetti, A., Zerani, M. Possible roles for prostaglandins E2 and F2α in seasonal changes in ovarian steroidogenesis in the frog (Rana esculenta). Journal of Reproduction and Fertility. 98 (1), 27-32 (1993).
  32. Gobbetti, A., Zerani, M., Carnevali, O., Botte, V. Prostaglandin F2α in female water frog, Rana esculenta: Plasma levels during the annual cycle and effects of exogenous PGF2α on circulating sex hormones. General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 175-180 (1990).
  33. Guillette, L. J., Dubois, D. H., Cree, A. Prostaglandins, oviducal function, and parturient behavior in nonmammalian vertebrates. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 260 (5), R854-R861 (1991).
  34. Clulow, J., Mahony, M., Browne, R., Pomering, M., Clark, A., Campbell, A. Applications of assisted reproductive technologies (ART) to endangered anuran amphibians. Declines and Disappearances of Australian Frogs’. , 219-225 (1999).
  35. Browne, R. K., Wolfram, K., García, G., Bagaturov, M. F., Pereboom, Z. Zoo-based amphibian research and conservation breeding programs. Amphibian and Reptile Conservation. 5 (3), 1-14 (2011).
  36. Chai, N. Surgery in amphibians. Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice. 19 (1), 77-95 (2016).
  37. Gentz, E. J. Medicine and surgery of amphibians. Ilar Journal. 48 (3), 255-259 (2007).
  38. Snyder, W. E., Trudeau, V. L., Loskutoff, N. M. 168 a noninvasive, transdermal absorption approach for exogenous hormone induction of spawning in the northern cricket frog, Acris crepitans: a model for small, endangered amphibians. Reproduction, Fertility and Development. 25 (1), 232-233 (2012).
  39. Kouba, A. J., et al. Emerging trends for biobanking amphibian genetic resources: the hope, reality and challenges for the next decade. Biological Conservation. 164, 10-21 (2013).
  40. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2 (1), 6 (2004).
  41. Fort, D. J. . Frog reproduction and development study 2000 rana pipiens reproduction and development study. , (2003).
  42. Clulow, J., et al. Differential success in obtaining gametes between male and female Australian temperate frogs by hormonal review: A Review. General and Comparative Endocrinology. 265, 141-148 (2018).
  43. Trottier, T. M., Armstrong, J. B. Diploid gynogenesis in the Mexican axolotl. Genetik. 83 (4), 783-792 (1976).
  44. Marcec, R. M. . Development of assisted reproductive technologies for endangered North American salamanders. , (2016).
  45. Wright, M. L. Melatonin, diel rhythms, and metamorphosis in anuran amphibians. General and Comparative Endocrinology. 4, (2002).

Tags

OvariectomyAmphibian OocytesSurgical ProcedureReproductive MonitoringAnuranCoelomic IncisionOvariectomyNecturusGlass FrogRana MuscosaOvipositionAmplexusHandstand Behaviors

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Calatayud, N. E., Chai, N., Gardner, N. R., Curtis, M. J., Stoops, M. A. Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians. J. Vis. Exp. (147), e58675, doi:10.3791/58675 (2019).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image