Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Katherine Schultheis; Hubert Schaefer; Holly M. Pugh; Bryan S. Yung; Janet Oh; Jacklyn Nguyen; Laurent Humeau; Kate E. Broderick; Trevor R.F. Smith

doi:10.3791/58595

JoVE Journal > Immunology and Infection

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Immunologie und Infektion

예방 접종 후 기니 돼지 모델에서 측정 T 세포 응답에 최적화 된 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과

Published: January 20, 2019

doi:

10.3791/58595

Katherine Schultheis¹, Hubert Schaefer², Holly M. Pugh¹, Bryan S. Yung¹, Janet Oh¹, Jacklyn Nguyen¹, Laurent Humeau¹, Kate E. Broderick¹, Trevor R.F. Smith¹

¹Inovio Pharmaceuticals, Inc, ²Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria,Robert Koch Institute

Summary

기니 돼지 PBMCs에 대 한 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과 개발 전염병 연구이 관련성이 높은 모델 T 세포 응답의 특성을 수 있습니다. 우리는 DNA 백신의 피부 전달과와 관련 된 T 세포 응답을 측정 하는 분석 결과 적용 했습니다.

Abstract

기니 피그 결핵, 인플루엔자, 디프테리아, 바이러스 성 출혈 열 등 전염병에 대 한 백신의 개발에 관련 된 작은 동물 모델로 서 중추적인 역할을 담당해 왔습니다. 우리 피부에 플라스 미드 DNA (pDNA) 백신 배달 기니 피그에서 강력한 체액 응답을 elicits 설명 했다. 그러나,이 동물 모델 면역 응답을 사용 가능한 시 약 및 T 세포 응답을 공부 하는 프로토콜의 부족으로 인해 과거에 다소 제한 되었다. T 세포 immunoprophylactic와 immunotherapeutic 메커니즘에 중추적인 역할을 한다. T 세포 응답을 이해 하는 것은 전염 성 질환 및 종양 백신 및 수용 전달 장치 개발에 대 한 중요 합니다. 여기는 기니 피그 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)에 대 한 인터페론 감마 (IFN-γ) 효소 연결 된 immunospot (ELISpot) 분석 결과 설명합니다. 분석 결과이 중요 한 설치류 모델에서 백신 관련 T 세포 응답의 특성 연구를 수 있습니다. 말 초 혈액에서 분리 된 세포를 시험 하는 기능 개별 동물에서 immunogenicity를 추적 하기 위해 기회를 제공 한다.

Introduction

여기에 설명 된 프로토콜 Hartley 기니 피그에서 수확 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 인구에 항 원 리콜 후 (IFN-γ) 은닉 세포 인터페론-감마의 검색 수 있습니다. 우리는 활동 및 기니 피그에는 인플루엔자 예방 접종-처방에 항 원 특정 T 세포 응답의 크기 특성 분석 결과 적용 했습니다. 이 프로토콜이 관련성이 높은 동물 모델에서 예방 접종 프로그램의 전 임상 개발 추진 크게 생각 합니다.

T 셀 백신에 의해 elicited 전염 성 요원 및 다른 질병와 관련 된 immunotherapeutic 경로 대 한 보호에 중요 한 역할을 한다. 여러 백신 연구에서 T 세포의 중요성 강조 되었다. 흰 족제비와 H5 조류와 병 적 상태와 사망률의 중요성을 나타내는 항 체를 중화의 부재에는 인플루엔자 바이러스도 전에 N1 제공 응집 방지에 대 한 인코딩 플라스 미드 DNA (pDNA)와 쥐의 면역 T 세포 면제¹. 이외에 체액 반응, 중화 강한 T 세포 역할 중요 한 바이러스 정리² 뿐만 아니라 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)와 감염 으로부터 보호에 대 한 마우스³. 인간에서는, 기존의 CD8 + T 세포 2009⁴에 유행 성 H1N1 동안 감소 질병과 관련 된 했다. 특정 cytokine 플라즈마 농도 함께 CD4 + T 세포 수는 RSV 감염 어린이⁵질병의 심각도와 상관 된다.

기니 피그는 실험실 모델 연구와 피부 민감성, 영양 연구, 청각 시스템의 고,이 작품은, 감염 증에 대 한 가장 관련성이 높은 연구 의학의 다양 한 분야에서 개발에 대 한 굴지를 얻고 있다. 그것은 결핵, 디프테리아에 대 한 백신 발견을 위한 중요 한 했다. 최근에 기니 돼지 인플루엔자⁶ 와 에볼라⁷에 대 한 모델로 사용 됩니다. 또한, 인간의 피부⁸생리 적 유사성을 보유, 기니 돼지 피부 약물 전달 방법에 대 한 액세스 작은 동물 모델을 제공 합니다. 실험실 모형으로 그것의 중요성, 달리 기니 피그 특정 분석 및 프로브 면역 반응 특성의 가용성 제한⁹남아 있습니다. 기본적인 세포 분석 실험에서 IFN-γ 효소 연결 된 immunospot (ELISpot 분석 결과) 정기적으로 T 세포 응답을 열거 하기 위해 전 임상 및 임상 연구에 사용 되는 등 사용할 수 되지 않았습니다.

첫 번째 고체 상 효소 연결 된 immunospot 분석 실험 다양 한 B 세포 인구¹⁰^,¹¹에 특정 항 체 은닉 세포의 수를 결정 하기 위해 사용 되었다. 은닉 cytokines 일리노이-1, 일리노이-2를 포함 한 셀을 검출 하는 형식 고급 일리노이-4, IL-5, 일리노이-6, 일리노이-10, GM-CSF, TNF-알파, TNF-베타, granzyme B, 그리고 IFN-γ. ELISpot 분석 결과 소유한 다 높은 감도를; 잠재적으로 각 cytokine 생산 셀을 검색할 수 있습니다. 100000 PBMCs¹²당 10 명소 보다 낮은 ELISpot 분석 실험에 대 한 검색의 제한 보고 되었습니다. 최근 기니 돼지 IFN-γ 특정 항 체 쌍 수¹³, 되었다 그리고이 분야에서이 부족을 해결 하기 위해 기회를 열었습니다.

IFN-γ에 적합 한 면역 반응; 중요 한 이펙터 분자 간주 됩니다. 그것은 생산 고 활성화 시 CD4, CD8 T 세포에 의해 분 비 될 수 있습니다. IFN-γ는 넓은 어 MHCII 식 생물의 범위 (MHC) 바이러스 감염, 대 식 세포의 활성화 등 중요 한 조직 적합성 복잡 한의 규제 하는 면역 반응의 맥락에서 기능. 그것은 또한 B 세포 분화를 촉진, T-도우미-2 세포 성장을 억제 하 고 자연 킬러 세포를 활성화 합니다. IFN-γ는 감염 된 체세포와 MHC 분자의 upregulates 표현에 바이러스 성 복제를 차단합니다. 따라서, IFN-γ의 생산은 백신 이나 병원 체에 대 한 T 세포 응답의 품질에 대 한 매우 중요 한 표시 이다.

여기 제시 IFN-γ ELISpot의 중요 한 측면 보다는 splenocytes PBMCs¹³의 사용 이다. 하지만 splenocytes의 컬렉션 해야 비장의 수확 전에 동물 euthanization PBMCs 터미널이 아닌 수집 된 혈액 샘플을 처리 하 여 얻을 수 있습니다. PBMCs의 사용 기간 및 총리-부스트 regimens¹⁴같은 T 세포 응답에 미치는 영향 평가 모니터링 IFN-γ T 세포 응답 수 있습니다.

현재 동물 모델로 서 기니 피그를 사용 하는 연구자, IFN-γ ELISpot 방법 얻을 수 있는 과학적인 데이터의 범위를 확대 됩니다. 가용성 지금 세포질 응답의 검사 시 약 가용성으로 인해 이전에 선택한 대상 질병에 대 한 관련성이 적은 동물 모델 연구를 실시 필요성을 줄일 수 있습니다. PBMCs 보다는 비장 또는 림프절의 사용 비 터미널 실험 및 개별 동물의 연속적인 모니터링에 대 한 수 있습니다.

아래 우리 pDNA 백신 기니 피그에서 IFN-γ 세포질 응답의 탐지에 관련 된 단계에 대 한 자세한 설명을 제공합니다. 우리는 우리의 특정 배달 절차를 약술 하 고 혈액 샘플링, 혈액 처리, PBMC 수확, 시험 절차, 및 데이터 분석을 포괄 하는 일반 ELISpot 분석 결과 설명. ELISpot 분석 실험의 회로도 그림 1에 묘사 된다.

그림 1 : 기니 돼지 ELISpot 프로토콜의 개요 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC)의 Acculab에 의해 승인 되었습니다. 참고: 프로토콜 잠재적인 유해 물질 사용을 해야합니다. 제조 업체의 MSDS를 참조 하 고 적절 한 절차를 통해 개인 장비 (PPE)를 착용 하십시오. 1. 기니 피그 면역 사이트, 피부 Mantoux 주입 및 CELLECTRA-3 P-EP-절차의 준비 기니 피그에 치료 사이트의 준비. 기니 돼지 유도 챔버를 놓고 5% anaesthetize Isoflurane 증기. 상공에서 동물을 제거 하 고 위치를 제공 하는 절차를 통해 마 취를 유지 하기 위해 2 %Isoflurane 증기에 코 콘 장소. 약 4 cm2 복 부 측면의 영역을 면도. 에탄올-면봉으로 면도 영역을 치료. PDNA-수립 및 electroporation 절차 주입 Mantoux 기술에 의해 피부에 100 µ l 배합을 주입 하는 인슐린 주사기를 사용 합니다. 바늘 삽입 됩니다 동물의 시체와 함께 10도 각도로 경사. 바늘을 제거 즉시 주입 wheal에 걸쳐 CELLECTRA®-3 P 전극 배열 삽입 하 고 전기 분야를 적용. 마 취에서 동물을 제거 하 고 복구를 모니터링 합니다. 2. 비-터미널 피 Anaesthetized 기니 돼지의 경 정 맥에서 혈액 컬렉션입니다. 기니 돼지 유도 챔버를 놓고 1.1.1에 설명 된 대로 동물을 anaesthetize 27G 1/2 인치 바늘 3 ml 주사기를 사용 하 여, anaesthetized 동물의 경 정 맥을 끊다 고 3 ml의 혈액을 수집 합니다. K2EDTA 혈액 컬렉션 튜브에 혈액을 즉시 전송, 혈액 항 응고 제와 얼음에 섞어 여러 번 튜브를 반전.참고: 혈액 응고의 혈액 샘플의 성공적인 다운스트림 처리를 위해 결정적 이다. 동물의 복구를 모니터링 합니다. 3. 혈액 샘플 처리 밀도 기울기 원심 분리에 의해 전체 혈액에서 PBMCs의 분리 1: 1로 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 혈액을 희석.참고: 모든 일에 여기에서 오염을 피하기 위하여 수행 되어야 한다 무 균 기술을 적용 하는 Biosafety 내각에서. 레이어 15 ml 원뿔 튜브에 혈액 이상 점차적으로 4.5 ml Ficoll-Paque 플러스 희석. 인터페이스의 방해를 하지 마십시오. 참고: 적절 한 분리 되도록 Ficoll-Paque 실 온에서 수 있어야 합니다. 해제 브레이크를 가진 30 분 800 rcf에 튜브를 원심.참고: 대안, SepMate™ 튜브 (STEMCELL 기술) PBMC 분리에 대 한 사용 될 수 있습니다. HBSS 희석 혈액 15 ml SepMate 튜브 3.5 ml 가득에 추가 Ficoll-Paque 플러스와 다음 10 분 (브레이크에) 1200 rcf에 centrifuged. 이 시간 절약 그라데이션 원심 분리 기술은 동등한 생존, 셀 생산량 및 자리 형성 결과. 버 피 코트 레이어를 수확 하 고 R10 매체에 희석 (10% (v/v) 열-비활성화 FBS 1% (v/v) 펜/Strep RPMI1640 매체에) 15 ml의 총 볼륨을. 5 분 동안 450 rcf에 centrifuging 여 펠 릿 세포. 셀 R10 매체와 두 번 씻는 다. 다시 1 ml R10 셀을 일시 중단 하 고 새 튜브를 70 µ m에 셀-여과기를 통해 세포 현 탁 액을 전달 합니다. 셀 고 Trypan 푸른 얼룩에 의해 라이브 셀의 수를 결정 합니다. 1 x 10의 농도에 R10 매체와 셀 희석 ^ ml 당 6 라이브 셀. 4. ELISpot 접시와 세포 자극의 준비 PBMCs를 뿌리기 전에 96 잘 ELISpot PVDF 막 접시의 코트와 블록 스 접시는 60 초 동안 미리 치료 해야 합니다. 에탄올 전처리 덜 난다 자리 대형 그리고 향상 된 정의 명소 발생 합니다.참고: 완전 한 막 15 µ l 35%의 접촉으로 온다 있도록 여분의 주의 에탄올. 60 초 후 음, 당 150 µ l 1 x PBS를 추가 하 고 번호판을 반전 하 여 우물 밖으로 비우십시오.참고: 에탄올 전처리는 매우 민감한. 이상 60 초 막 절차의 다음 단계 동안 건조 하지 해야 합니다 잘 막 품 어 하지 마십시오. 잘 당 세 번 250 µ l 1 x PBS 가진 접시를 씻어. PBS에서 IFN-γ 항 체 V-E4 100 µ l/잘 5 µ g/ml 캡처 방지 기니 피그의 코트. 적어도 12에 대 한 번호판을 품 어 4 ° c.에 시간 추가 250 µ l/잘 PBS 세 번 하 여 접시를 씻어. 200 µ l/잘 차단 버퍼 (10% (w/v) 자당 및 2% (w/v) BSA PBS에)를 추가 하 고 실 온에서 2 시간 동안 품 어. 워시 250 µ l/잘 PBS와 번호판 세 번. 항 원 특정 펩 티 드, 긍정적이 고 부정적인 컨트롤와 플레이트 PBMCs. 단백질-펩타이드 수영장 R10에서 원하는 최종 펩 티 드 농도 희석. Triplicates에서 샘플 PBMCs 시험참고: ELISpot 번호판 자극 매체를 먼저 추가 하 고 두 번째 PBMC 정지를 추가 합니다. 표시 된 웰 스 펩 티 드-R10 매체의 50 µ l를 추가 합니다. 부정적인 통제 표시 된 우물에 R10 50 µ l 빈 펩 티 드 배합 추가. 긍정적인 통제 표시 된 우물에 R10 매체 5 µ g/ml Concanavalin A (ConA) 추가. 모든 우물에 PBMC 세포 현 탁 액의 100 µ l를 추가 18에 대 한 37 ° 섭씨에서 습도 5 %CO2 분위기에서 접시를 품 어 시간.참고: 장소 ELISpot 인큐베이터에도 표면/선반에 격판덮개 및 플레이트의 인큐베이션 기간 동안 어떠한 방해를 피하기 위해. 5. 인터페론-감마 긍정적인 명소의 탐지 탐지 항 체 및 플레이트 개발 가진 외피입니다.참고:이 섹션의 모든 단계 없이 무 균 기술이 필요 합니다. 인큐베이터에서 접시를 조심 스럽게 제거 하 고 안전 하 게 우물을 빈. 3 시간 동안 250 µ l/잘 PBS를 추가 하 여 접시를 씻어. 2 µ g/ml biotinylated 탐지 방지 기니 피그 IFN-γ 항 체의 N-g 3은 희석 100 µ l/잘 차단 버퍼에 추가 합니다.참고: 필터를 줄이기 위해 배경 (22 µ m) 항 체 솔루션입니다. 2 항 체 검출으로 품 어 실 온에서 시간. 추가 250 µ l/잘 PBS 세 번 하 여 표면에 뜨는, 세척 접시를 삭제 합니다. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)의 100 µ l/잘 추가-활용된 streptavidin 블로킹 버퍼에 희석.참고: 필터 (22 µ m) 솔루션을 줄이기 위해 배경. ALP Streptavidin 켤레와 실 온에서 1 시간에 품 어. ALP Streptavidin 솔루션을 삭제 하 고 두 번, 250 µ l/잘 PBS를 추가 하 여 접시를 세척 접시를 반전 하 고 깨끗 한 종이 타월에 대하여 blotting에 의해 초과 PBS를 제거. 추가 250 µ l/잘 초순 디 물 한 번, 격판덮개를 세척 하 고 접시를 반전 하 고 깨끗 한 종이 타월에 대하여 blotting에 의해 과잉의 물을 제거. 각 우물에 BCIP/NBT (주의) 기판 솔루션의 100 µ l를 추가 합니다. 주의: BCIP/NBT 높은 가연성 및 독성, 피부 접촉, 삼 킨 하거나 흡입 하는 경우 이다. 사용 하기 전에 MSDS를 참조 하십시오. 빛에서 보호 하는 실 온에서 20 분 동안 품 어. 플레이트 4 번 이온된 수와 린스. 접시를 반전 하 고 과잉의 물을 제거를 누릅니다. 플라스틱 배수 ELISpot 접시의 아래쪽에서 제거 하 고 건조 하 격판덮개를 허용. 수동으로 또는 자동된 ELISpot 리더, 예를 들어 CTL-Immunospot S6 플레이트 리더를 사용 하 여 명소를 계량.

Representative Results

여기에 제시 된 결과 다음 중요 한 단계의 중요성을 강조 하 고 설명된 최적화의 혜택을 확인이 프로토콜을 사용 하는 예상된 결과 대 한 참조 역할을 합니다. 밀도 기울기 원심 분리 후 3.1 프로토콜의 단계에서 설명한 대로 튜브의 하단에 빨간색 점성 액체 붉은 혈액 세포의 대부분을 포함 됩니다. 그림 2와 같이A, 붉은 혈액 세포 위에 밀도-중간의 레이어. 상단에 명확 하 고 또는 노란색 플라즈마 층 및 밀도 사이의 그라데이션 매체는 백혈구 및 혈소판의 대부분을 포함 하는 흰색 또는 밝은 갈색 버 피 코트 계층 이다. 불완전 한 분리는 밀도 그라데이션 매체 위에 적혈구의 존재로 명단 것입니다. 그림 2A 에서 플라즈마의 빨간 채색은 아마 가장 혈, 때문이 혈액 샘플은 처리 되기 전에 컬렉션 튜브 1.5 h에에서 저장 되어 있는. 그림 2 B 표시 하기 전 (왼쪽) 그라데이션과 PBMC 절연 장치에서 (오른쪽) 원심 분리 후. 그림 2B 혈액 샘플 혈액 컬렉션 및 플라즈마 채색 노란색 후 최소한의 지연으로 처리 했다. 미리 에탄올 막 일로의 효과 (4.1 프로토콜의 단계 참조)에 자리 개발 그림 3에 표시 됩니다. 전 대우 웰 스 명소 표시 향상 된 정의 그리고 매체/DMSO 부정적인 제어 우물(그림 3)에 반점의 수에 있는 감소. 가공된 기니 돼지 PBMCs의 일반적인 생존 범위는 약 90% 이며 일반 15 mL 튜브와 PBMC 절연 장치 (그림 3B)에 대 한 유사. 3 mL 혈액 샘플에서 가능한 셀의 수익률은 일반적으로 3 x 106 와 5 x 106사이 범위. 플라스 미드 DNA H1N1 독감 긴장의 nucleoprotein (NP) 인코딩 동물 접종 했다 A/PuertoRico8. 그림 4 는 제시 IFN-γ T 세포 응답의 열거로 자리 형성 단위 (SFU) 예방 접종 요법의 기간에 걸쳐 생성 된. PBMCs 분석 결과 ELISpot 수확 예방 접종 비 동물에서 무시할 수 자리 수 (tx)에 있는 결과. (프라임), 첫 번째 접종 후 14 일 백만 PBMCs 당 970 IFN-γ 반점의 평균 면역성 자극 후 계산 했다. (부스트), 두 번째 접종 후 7 일 모든 3 개의 풀에 대 한 T 세포 응답 확장 되었다, 40-6 일 후에 두 번째 접종 (메모리), 6310 IFN-γ SFUs/10의 평균 총 5020 IFN-γ SFUs/106 PBMCs.의 평균에 도달 6 PBMCs 주변 혈액에 포함 되었습니다. 그림 전설: 그림 2 : 레이어 밀도 기울기 원심 분리 후의 대표 이미지. (A) 혈액 샘플을 하기 전 (왼쪽)과 일반 튜브에서 (오른쪽) 원심 분리 후. (B) 혈액 샘플을 하기 전 (왼쪽)와 PBMC 절연 장치에서 (오른쪽) 원심 분리 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 : 프로토콜 최적화. (A) 프로토콜에 따라 개발 IFN-γ 긍정적인 명소 잘 ELISpot 분석 결과 접시에서의 전형적인 모양입니다. 예 triplicate 웰 스 (오른쪽) 에탄올과 사전 치료 후 표시 됩니다 또는 사전 처리 (왼쪽) 없이. 셀은 알을 품을 하루아침에 아무 자극 컨트롤로 DMSO (위)와 일치 하는 항 원 펩 티 드 (중간), 또는 물질 ConA (아래). PBMCs 같은 개별 동물에서 유래입니다. 웰 스는 자동화 된 플레이트 스캐너를 사용 하 여 몇 군데 있었다. 처리 된 셀에 서로 다른 밀도-기울기 튜브의 (B) 비교. 3 mL 3 개인 기니 피그에서 혈액 샘플을 수집 했다. 각 샘플의 1.5 mL 일반 튜브 (밀도 그라데이션 매체) 또는 PBMC 절연 장치를 사용 하 여 처리 되었습니다. 생존 (왼쪽된, % ± SEM) 및 (오른쪽, x 106 ± SEM) 라이브 셀 개수는 자동 셀 시스템 및 trypan 블루 제외 분석 결과 계산을 사용 하 여 하는 것을 결정 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 : 예방 접종 처방의 과정을 통해 강력한 세포 면역 반응의 검출. 1과 15 일, 30 µ g pDNA 인코딩 인플루엔자 A nucleoprotein (NP)의 intra-dermally Hartley 기니 돼지 피부 electroporation 바로 뒤의 복 부 측면을 전달 했다. IFN-γ ELISpot 응답 두 번째 접종 후 14 일 (총리), 첫 번째 접종 후 7 일 (부스트)와 46 일 (메모리)를 측정 했다. 평균 SFUs + SEM 5 치료 기니 돼지와 2 치료 기니 피그 (tx)에 대 한 구성 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

기니 피그는 백신과 피부 전달 전략의 전 임상 개발을 위한 귀중 한 동물 모델입니다. 위의 프로토콜이 관련성이 높은 모델에서 항 원 특정 T 세포 응답을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 분석 결과 항 원 특정 펩 티 드와 자극에 따라 주변 T-세포 생산 인터페론-감마의 명확한 열거형을 제공합니다. 면역 반응의 속도 론 비 터미널 혈액 샘플링 하 여 모니터링할 수 있습니다.

우리는 프로토콜을 최적화 하 고이 분석 결과 사용 하 여 최적의 결과 얻기 위해 중요 한 측면을 식별. 예를 들어 컬렉션 튜브에 혈전의 형성 차선 PBMC 복구 및 생존에 발생 합니다. 기니 돼지 혈액 응고¹⁸매우 빠르게. 혈액 무승부를 신속 하 게 수행 하기 위해 결정적 이다. Au Birck 외. 기니 피그 모델¹⁶에 기술을 출혈에 대 한 포괄적인 가이드를 제공. 이후 혈액 컬렉션에는 전신 마 취 필요 합니다, 절차¹⁹의이 양상의 적용 가능한 표준 운영 절차를 검토 하는 것이 좋습니다. 충분 anaesthetized 기니 피그는 그들의 다리 또는 조직의 간단한 핀치 후 발성 손톱 또는 그들의 귀를 주 춤 하 고 그들의 수염이 그들의 귀를 곤란 하 게 한 후 앞으로 이동 하 여 그들의 발가락 사이 이동 하 여 반응 것 이다. 압 연 또는 반전 튜브 여러 번에 의해 철저 하 게 응고 제와 혼합 관으로 혈액의 즉시 전송이이 프로토콜에서 필수적인 단계 이다. 여기 설명 된 프로토콜에 대 한 EDTA 튜브 사용 했다, 그리고 다른 응고 시험 되었다. EDTA는 마, 튜브 이상적으로 채워져야 절반 이상이 전체, 그리고 따라서 적절 한 튜브 크기 샘플 볼륨을 사용 해야 합니다에 대 한 note 하시기 바랍니다.

제대로 수행 될 때 밀도 그라데이션 원심 일관 되 게 결과 깨끗 한 PBMC 준비. 원심 분리, 전에 그라디언트 레이어 링 때 밀도 그라데이션 중간 실내 온도에 있어야 하며 브레이크 일반 튜브를 사용 하는 경우는 원심 분리기를 중지에 대 한 사용할 수 없습니다. PBMC 처리의 실용성 측면에서 상당한 개선을 밀도 그라데이션 원심 PBMC 절연 장치와 조합 이었다. 원심 분리 시간 감소에 대 한 수 있습니다. PBMC 절연 장치에 밀도 그라데이션 원심 분리 및 유사한 생존에 일반 튜브 결과, 살아있는 세포 처리 PBMCs, 그리고 자리 대형의 계산합니다. 별거를 위해 사용 하는 튜브의 종류의 독립, 버 피 코트 수확 즉시 따라야 합니다. 시간의 연장된 기간 동안 밀도 그라데이션 매체와 접촉 하는 PBMCs 세포 독성입니다.

가능한 PBMCs의 정확한 계산 분석 결과 판 우물에 셀의 씨앗 일관 되 게 동일한 수에 중요 하다. 라이브/죽은 차별의 몇 가지 방법을 적용 한다. 우리 실험실에서 우리 trypan 블루 제외 분석 결과 및 자동된 셀 카운터를 사용합니다.

자동된 계산 시스템을 사용 하는 경우에 특히 날카로운 높은 대조 관광 명소로 정의 자리 품질 향상 된 정확도 일관성 있는 자리 계산 발생 합니다. 제조업체의 권장 사항을 따라 배경 관광 명소의 수를 절감 하 고 향상 관광 명소의 정의 중요 한 단계가 될 ELISpot 접시의 에탄올 사전 치료 관찰 합니다. 프로토콜의 끝 ELISpot 분석 결과 접시 이미지를 플레이트 리더를 사용 하 여가 좋습니다. 원본 이미지의 각 잘 쉽고 효율적으로 얻은 고 저장. 디지털 이미지 또한 객관적인 분석 및 개별 사업자 수동 계산에 비해 자리 계산을 허용 하는 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여.

여기서 설명 하는 분석 결과의 개발에 대 한 절대적인 필요성 적당 한 항 기니 피그 인터페론-감마 항 체 쌍의 생성 했다. 마우스 단일 클론 항 체 V-e 4와 N-g 3는 hybridoma-재조합 기니 피그 인터페론 감마²⁰접종 했다 쥐에서 B-세포 복제 기술에 의해 개발 되었다. V-E4, IgG1 isotype는, 및 N-g 3은, IgG2a는 바인딩할 네이티브 및 재조합 형 항 원에 모두 보고 됩니다. 탐지 항 체 샌드위치 ELISA 포맷에서 낮은 배경 신호를 유지 하면서 네이티브와 재조합 단백질에 대 한 높은 감도에서 결과 캡처 항 체 및 biotinylated N g 3로 V-e 4를 할당. 두 항 체는이 책의 공동 저자 박사 휴버트 쉐 퍼의 실험실에 의해 주도 제조 계약을 통해 과학적으로 지역 사회에 사용할 수 있습니다. 요청 받은 닥터 쉐 퍼의 연구소에 의해 고 상업 파트너에 의해 제조 됩니다.

인터페론-감마 정규 버퍼 또는 미디어²¹에서 안정 될 것으로 알려졌다. 쉐 퍼 외²⁰ IFN-y, 생물 학적 기능, 항 체 V-e 4와 N-g 3를 사용 하 여 애 란 형태로 잃었습니다 저하를 사용 하 여 복구 속도 적당 한 감소를 보고. 그러나, 이상의 18 h PBMCs의 펩타이드 자극의 부 화 시간이 증가 될 신중 하 게 테스트 해야 합니다.

PBMCs를 사용 하 여의 장점은 논의 되었습니다. 그러나, 여기 설명 된 분석 결과만 순환 주변에서 T-세포의 항 원 특정 응답을 반영 한다. 조직 침투 T 세포 또는 비장, 림프절 등의 림프 기관에서 격리 하는 셀 다른 속성²²^,^,²³²⁴전시 수 있습니다. PBMCs에서 인터페론-감마 명소와¹⁴같은 pNP 인플루엔자 백신 접종 했다 기니 피그에서 splenocytes의 비교 시 세포 응답에 중요 한 차이가 관찰 되었다.

이 프로토콜에서 우리 피부 예방 접종 절차를 설명합니다. ID 예방 접종에 대 한 주요 근거는 수지상 세포 피부²⁵에의 높은 밀도 타겟팅 하 고 있습니다. 우리와 다른이 세포 특히 전달 방법²⁶, 배합²⁷또는 약물 디자인²⁸적응 하 여 타겟팅 할 수 있습니다 나타났습니다. 활성화 전문 항 원 제시 세포 배출 림프 노드로 마이그레이션 하 고 적합 한 면역 계통²⁹^,³⁰^,^,³¹³²활성화 수 있습니다. 수지상 세포 못쓰게 생산 세포 면역 반응에 필수적인 항 프레 젠 테이 션 셀-유형입니다.

플라스 미드 DNA 인플루엔자 H1N1의 nucleoprotein 인코딩 동물 접종 했다이 연구에 대 한 변형 A/PuertoRico/8. (PNP) electroporation 함께에서이 pDNA 백신의 피부 전달 했다 기니 피그³³, 흰 족제비, 및 비 인간 대주교 (NHPs)¹^,³⁴항 원 특정 체액 응답을 이끌어내는 표시 되었습니다. 또한,이 백신이 표 피³⁵, 이러한 세포 인구에 대 한 특정 epitopes를 대표 하는 펩 티 드를 자극 하 여 c d 4와 CD8 T 세포에 기인 수로 배달 후 쥐에서 강력한 T 세포 응답을 elicited. PNP 백신 같이 체액 응답 토끼와 기니 피그, 쥐³⁶에서 세포 및 체액 응답의 세대에 의해 점 막 배달 후 면역성도 했다. 가장 최근에, 우리의 그룹 내부 근육 배달 (되지 않은 데이터) 후 토끼에 IFN-γT-세포 반응의 생성 증명 수 있었습니다.

현재, 기니 피그 ELISpot 관찰된 인터페론-감마 명소 CD4 + 또는 CD8 + T 세포 부분 집합에 할당할 수 없습니다. 특히 설계 및 피부를 대상으로 하는 면역 요법의 개발에 대 한 것이 매우 유용한 관찰된 인터페론-감마 자리 주파수는 1 개의 특정 부분 집합의 확장 또는에 둘 다의 균형된 응답 인해 발생 하는지 확인 하 크로스-프레 젠 테이 션을 실행 하는 예방 접종의 효과 평가 합니다. 이 제한 부정에 의해 극복 될 수 있습니다 내가 (CD8 응답) epitopes 제한 CD4 또는 CD8 세포 (CD4 반응)에 대 한 MHC 종류 II MHC 클래스의 식별 또는 접시에 뿌리기 전에 셀 정렬.

기니 돼지 PBMCs를 사용 하 여 여기 설명된 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과 해결 기니 돼지 실험실 모델에 세포질 응답의 과정을 평가 하기 위해 필요 합니다. 이 백신의 개발을 구체화 하 고 배달 프로토콜을 피부. 우리는 그것이 관련 동물 모델의 고용에 대 한 결핵³⁷, Ebola³⁸, HSV³⁹, 등 중요 한 T-세포 구성 요소와 질병을 공부하실 수 있습니다 믿습니다. 그것은 관련성이 적은 동물 모델의 사용을 줄일 것입니다.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 Inovio 제약 R & D 부서 기술 지원의 회원과 우수 축산 서비스를 제공 하기 위한 Acculab의 직원에 게 감사 하 고 싶습니다. 특히 우리는 Alysha Vu 및 조 아그네스 원고 교정 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 하지 공공, 상업, 또는 하지-위한-비영리 부문에 자금 지원 기관에서 어떤 특정 교부 금에 의해 투자 되었다.

Materials

Cellectra-3P	Inovio Pharmaceuticals		ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only
K₂EDTA blood collection tube	BD	367844
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
Ficoll-Paque Plus	GE Healthacre	17144003	density gradient medium
SepMate tube	STEMCELL Technologies	85415	PBMC-isolation device
RPMI	Thermo Fisher	11875-135
heat-deactivated FBS	VWR	97068-085
Pen/Strep	Gibco	15140-122
β-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023
96-well ELISpot PVDF-membrane	Millipore	MSIPS4W10	ELISpot assay plate
Ethanol	Sigma	459844-1L
UPDI	Invitrogen	10977-015	Ultra-Pure DI water
Sucrose	Sigma	S7903
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
10x PBS	HyClone	SH30378.03
Concanavalin A (ConA)	Sigma	C5275-5MG
alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin	R&D Systems Inc.	SEL002
BCIP/NBT	R&D Systems Inc.	SEL002
capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4	GenScript	Order #:U5472CE080-3	LOT # A217071153
biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3	GenScript	Order #:U5472CE080-1	LOT # A21700598
CTL S6 Micro Analyzer	ImmunoSpot	#S6MIC12	automated ELISpot plate reader
Vi-CELL XR	Beckman-Coulter	731050	automated cell counter
ImmunoSpot 5.1	ImmunoSpot		assay analysis software
ESCO Class II Type A2	ESCO		Biosafety cabinet
Falcon cell strainer	Corning, Inc.	VWR cat# 21008-952
Exel Comfort Point Insulin syringe	MedLab Supply	26028
Rotanta 460R	Hettich		centrifuge
Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit	Beckman Coulter	383722
Incu Safe	Panasonic-Healthcare		incubator
22µm Filter	ThermoScientific	VWR act# 597-4520	22µm Filter
KimWipes	Kimberly-Clark Professional	VWR cat# 21903-005	paper towels

Referenzen

Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517 (2008).
Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B. Animal Models of Ebolavirus Infection. Comparative Medicine. 67 (3), 253-262 (2017).
Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33 (2017).
Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
. Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide – CDC (Part One) Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013)
Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982 (2014).
Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
Flecknell, P., Flecknell, P. . Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). , 77-108 (2016).
Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210 (2015).
Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33 (2017).
Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123 (2013).
Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054 (2014).
Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257 (2017).

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Schultheis, K., Schaefer, H., Pugh, H. M., Yung, B. S., Oh, J., Nguyen, J., Humeau, L., Broderick, K. E., Smith, T. R. Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination. J. Vis. Exp. (143), e58595, doi:10.3791/58595 (2019).