التلاعب الجيني البصري للدوائر العصبية أثناء مراقبة حالات النوم/اليقظة في الفئران
Summary
هنا، ونحن نصف أساليب التلاعب البصريات لأنواع معينة من الخلايا العصبية أثناء رصد حالات النوم / اليقظة في الفئران، وتقديم عملنا الأخير على نواة السرير من المحطة الطرفية stria كمثال.
Abstract
في السنوات الأخيرة، تم استخدام علم الوراثة البصرية على نطاق واسع في العديد من مجالات البحث العلمي العصبي. في كثير من الحالات، يتم التعبير عن opsin، مثل قناة رودوبسين 2 (ChR2)، من قبل ناقلات الفيروس في نوع معين من الخلايا العصبية في مختلف الفئران سائق Cre. يتم تشغيل تفعيل هذه opsins عن طريق تطبيق النبضات الخفيفة التي يتم تسليمها عن طريق الليزر أو الصمام من خلال الكابلات البصرية، ويلاحظ تأثير التنشيط مع دقة الوقت عالية جدا. التجارب قادرة على تحفيز الخلايا العصبية بشكل حاد في حين رصد السلوك أو نتيجة فسيولوجية أخرى في الفئران. علم الوراثة البصرية يمكن أن تمكن استراتيجيات مفيدة لتقييم وظيفة الدوائر العصبية في تنظيم حالات النوم / اليقظة في الفئران. هنا نقوم بوصف تقنية لدراسة تأثير التلاعب الجيني البصري للخلايا العصبية ذات الهوية الكيميائية المحددة أثناء تخطيط الدماغ الكهربائي (EEG) ومراقبة الكهربائي (EMG) لتقييم مرحلة نوم الفئران. على سبيل المثال، نحن نصف التلاعب من الخلايا العصبية GABAergic في نواة السرير من المحطة الطرفية (BNST). الإثارة البصريات الحادة من هذه الخلايا العصبية يؤدي إلى الانتقال السريع إلى اليقظة عند تطبيقها أثناء النوم NREM. يمكن تطبيق التلاعب الجيني البصري جنبا إلى جنب مع EEG / EMG تسجيل لفك الدوائر العصبية التي تنظم حالات النوم / اليقظة.
Introduction
النوم ضروري للوظيفة المعرفية المثلى. وتشير النتائج الأخيرة أيضا إلى أن الاضطرابات في النومترتبط مع مجموعة واسعة من الأمراض 1،2،3. على الرغم من أن وظائف النوم لم يتم حلها حتى الآن إلى حد كبير، وقد أحرز تقدم كبير في الآونة الأخيرة في فهم الدوائر العصبية والآليات التي تتحكم في حالات النوم / اليقظة4. في الثدييات، هناك ثلاث حالات من اليقظة: اليقظة، وحركة العين غير السريعة (NREM) النوم، وحركة العين السريعة (REM) النوم. يتميز اليقظة بتذبذبات EEG سريعة (5-12 هرتز) من السعة المنخفضة مع النشاط الحركي الهادف والمستدام. يتم تعريف النوم NREM عن طريق التذبذبات بطيئة (1-4 هرتز) من السعة العالية (موجات دلتا)، مع عدم وجود الوعي والنشاط الحركي هادفة. يتميز النوم REM من التذبذبات سريعة نسبيا (6-12 هرتز) من السعة المنخفضة والعضلات الثنائية كاملة تقريبا atonia5.
اقترح بوربلي نظرية تنظيم النوم واليقظة المعروفة باسم نموذج العملية اثنين6،7. عملية المثلية، ويشار إليها أيضا باسم عملية S، يمثل ضغط النوم الذي يتراكم أثناء اليقظة ويتبدد أثناء النوم. وثمة عملية أخرى، يشار إليها بالعملية جيم، هي عملية سيركادية، وهو ما يفسر سبب تقلب مستويات اليقظة في دورة 24 ساعة. بالإضافة إلى هاتين العمليتين، العوامل الساكنة هي أيضا مهمة لتنظيم النوم / اليقظة8،9. وتشمل العوامل الساكنة الحالات الغذائية والعاطفة. عادة ما يصاحب الخوف والقلق زيادة في الإثارة جنبا إلى جنب مع استجابات اللاإرادي والغدد الصماء العصبية10،11،12. ويعتقد أن النظام الحوفي يلعب دورا في تنظيم الخوف والقلق، وقد درست على نطاق واسع الآليات الكامنة وراء استجابات اللاإرادي والغدد الصماء العصبية، ولكن المسار الذي يؤثر النظام الحوفي على حالات النوم / اليقظة لم تم الكشف عنها حتى الآن. وقد اقترح عدد كبير من الدراسات الحديثة باستخدام علم الوراثة البصرية والدوائية أن الخلايا العصبية والدوائر العصبية التي تنظم حالات النوم / اليقظة يتم توزيعها في جميع أنحاء الدماغ، بما في ذلك القشرية، الصدارة القاعدية، المهاد، تحت المهاد، تحت المهاد، تحت المهاد، وجذع الدماغ. وعلى وجه الخصوص، سمحت لنا التطورات الأخيرة في علم الوراثة البصرية بتحفيز أو تثبيط دوائر عصبية محددة ذاتاستبانة مكانية وزمنية عالية. هذه التقنية سوف تسمح بالتقدم في فهمنا للركائز العصبية للنوم واليقظة، وكيف يتم تنظيم حالات النوم / اليقظة من قبل العمليات circadian، ضغط النوم، والعوامل اللاوستاتيكية، بما في ذلك العاطفة. تهدف هذه الورقة إلى إدخال كيفية استخدام التلاعب الجيني البصري جنبا إلى جنب مع تسجيل النوم / الاستيقاظ، والتي يمكن أن يكون لها القدرة على تحديث فهمنا للconnectomes والآليات في الدماغ التي تلعب دورا في تنظيم النوم NREM، نوم REM، واليقظة. فهم هذه الآلية التي ينظم النظام الحوفي حالات النوم / اليقظة هو ذو أهمية قصوى للصحة، لأن الأرق يرتبط عادة مع القلق أو الخوف من عدم القدرة على النوم (الخوف من النوم).
ويعتقد أن BNST تلعب دورا أساسيا في القلق والخوف. GAD 67-التعبير عن الخلايا العصبية GABAergic هي مجموعة كبيرة من السكان من BNST12،13. بحثنا تأثير التلاعب البصري لهذه الخلايا العصبية (GABABNST)على حالات النوم / اليقظة. واحدة من أعظم التطورات في علم الأعصاب في السنوات الأخيرة كانت الأساليب التي تمكن من التلاعب في الخلايا العصبية مع هويات كيميائية معينة في الجسم الحي، مع القرارات المكانية والزمنية العالية. علم الوراثة البصرية مفيد للغاية لإظهار الروابط السببية بين النشاط العصبي والاستجابات السلوكية المحددة14. نحن نصف علم الوراثة البصرية كوسيلة لدراسة الاتصال الوظيفي للدوائر العصبية المحددة في تنظيم حالات النوم / اليقظة. من خلال الاستفادة من هذه التقنية، تم تحقيق تقدم كبير في فهم الدوائر العصبية التي تنظم حالات النوم / اليقظة15،16،17،18،19 . في كثير من الحالات، يتم إدخال opsins على وجه التحديد في الخلايا العصبية مع هويات كيميائية معينة في مناطق الدماغ الانتقائية عن طريق مزيج من الفئران سائق كري ونقل الجينات Cre-inducible AAV بوساطة. وعلاوة على ذلك، التعبير البؤري للأوبسينات الحساسة للصورة مثل channelrhodopsin 2 (ChR2)20 أو archaerhodopsin (ArchT)21 جنبا إلى جنب مع نظام Cre-loxP أو Flp-FRT يسمح لنا بالتلاعب في السكان الخلايا العصبية الانتقائية ومحددة المسار العصبي22.
نحن نصف هنا التجارب على الخلايا العصبية GABAergic في BNST كمثال. للتعبير عن opsins في السكان الخلايا العصبية المعينة، وتستخدم الفئران سائق Cre المناسبة وناقلات الفيروس تعتمد على كري في كثير من الأحيان. وراثيا أو ضرب في خطوط التي يتم التعبير عن opsins في مجموعات الخلايا العصبية خاصة هي مفيدة أيضا. في التجارب التالية، استخدمنا GAD67-Cre ضرب في الفئران23 التي فقط الخلايا العصبية GABAergic التعبير عن Cre recombinase مع خلفية وراثية C57BL/6J، وناقلات AAV الذي يحتوي على ChR2 (hChR2 H134R) تنصهر مع EYFP أو EYFP كسيطرة مع “FLEx (الوجه الختان) التبديل”24. يصف الإجراء على وجه التحديد الإثارة البصرية الوراثية للخلايا العصبية GABAergic في BNST أثناء مراقبة حالات النوم / اليقظة25.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدمنا هنا طريقة لتقييم تأثير التحفيز البصري للخلايا العصبية مع هويات كيميائية معينة على انتقالات الدولة من النوم / اليقظة وأعطى مثالا على التلاعب الخلايا العصبيةGABA BNST. وأظهرت بياناتنا أن الإثارة البصريات من الخلايا العصبيةGABA BNST النتائج في الانتقال الفوري من النوم NREM إلى اليق…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظيت هذه الدراسة بدعم من برنامج دراسات المحققين في شركة ميرك (#54843)، ومنحة كاكينجي للبحوث العلمية في المجالات المبتكرة، و”ويل ديناميك” (16H06401) (T.S.)، ومنحة كاكينجي للبحوث الاستكشافية في المجالات الابتكارية (T.S.) (18H02595).
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
Referenzen
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?. Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. . Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
