两栖生物的研究为驱动许多类群生物体的生殖、生理、胚胎和发育过程提供了宝贵的信息。在这里,我们提出了一个全面的指导,不同的方法,可用于研究卵巢控制和监测在两栖动物。
两栖动物的卵巢控制和监测需要多方面的方法。有几个应用,可以成功地诱导生殖行为和获取配子和胚胎的生理或分子研究。两栖动物对脊椎动物研究的贡献占四分之一,在这方面,他们感兴趣的是它们对科学界生殖过程和胚胎发育知识的贡献。然而,这些知识大多来自少数物种。近来,全球两栖动物的灭绝需要环保人士加大干预力度。因面临灭绝风险而继续出现的圈养恢复和保证殖民地,使得现有的研究和临床应用对于人类护理下两栖动物的生存和繁殖具有宝贵价值。任何圈养种群的成功都取决于其健康和繁殖能力,以及培育能够延续其物种最多样化的遗传表现的可行后代的能力。因此,对于研究人员和兽医来说,监测和控制卵巢发育和健康的能力势在必行。本文的重点是强调可用于监测并酌情控制两栖动物卵巢功能的不同辅助生殖技术。理想的情况是,任何生殖健康和健康问题都应通过适当的圈养减少,但与任何动物一样,健康和生殖病理问题是不可避免的。非侵入性技术包括行为评估、目视检查和触觉以及用于计算身体状况指数和超声波的形态测量。侵入性技术包括激素注射、血液采样和手术。卵巢控制可以通过多种方式执行,具体取决于所需的应用和感兴趣的种类。
长期以来,两栖动物被广泛的研究学科所认可为重要的生物学和医学模型。通过研究特定物种获得的数据,如Xenopus laevis和X.热带,豹蛙(原拉纳)和阿索洛特尔(墨西哥阿姆比托马)已应用于许多其他脊椎动物物种,包括人类。研究这些两栖动物和其他两栖动物后产生的兽医、畜牧业和辅助生殖技术,为那些负责成功照顾、维持和维持圈养中稀有种群的人提供援助1,2,3,4.
兴趣正在增加,同时使用基于原地保护的方法,以扭转许多处于危险中的两栖物种1、2的灭绝潮。本文提供了目前可用于监测和控制阿努兰和考特斯模型物种中的两栖卵巢功能的方法。此外,还介绍了解决卵子保留常见生殖病理学的现有技术。
与许多分类组一样,两栖卵巢控制涉及环境和生理学之间的一系列紧密同步的相互作用。温度和光周期(称为近视信号)被眼睛和大脑解码,它们被迅速转换成遗传、荷尔蒙和昼夜过程(最终信号)3,4。本文介绍的监测和控制卵巢功能的方法包括侵入性和非侵入性技术。机构动物护理和使用委员会(IACUC)的研究和教学要求定义非侵入性技术,那些将造成最小至无身体疼痛或精神痛苦,不需要止痛药5。在这里,非侵入性技术包括目视检查和触觉、行为观察、形态测量和超声波。相反,采血、激素管理、手术(卵子切除术和取出保留的卵子)的技术被归类为侵入性,因为它们可能导致一些疼痛或不适,需要麻醉或手术后药物治疗。
非侵入性卵巢监测技术可以很容易地纳入大多数圈养两栖动物的日常护理程序。根据物种的不同,卵巢的重力通常可以通过简单的目视检查(玻璃青蛙)来确定。在其他情况下,触觉可能表明女性是否具有肉汁。各种身体状况指数(BCI),如体重,鼻孔型长度(SUL),鼻孔-通风长度(SVL)和标准质量指数(SMI)可用于预测卵子的存在或不存在4,6,7, 8,9.然而,应该注意解释结果,因为大多数人不考虑年龄,体形或组成(例如,水保留与卵巢质量或脂肪)6 。明确的生殖诊断可以通过超声波获得关于卵子发育和卵巢周期4,7的分期更深入的知识。超声波也提供了一种确认和监测生殖病理和相关生理状况的手段4,8。
除了提供有关健康状况的信息外,血液取样还可用于测量生殖激素。如果激素分析是最终目标, 重要的是要避免压力相关的影响, 可能会混淆系统类固醇数据.虽然一个潜在的强大的监测工具, 尚未有一项研究证明先天内分泌反应外源激素给任在任何两栖物种.血液可以从几个地点安全地取出;在青蛙中,这包括腹腔静脉、语言丛、股骨静脉和心脏9、10。在Caudates中,血液是从腹腔尾静脉采集的。在为两栖患者选择采集技术时,侵入性程度、所需的约束量、麻醉剂的需要、被攻击器官的美味度以及动物的大小都是需要考虑的因素。本文将介绍从青蛙的面部上颌或肌肉皮静脉采集血液的技术,如Forzan等人最初描述的。
卵巢控制是特定于物种的,因此,激素协议应进行测试和优化。除了季节性和相关循环激素环境,卵巢控制也可能与年龄、被囚禁时间以及反复服用激素密切相关,文献中的信息很少11,12,13.实施激素疗法,以引起生殖行为、药物产生、成熟和排卵已成为广泛报道的解决与圈养有关的常见生殖问题的方法4 8,14,15,16.由于控制脊椎动物繁殖的机制是高度保守的,有一些激素,神经肽和商用药物用于治疗其他分类组,也可以可靠地用于一些两栖动物物种(表1)。腺激素释放激素 (GnRH) 和人类胆囊性促性腺激素 (hCG) (或其变体, 即 PMSG 和 eCG)17,18,单独或组合, 已广泛用于两栖俘虏繁殖计划包括:南落基山(阿纳西鲁斯-罗塔斯)4、19、20;蛤, 杜斯基戈弗青蛙,拉纳塞沃萨(朗霍恩等人, 未出版)7;墨西哥湾沿岸水狗,内图鲁斯贝耶里20;怀俄明州蛤,阿纳西鲁斯巴克蒂18;牛蛙,拉娜卡茨比亚纳21;美国蛤,阿纳克斯鲁斯美国22;草蛙,林诺迪亚斯特塔斯马尼西斯23;科基,埃莱乌德·罗科伊图斯·科基24;异欧普,西诺普西莱维25;冈瑟的蛤蛤,普塞多夫林·甘特里26;北方豹青蛙,利托贝特皮皮恩;阿根廷角蛙,陶瓷华丽;克兰威尔的角蛙,C.克兰韦利;美国地面蛙,奥多托夫里努斯美国27;和火蜥蜴(萨拉曼德拉)228。类固醇激素,如孕酮(P4),是较少报道,但已表现出良好的疗效,在引排排和排卵在某些物种的阿努兰16,18,29.前列腺素(特别是前列腺素2-α(PGF2+)与皮质类固醇30、31、32、34一起参与排卵,并在排卵阶段31。
在体外研究中,PGF2+是排卵31的有力诱导剂,而在体内,它可以诱导拉纳肌肉4、30、32的保留卵子的排卵。纤维提取物也是排卵的有效诱导剂15,16,34;然而,在考虑这种方法时,对生物安全和疾病传播可能性的担忧往往对圈养繁殖地的阻碍。
本文的最后一节详细介绍了外科手术,并提供了其他方法来扩大卵巢研究或帮助解决生殖病理。在两栖动物中最常进行卵子切除术,以获得卵母细胞用于胚胎学研究。但是,当其他选项失败时,它还可以为保留的鸡蛋提供补救措施。虽然这个程序是侵入性的,需要完全麻醉和切口来暴露卵子质量,但它不需要安乐死。此外,在部分卵巢切除术后,动物可以完全恢复,并在手术后继续繁殖活跃。
下面描述的协议概述了在阿努兰和考斯进行卵巢控制和监测的侵入性和非侵入性方法。选择在阿努兰人中说明技术的特定物种包括粘胶和X.拉维瓦。Necturus maculosus、 N. Beyeri、 N. 阿拉巴门斯和A. 墨西哥构成用于类似描述考达特技术的物种.
直接处理、目视观察和形态测量提供了非侵入性技术,是确定女性生殖阶段的首要评估标准。然而,这项研究表明,肉体卵巢并不总是通过触觉可靠地识别。根据物种的不同,重力卵巢有时可以通过动物腹侧半透明(图13A,B)或完全半透明的皮肤进行目视检测(图13C)。完成排卵的女性与肉体女性相比,其外观可能有明显变化(例如,皮肤松弛,身体质量损失高达30%,图13D)。在繁殖过程中,雄性和雌性将表现出某些行为,这些行为提供有关接近排卵和排卵的信息。在R.muscosa的情况下,表明女性接近排卵开始与女性进入手架。
超声波技术在阿努兰和考斯的影响下应用,可以诊断卵子是否存在,以及排卵是否与发育的卵子的完全或部分释放有关。因此,这种方法提供了更完整和准确的生殖状态评估,而不局限于通过可视化技术确定肉体/非肉体状态,这种可视化技术因腹部皮肤透明度或表皮一致性而变化。不同的两栖动物物种。超声波可以相对容易地进行,对动物几乎没有压力(图5和图13),并可用于描述生殖周期和确定生殖状态4。熟悉物种至关重要;然而,这项研究显示,Necturus和R.Muscosa在其生殖模式中有着共同的发育迹象,允许对生殖阶段进行类似的分类(图5)。通过这项技术,现在有证据表明,在圈养的Necturus和R.Muscosa中,卵子发育高度,而且这两种物种都遵循季节性模式。虽然这些现象的原因不明,需要进一步调查,如果不使用超声波,卵巢功能障碍的几个领域,如卵子保留和部分排卵,将不被发现。今后应用这项技术将用来确定是否应选择雌性在任何特定年份繁殖,以及是否完成排卵。
血液收集协议,如在R.Muscosa中提出的,它既有效,对动物造成最小的痛苦,是研究圈养和野生捕获的阿努兰人(Calatayud,未发表的)激素的最佳状态。迄今为止,没有关于圈养R.Mussa的年度激素概况的信息,因此,没有关于激素如何影响其健康和繁殖的知识。此外,随着证据表明,该物种的雌性可能不是年度育种者,荷尔蒙分析将是跟踪卵巢周期的另一种方法。与超声波一起, 激素分析可能导致更好的预测什么女性将准备排卵.此外,在过去一年里,有两例圈养的R.Mussa种群的两例性间病例记录在案。此外,拇指垫的发展已经注意到一些较老的创始女性。原因目前正在调查之中,但初步结果显示,这可能与睾丸激素水平的变化(卡拉塔尤德,未发表)。不同年龄的女性的荷尔蒙周期将帮助我们理解为什么女性可能发展男性相关的继发性特征,以及这是否是预期在老龄化人群中。
外源激素疗法已用于克服在圈养两栖动物中经常遇到的生殖功能障碍。然而,在这项研究中,对于R.mussa和Necturus种群,分别在2年和5年的时间里,在激素治疗和对照女性之间的排卵位没有显著差异。这可能表明激素给药协议, 剂量, 启动和激素组合使用是不够的物种.对个体女性生殖史的更仔细分析表明,R.Mussa可能没有每年繁殖,这也可能导致治疗女性缺乏荷尔蒙效应。因为每年有一定比例的雌性不断跳过繁殖,了解该物种的自然历史有助于确定是否需要外源性激素以及何时可能最有效。本文中概述的程序可适用于若干物种(表1),适用于5g至150g的阿努兰;较大的动物可能需要不同的注射器和针片。注射的位置因一些需要肌肉内、腹内、下皮或内皮注射的激素而异(图7)。
以卵巢切除术为目的的手术是各种两栖动物获取卵母细胞用于胚胎学研究的常用方法。卵子切除术也可能用于人口控制和医疗问题,如卵子保留。在部分卵巢切除术的情况下,为研究目的进行卵母细胞收获,手术必须确保动物保持繁殖。PGF2+的管理在解决女性R.Muscosa的卵子保留方面显示出一些希望。在几个个体中,PGF2=导致先前保留的卵子完全沉积,但在其他个体中,只有部分沉积需要手动剥离才能去除所有卵子。虽然PGF2+可以替代在R.Mussa中保留卵子的手术,但其治疗其他两栖动物类似病理条件的能力需要特定物种的验证。当手术干预被授权给阿努兰或考达病人时,有必要在切口之前确保适当的麻醉平面。需要敏锐的观察技能来评估和监测本研究对每个分类的规范诱导和恢复反应。一旦熟悉特定的解剖学,适当的手术方法,血相变,温和的组织操作和适当的术后管理,生殖手术不会构成压倒性的障碍。
The authors have nothing to disclose.
娜塔莉·卡拉塔尤德感谢芭芭拉·达兰特博士在超声波方面给予的培训和帮助,并感谢S.A.(EISA)的Exploradora de Immuebles,感谢她为我在SDZG的副研究员职位提供财政援助。感谢Kylie Cane博士对手稿的评论,以及官方评论者(无论他们是谁)。感谢乔纳森·戴因我们的2018年夏季研究员,圣地亚哥动物园保护研究所提供的照片(图1A,B)。莫妮卡·斯图普斯感谢动物园和水族馆保护捐赠基金协会和迪斯尼世界保护基金为建立圈养的Necturus种群提供财政支持。此外,还通过两栖动物倡导者Iris de la Motte女士的私人捐款获得支助。感谢克里斯托弗·德坎特先生和马克·坎贝尔博士对这项研究的重大贡献。
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems | GE medical systems | GE logiq Book XP | Ultrasound |
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex | GE medical systems | 8C-RS (10 MHz) | Ultrasound probe |
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) | Mettler Electronics Corp CA | Sonigel | Ultrasound gel (water soluble, salt-free) |
Hormone | |||
Gonadotropin releasing hormone | BACHEM | 4012028 | synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate abbreviation: GnRH |
Lutenizing hormone releasing hormone | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4033013; L1898 | synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt; [D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate abbreviation: LHRH |
Human chorionic gonadotropin | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 | synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU) abbreviation: hCG |
Prostaglandin 2α | Sigma-Aldrich | P40424; | synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris; abbreviation: PGF2α |
Follicle-stimulating hormone | Sigma-Aldrich | F4021, F8174 | synonym: porcine, sheep abbreviation: FSH |
Progesterone | Sigma-Aldrich | 46665; P7556 | synonym: Vetranal; P4 water soluble abbreviation: P4 |
Pituitary extract | na | synonym: Check papers for amphibian species derivation abbreviation: PE |
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Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich | HOR-272; 493-10; 9002-70-4 | synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin abbreviation: PMSG |
Metaclopromide | Sigma-Aldrich | M0763 | synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide abbreviation: MET |
Lucrin | BACHEM; Sigma-Aldrich | 4033014; L0399 | synonym: Leuprorelin acetate abbreviation: Lucrin |
Lutalyse | Pfizer | synonym: PGF2α – Dinoprost tromethamine abbreviation: Lut |
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Pimozide | Sigma-Aldrich | P1793 | synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one abbreviation: PZ |
Amphiplex | see above | synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide abbreviation: GnRH + MET |
|
Ovopel | Ovopel | na | synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg) abbreviation: Ovo |
Ovaprim | Pentair aquatic eco-systems | Ova10 | synonym: Salmon gonadotropin + domperidone abbreviation: Ova |
Domperidone | Sigma-Aldrich | D122 | synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine abbreviation: DOM |