Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Rina Mogaki; Kou Okuro; Akio Arisaka; Takuzo Aida

doi:10.3791/58631

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Chemie

Photoactivatable 태그 갇힌된 분자 접착제를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 spatiotemporally 제어

Published: January 17, 2019

doi:

10.3791/58631

Rina Mogaki¹, Kou Okuro¹, Akio Arisaka¹, Takuzo Aida^1,2

¹Department of Chemistry and Biotechnology, School of Engineering,University of Tokyo, ²Riken Center for Emergent Matter Science

Summary

이 프로토콜에 갇힌된 분자 접착제 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌를 빛 트리거 설명 합니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속입니다.

Abstract

세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 다양 한 질병 치료에 효과적입니다. 여기, 우리를 사용 하 여 고객님의 핵 전 좌 빛 트리거 갇힌 분자 접착제 (^갇힌접착제-R) 태그, 그 여러 guanidinium 이온 (⁺번) 펜 던 트 (낙 산 염 대신 음이온 photocleavable 그룹에 의해 보호 됩니다 설명 nitroveratryloxycarbonyl; ^바 NVOC)입니다. ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 세포 및 endosomes. 그러나, photoirradiation, 시 ^{우리에 갇힌}접착제-R uncaged 분자 접착제 (^Uncaged접착제-R) 여러 번⁺펜 던 트를 들고 endosomal 탈출 및 손님 들의 후속 핵 전 좌 용이로 변환 됩니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속 때문에 태그 손님 세포질 세포 핵 다음으로 마이그레이션할 수 있습니다 경우에만 photoirradiated. ^갇힌 접착제-R 태그는 작은 분자 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 양자 점 (QDs) 등을 제공할 수 있습니다. ^갇힌 접착제-R 태그는 자외선 뿐만 아니라 조직에 깊이 침투 수 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛으로 갇힌 수입니다.

Introduction

유전 정보를 전달, 세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 암 등 다양 한 질병 치료에 효과적 이며 유전 장애¹^,²^,³. 약물의 핵 전달, 펩 티 드의 활용 태그 같은 핵 지 방화 신호 (NLS)⁴^,^,⁵⁶ 광범위 하 게 조사 되었습니다. 그러나, 원치 않는 부작용을 줄이기 위해 핵 전 좌의 spatiotemporal 제어 필요 하다.

이전, 빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵에 갇힌된 NLS⁷^,^,⁸⁹를 사용 하 여 달성 되었습니다. NLS 세포질 수송 단백질⁶에 바인딩하여 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 보고 방법에 갇힌된 NLS 베어링 이용 단백질 직접 microinjection⁸ 세포질에 통합 또는 유전자 코드 확장 기법⁹를 사용 하 여 대상 셀에 표현. 따라서, 세포질 통풍 관 및 사진 유도 핵 전 좌를 얻을 수 있는 방법을 실용적인 응용 프로그램에 대 한 유리 하다.

여기, 우리 수지상 갇힌된 분자 접착제 (^{우리에 갇힌}접착제-R, 그림 1) 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 빛 트리거 설명 합니다. 수용 성 분자 접착제¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,^,¹⁷¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² ^, ²³ 여러 번⁺ 펜 던 트 베어링 이전 개발 되었습니다는 단단히 단백질¹¹^,¹²^,¹³^,^,¹⁴¹⁵^{, 준수} ¹⁶^,¹⁷, 핵 산¹⁸^,^,¹⁹²⁰, 인지질 막²¹및 찰 흙 nanosheets²²^,²³ 통해는 그들의 구⁺ 펜 던 트 및 대상에 oxyanionic 그룹 사이의 여러 염 다리의 형성. ^{우리에 갇힌}접착제-R의 구⁺ 펜 던 트 음이온 photocleavable 그룹, 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC)에 의해 보호 됩니다. ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 및 endosomes (그림 2)에서 세포. Photoirradiation에 ^바NVOC 그룹의 ^{우리에 갇힌}접착제-R는 uncaged 분자 접착제 (^Uncaged접착제-R) 여러 번⁺ 펜 던 트를 들고 다음 태그 이용의 마이그레이션을 용이 하 게 하를 떨어뜨려합니다 에 세포질 세포 핵 (그림 2)에 의해 따라. ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그는 UV 또는 심각한 phototoxicity 없이 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛에 노출에 의해 갇힌 수입니다. 양자 점 (QDs) 및 형광 염료 (nitrobenzoxadiazole;를 사용 하 여 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그, 작은 분자의 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 spatiotemporally 제어 핵 전달 설명 NBD), 예제로 각각.

^{우리에 갇힌}접착제-R.의 도식 구조를 그림 1: 9 guanidinium 이온 (⁺번) 펜 던 트 ^{우리에 갇힌}접착제-R의 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) 그룹에 의해 보호 됩니다. ^BANVOC 그룹은 UV 또는 2 광자 NIR 빛 조사에 의해 죽 습. ^{우리에 갇힌}접착제-R의 초점 핵심은 공업화 nitrobenzoxadiazole (NBD) 또는 dibenzocylooctyne (DBCO). 참조²⁰허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 고객님의 핵 전 좌 빛 발생의 개요 그림 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그 활용. 손님이^{우리에 갇힌}접착제-R 공액 생활으로 채택 / 셀 통해 endocytosis. Photoirradiation에 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그는 태그의 endosomal 탈출을 용이 하 게 수 한 ^Uncaged접착제-R 태그를 감 금. 그 후, 태그 이용 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 참조²⁰허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

1. 준비 갇힌접착제-R와 함께 고객님의 태그 우리에 갇힌접착제 NBD 솔루션을 준비 합니다. 우리에 갇힌접착제-NBD (그림 1) 다음 절차를 앞에서 설명한20음성 합성. 우리에 갇힌접착제-NBD (10mm) 건조 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 재고 솔루션을 준비 합니다.참고: 어둠 속에서 재고 솔루션을 저장 합니다. 솔…

Representative Results

Photoirradiation, 전에 우리에 갇힌접착제 NBD와 incubated Hep3B 세포 전시 그들의 내부에서 punctate 형광 방출 (λext = 488 nm; 그림 4A 고 4 C, 녹색). 유사한 현미경 사진 543에서 여기에 얻은 우리에 갇힌접착제 NBD는 endosomes에 지역화 나타내는 빨간색 형광 염료 (그림 4B , 4c, 빨간색)에 대 한 …

Discussion

빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵으로의 이전 조사 갇힌된 NLS⁷^,^,⁸⁹를 사용 하 여 달성 되었습니다. 앞에서 설명 했 듯이, 이러한 방법을 세포질에 NLS 태그 단백질 통합을 추가 기술 해야 합니다. 반면, 우리의 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그 사진 유도 핵 전 좌 뿐만 아니라 손님 들의 세포질 통풍 관을 수 있습니다. 이 ^우?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 NanoBio 통합, 도쿄의 대학에 대 한 중심을 인정합니다. 이 작품은 특정 여 대 한 젊은 과학자 (B) (26810046)를 ko로 부분적으로에서 및 지원 특정 특별히 승진 연구 (25000005)에 대 한 T.A. R.M. 덕분에 일본 사회 연구 장학 과학 (JSP의 승진에 대 한 ) 젊은 과학자와 최고의 대학원 (GPLLI) 프로그램에 대 한.

Materials

Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm

Referenzen

Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemie. 48, 6571-6584 (2009).
Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

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Mogaki, R., Okuro, K., Arisaka, A., Aida, T. Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags. J. Vis. Exp. (143), e58631, doi:10.3791/58631 (2019).