Ottimizzazione del interferone-gamma ELISpot analisi di risposte a cellula T misura nel modello cavia dopo la vaccinazione

La cavia è un prezioso modello animale per lo sviluppo pre-clinico di vaccini e strategie di consegna intradermica. Il protocollo di cui sopra descrive la metodologia per misurare le risposte di cellule T antigene-specifiche in questo modello altamente pertinente. Il dosaggio fornisce un’enumerazione chiara di periferico T-cellule che producono interferone-gamma dopo stimolazione con peptidi di antigene-specifiche. La cinetica della risposta immunitaria può essere monitorata da prelievo di sangue non terminale.

Abbiamo ottimizzato il protocollo e identificato gli aspetti critici per ottenere risultati ottimali, usando questa analisi. Ad esempio, la formazione di coaguli di sangue nel tubo di raccolta si tradurrà in vitalità e non ottimale recupero PBMC. Cavia sangue coagula rapidamente¹⁸. È fondamentale eseguire rapidamente il tiraggio del sangue. Au-Birck et al. fornire una guida completa per spurgo tecniche nella cavia modello¹⁶. Poiché la raccolta di sangue richiede l’anestesia generale, si raccomanda di rivedere applicabili procedure operative standard di questo aspetto del procedimento¹⁹. Insufficientemente anestetizzati cavie reagirà spostando le loro gambe o vocalizzazione dopo un breve pizzico del tessuto tra le dita dei piedi con le unghie o batter ciglio le loro orecchie e spostando che loro baffi avanti dopo pizzicare loro orecchio. L’immediato trasferimento del sangue in una provetta con anticoagulante e mescolare accuratamente di rotolamento o invertendo il tubo più volte è un passo essenziale in questo protocollo. Per il protocollo descritto qui provette EDTA sono state usate, e non altri anticoagulanti sono stati testati. Siete pregati di notare che l’EDTA è ipertonica, tubi idealmente dovrebbero essere riempiti più di mezzo pieno e pertanto la dimensione di tubo appropriato per il volume del campione deve essere utilizzato.

Se eseguita correttamente, centrifugazione in gradiente di densità provoca costantemente pulito preparazione di PBMC. Il mezzo di pendenza di densità deve essere a temperatura ambiente quando il gradiente prima centrifugazione di stratificazione e freni non devono essere utilizzati per l’arresto della centrifuga quando si utilizzano tubi regolari. Un miglioramento significativo in termini di praticità di PBMC-trattamento era la combinazione di centrifugazione in gradiente di densità con dispositivi di PBMC-isolamento. Questo permette una riduzione del tempo di centrifugazione. Centrifugazione in gradiente di densità in dispositivi di PBMC-isolamento e tubi normali risultati simili attuabilità, cellule vive conteggi di PBMCs trasformati e la formazione di spot. Indipendentemente dal tipo di tubo usato per la separazione, il raccolto di buffy-coat deve seguire immediatamente. Nel corso di un periodo di tempo prolungato contatto con il mezzo del gradiente di densità è citotossico per i PBMCs.

Conteggio preciso delle PBMC praticabile è importante il numero costantemente uguale seme delle cellule ai pozzetti della piastra. Qualche metodo di live/dead discriminazione deve essere applicato. Nel nostro laboratorio, usiamo il test di esclusione del trypan blu e un contatore di cellule automatizzato.

Punto qualità, definiti come punti di contrastati sharp-edged e alte, si tradurrà in una migliore precisione e contando spot coerente, soprattutto quando si utilizza un sistema di conteggio automatico. In linea con le raccomandazioni del produttore, abbiamo osservato il pre-trattamenti etanolo delle piastre ELISpot per essere un punto cruciale per ridurre il numero dei punti di fondo e migliorare la definizione dei punti. Si consiglia vivamente l’uso di un lettore di piastra per il test ELISpot-piastre alla fine del protocollo di immagine. Immagini originali di ciascun pozzetto possono essere facilmente ed efficientemente acquisiti e memorizzati. Utilizzando un software di analisi di immagine immagini digitali permettono anche per analisi obiettiva e conteggio posto rispetto al conteggio manuale di singoli operatori.

Una necessità assoluta per lo sviluppo del test descritto qui è stata la generazione di un’adatta cavia anti-coppia di anticorpo di interferone-gamma. Anticorpi monoclonali di topo V-E4 e N-G3 sono stati sviluppati da ibridomi-tecnica con cloni di linfociti dai topi che sono stati immunizzati con cavia ricombinante interferone gamma²⁰. V-E4, che è dell’isotipo IgG1, e N-G3, ovvero IgG2a, sono segnalati per associare entrambi all’antigene ricombinante e nativo. Assegnazione di V-E4 come l’anticorpo di cattura e biotinilati N-G3 come l’anticorpo di rilevazione ha provocato ad alta sensibilità per la proteina ricombinante sia nativa mantenendo basso fondo segnale in un formato di sandwich ELISA. Entrambi gli anticorpi sono disponibili alla comunità scientifica attraverso un accordo di produzione ha condotto dal laboratorio del Dr. Hubert Schaefer, che è co-autore di questa pubblicazione. Le richieste saranno ricevute dal laboratorio del Dr. Schaefer e quindi prodotto da un partner commerciale.

Interferone-gamma è segnalata per essere instabile in regolari Buffer o media²¹. Schaefer et al.²⁰ segnalato solo una moderata diminuzione del tasso di recupero quando usando degradata IFN-y, che aveva perso la funzionalità biologica, in un formato di ELISA utilizzando anticorpi V-E4 e N-G3. Tuttavia, aumentando il tempo di incubazione di stimolazione del peptide di PBMCs oltre 18 h dovrebbe essere attentamente verificato.

I vantaggi dell’utilizzo di PBMCs è stato discusso. Tuttavia, il dosaggio descritto qui riflette solo risposte antigene-specifiche delle T-cellule nella periferia di circolazione. Tessuto-infiltrazione T-cellule o cellule isolate da organi linfatici, quali milza e linfonodi, possono presentare diverse proprietà^22,23,24. Dopo il confronto di punti di interferone-gamma da PBMCs e splenocytes dalle cavie che sono stati immunizzati con il vaccino di stessa influenza pNP¹⁴sono state osservate differenze significative in risposte cellulari.

In questo protocollo, abbiamo descritto una procedura di vaccinazione intradermica. Una logica principale per l’immunizzazione di ID di destinazione è l’alta densità di cellule dendritiche presenti nella pelle²⁵. Noi ed altri abbiamo indicato che queste cellule possono specificamente essere mirate, adattando il metodo di consegna²⁶, formulazione²⁷o droga-design²⁸. Le cellule presentanti l’antigene professionale attivate possono migrare ad un linfonodo drenante e attivare il sistema immunitario adattivo^29,30,31,32. Le cellule dendritiche sono antigene essenziale cellula-tipo di presentazione per l’innesco produttivo le risposte immunitarie cellulari.

Per questo studio, gli animali sono stati immunizzati con il plasmide DNA codificante la nucleoproteina di influenza H1N1 ceppo A/PuertoRico/8. Consegna della pelle di questo vaccino pDNA (pNP) in combinazione con elettroporazione aveva dimostrato di suscitare le risposte umorali antigene-specifica in cavie³³, furetti e primati non umani (NHPs)^1,34. Inoltre, questo vaccino ha suscitato robuste risposte a cellula T in topi dopo la consegna nell’epidermide³⁵, che potrebbe essere attribuito al CD4 e CD8 T-cellule stimolando con peptidi che rappresentano epitopi specifici per queste popolazioni cellulari. Il vaccino pNP era anche immunogenico dopo la consegna della mucosa, come dimostrato dalla generazione di risposte umorali in conigli e porcellini d’India, come pure le risposte cellulari e umorali in topi³⁶. Più di recente, il nostro gruppo era in grado di dimostrare la generazione delle risposte IFN-γT-cellula nel coniglio dopo la consegna intra-muscolare (dati non pubblicati).

Attualmente, le macchie di interferone-gamma osservate nella cavia ELISpot non possono essere allocate a un sottoinsieme di CD4 + o CD8 + T-cell. Soprattutto per la progettazione e lo sviluppo di terapie immunitarie della pelle di targeting, sarebbe molto utile per determinare se le frequenze osservate interferone-gamma sono causate da espansione di un particolare sottoinsieme o una risposta equilibrata di entrambi al fine di valutare l’efficacia della vaccinazione per innescare cross-presentazione. Questa limitazione potrebbe essere superata da negativo ordinamento delle cellule CD4 o CD8 prima della semina le cellule sulla piastra o di identificazione di MHC di classe II (per risposte CD4) o MHC di classe I (per risposte CD8) limitato epitopi.

Il dosaggio di interferone-gamma ELISpot descritto qui utilizzando cavia PBMCs risponde alla necessità di valutare il corso delle risposte cellulari nel modello di laboratorio di cavia. Consente di perfezionare lo sviluppo di vaccini e protocolli di recapito di pelle. Noi crediamo che permette per l’occupazione di questo rilevante modello animale per studiare le malattie con importanti componenti di cellula T come TB³⁷, Ebola³⁸, HSV³⁹e altri. Ridurrà l’utilizzo di modelli animali meno rilevanti.