优化干扰素伽隆弹性体检测在几内亚猪模型接种疫苗后 t 细胞反应

这里描述的所有方法都已得到马库拉布动物护理和使用委员会 (acuc) 的批准。 注: 该议定书要求使用潜在的危险材料。请参考制造商的 msds, 并在整个过程中佩戴适当的个人设备 (ppe)。 1. 制备豚鼠免疫部位、皮内注射人体和细胞注射-3p-p-程序 豚鼠治疗部位的准备。 将豚鼠放入诱导室, 并在5% 异氟醚蒸汽下麻醉。 将动物从腔内取出, 并将鼻锥放置在适当的位置, 提供2% 的异氟醚蒸汽, 以在整个过程中保持麻醉。 腹部约4厘米2的沙区。 用乙醇棉签消毒剃须区域。 注射 pna 配方和电穿孔程序。 使用胰岛素注射器, 通过曼图克斯技术将100μl 制剂注射到真皮中。针入斜面在 10 度角与动物的身体。 取出针头, 立即在注射轮上插入 cellectia/3p 电极阵列, 并应用电场。 从麻醉中取出动物并监测其恢复情况。 2. 非终末出血 麻醉豚鼠颈静脉采血。 将豚鼠放置在诱导室和麻醉动物, 如1.1.1 所述 使用带有27g 半英寸针头的3毫升注射器, 标点符号麻醉动物的颈静脉, 并收集3毫升血液。 立即将血液转移到 k2edta 采血管中, 多次倒置管, 将血液与抗凝剂混合, 放在冰上。注: 避免血液凝集是成功的血液样本下游处理的关键。 监控动物的恢复。 3. 血液样品处理 密度梯度离心法分离全血多溴联苯 稀释血液 1: 1 与汉克的平衡盐溶液 (hbss)。注: 为了避免污染, 从这里开始的所有工作都应在生物安全柜中使用无菌技术进行。 层稀释血液逐渐超过4.5 毫升的菲科勒-帕克加在一个15毫升锥形管。避免对接口的干扰。注: 为确保正确分离, 菲科尔-帕克必须在室温下。 离心管以 800 rcf 的速度, 30分钟, 刹车关闭。注: 作为替代方法, seppat™管 (stemcell 技术) 可用于 pbmc 分离。hbs 稀释后的血液被添加到15毫升的 sepmate 管中, 充满3.5 毫升的 Ficoll-Paque plus, 然后以 1200 rcf 离心 10分钟 (刹车打开)。这种省时梯度离心技术具有相同的生存能力、细胞产率和斑点形成。 在 r10 介质 (10% (v/v) 中收获富碎涂层和稀释剂 (10% (v/v) 热失能 fbs 和 1% (v/v) pen/strep (rpmi1640 介质), 总体积为15毫升。 颗粒细胞在 450 rcf 离心5分钟。 用 r10 培养基清洗细胞两次。 在1毫升 r10 中重新悬浮细胞, 并将细胞悬浮液通过70μm 的细胞过滤器进入新的试管。 用色蓝染色计数细胞并确定活细胞的数量。 用 r10 培养基稀释细胞, 使每毫升1×10^6 活细胞浓度稀释。 4. 弹性板的制备和细胞刺激 96孔 elispot pvdf 膜板的涂层和块状井, 然后再播种 pbmc。 板材应经过60秒的预处理。乙醇预处理将导致较少的非特异点形成和斑点与改进的定义。注: 请格外小心, 确保完整的膜与 15μl 35% 乙醇接触。 60秒后, 每口井加入 150μl 1x pbs, 然后通过倒置板清空井。注: 乙醇预处理是非常时间敏感的。不要孵育超过60秒的井膜. 在手术的以下步骤中, 膜不得干涸。 用 250μl 1x pbs 清洗板三次, 每口井。 在 pbs 中捕获抗豚鼠 ifn-γ抗体 v-e4 的100μl·g_ 井涂料。 在4°c 下将板材至少孵化12小时。 加入 250μl·well pbs 三次清洗板。 在 pbs 中加入 200μl/井封堵剂 (10% (w/v) 和 2% (w/v) bsa, 在室温下孵育2小时。 用 250μl·well pbs 清洗板三次。 具有抗原特异性肽的板 pbmc, 正对照和负对照。 稀释 r10 中的蛋白肽池, 使其达到所需的最终肽浓度。 对样品中的 pbmc 进行检测。注: 先在 elispot 板中添加含有兴奋剂的介质, 然后再添加 pbmc 悬浮液。 加入50μl 的肽-r10 介质到指示的井。 对于负对照, 在 r10 中加入50μl 空肽制剂到指示的井中。 为了进行积极的控制, 在 r10 介质中加入 5μgsml concanavalin a (cona) 到指示的井中。 在所有油井中添加100μl 的 pbmc 细胞悬浮液 在37摄氏度的加湿5% 二氧化碳气氛中将板材加生18小时。注: 将 elispot 板放置在孵化器中的均匀表面机架上, 避免在孵化过程中对板产生任何干扰。 5. 干扰素伽马阳性点的检测 通过检测抗体和板材的发育进行孵化。注: 对于本节中的所有步骤, 不需要无菌技术。 小心地从孵化器中取出盘子, 并安全地清空水井。通过添加 250μl·well pbs 三次清洗板材。 加入 100μl·l/液2μml 生物基化检测抗豚鼠 ifn-γ抗体 n-g3 在阻断缓冲液中稀释。注: 过滤器 (22μm) 抗体溶液, 以减少背景。 在室温下用检测抗体进行2小时的孵化。 通过三次添加 250μlwell pbs 来丢弃上清液和清洗板。 加入 100μl/井的碱性磷酸酶 (alp) 共轭链霉素稀释在阻滞缓冲液中。注: 过滤器 (22μm) 溶液, 以减少背景。 在室温下, 用 ALP-Streptavidin 共轭孵育1小时。 通过两次添加 250μlwell pbs 来丢弃 ALP-Streptavidin 溶液并清洗板材, 并将板材倒置并将其涂在干净的纸巾上, 以消除多余的 pbs。 一次加入 250μlwell ultrapuredi 水清洗盘子, 并将盘子倒置并涂在干净的纸巾上, 以去除多余的水。 在每口井中加入100μl 的 bcip/nbt (小心) 基板溶液。注意: 如果吞咽、与皮肤接触或吸入, bcip/nbt 具有高度易燃和毒性。在使用之前, 请参阅 msds。 在室温下培养 20分钟, 不受光线影响。 用去离子水冲洗板4次。反转板和水龙头, 以消除多余的水。 从 elispot 板底部取出塑料排水, 并让板干燥。 手动量化斑点或使用自动 elispot 读取器, 例如 ctl-免疫壶 s6 板读取器。