Yumuşak Polysiloxane-üre elastomerler için göz içi Lens uygulama sentezi

Dikkat: Lütfen ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) kullanmadan önce danışın. İmmobilizasyonu içinde kullanılan çeşitli kimyasalların akut toksisite ve güçlü tahriş Inhalasyon yanı sıra, deri ve göz için sergi. Lütfen kişisel koruyucu donanımları (laboratuvar mont, koruyucu gözlük, el eldiven, tam uzunlukta pantolon ve kapalı-toe ayakkabı) ve kimyasallar, eğer mümkünse, bir duman başlık altında veya iyi havalandırılan bir yerde kolu. Duman başlık altında tüm immobilizasyonu gerçekleştirin. Tetramethylammonium hidroksit pentahydrate (TMAH): TMAH güçlü bir temel, akut toksik yutulması halinde, ve cilt teması, bu ciddi kimyasal yanıklar deri ve göz neden olur. Hava için duyarlı ve higroskopik. Soğutma ve azot altında saklayın. TMAH iyi havalandırılan bir yerde onun güçlü amonyak gibi koku yüzünden başa. APTMDS: APTMDS hava duyarlıdır ve azot altında depolanması gerekir. Şiddetli cilt yanıkları ve göz hasarı neden olur. H12MDI: H12MDI inhalasyon toksik ve deri ve göz tahrişe neden olur. D4: D4 doğurganlık bozabilen. THF: THF zararlıdır, tahriş Inhalasyon üzerinde neden olur ve muhtemelen kanserojen. Kloroform (CHCl3): CHCl3 inhalasyon, muhtemelen kanserojen zararlıdır, olası zarar doğurganlık ve doğmamış bir çocuk ve onun buharları uyuşukluğa neden olabilir. 1. katalizör ve Amino sonlandırılmış Polysiloxane Macromonomers sentezi Tetramethylammonium-3-aminopropyl-dimethylsilanolate katalizör senteziNot: Katalizör Hoffman ve Leir44tarafından bildirilen yöntemine göre sentez. Degas APTMDS önce vakum altında kullanın ve azot altında saklayın. Bir Ģırınga kullanarak APTMDS yaklaşık 10 g pipet. Degassed APTMDS ve 100 mL üç-boyun yuvarlak alt şişesi içine 11.88 g (66.0 mmol) TMAH 8,13 g (33.0 mmol) ekleyin. THF APTMDS çözülmeye ve TMAH, bir büyük oval manyetik heyecan bar ile birlikte askıya almak için 20 mL ekleyin.Dikkat: TMAH higroskopik, aşındırıcı ve toksik madde güçlü bir amonyak gibi kokusu ile ve sıkı kapalı buzdolabında saklanmalıdır. TMAH hemen iyi havalandırılan bir yerde tartmak; koruyucu el eldiven ve koruyucu gözlük işleme sırasında giymek. APTMDS hava hassas ve cilt yanıkları ve göz hasarı neden olur. Bir Ģırınga kullanarak kapalı bir şişe APTMDS tartmak; koruyucu el eldiven ve koruyucu gözlük işleme sırasında giymek. Üç-boyun yuvarlak alt şişeye reflü Kondenser ve giriş ve çıkışları için azot ve ısı ile 80 ° C arasında bir gliserin ya da silikon yağı Isıtma banyo kullanarak tepki karışımı ile donatmak. 2 h reflü altında ve hafif, sürekli azot akışı ile reaksiyon karışımı ilave edin.Not: Başlangıç, biraz bulanık süspansiyon için net bir çözüm 2 saat içinde değişir. Reflü kondansatör kaldırmak ve bir vakum aspiratör kullanarak THF damıtmak. O zaman, biraz sarı ham ürün 0.1 mbar Schlenk satırını kullanarak 70 ° C’de 5 h için bir vakum altında kuru.Not: bu adımdan sonra ham ürün 10 ° C’de buzdolabında kadar ertesi gün saklanabilir. Ham ürün THF 50 mL resuspend. Gerekirse, büyük aglomeralar parçalamak için bir spatula kullanın ve bir vakum aspiratör kullanarak süspansiyon filtre. Ürün beyaz bir toz gibi katı hale gelinceye kadar acele en az 3 x 20 mL THF bölümleri ile yıkayın. Ürün 3 h için oda sıcaklığında 0.1 mbar vakum altında kuru. O zaman, katalizör kadar kullanmak azot altında 10 ° C’de buzdolabında saklayın. Sentezi α, ω-bis(3-aminopropyl)-polydimethylsiloxanesNot: Bir sentez PDMS Moleküler ağırlığı ile ~ 15.500 g·mol-1. Degas D4 ve kullanımdan önce vakum altında APTMDS. Bir Ģırınga kullanarak APTMDS, yaklaşık 1.5 g pipet. Degassed D4 ve içine PTFE kaplı bir santrifüj karıştırıcı ve azot giriş ve çıkış ile donatılmış bir 100 mL üç-boyun yuvarlak alt şişesi, 0.9 g (3,6 mmol) APTMDS 19.5 g (65,7 mmol) ekleyin. Katalizör ~ 26 mg (bölümünden 1.1) ekleyin ve hafif, sürekli azot akış altında 80 ° C’de 30 dk için tepki karışımı ilave edin.Not: banyo Isıtma gliserin ya da silikon yağı kullanılabilir. D4 45,5 g (153,4 mmol) dropwise (2-3 h) içinde bırakarak huni kullanarak tepki karışıma ekleyin ve daha fazla için 24 saat sürekli azot akış altında 80 ° C’de ilave edin.Not: Tepki gecede devam edebilirsiniz. Reaksiyon karışımı 150 ° c ısı ve katalizör çürümeye 2s için karıştırın. O zaman, oda sıcaklığında soğumaya PDMS izin verir. Bir büyük oval manyetik heyecan çizgiyle santrifüj karıştırıcı değişimi ve üç-boyun yuvarlak alt şişeye iki stoper ile mühür. Bir adaptör ile bir kapak kullanın ve yavaş yavaş Schlenk satırını kullanarak döngüsel yan ürünler damıtmak için PDMS 0.1 mbar vakum altında 150 ° c ısı. Oda sıcaklığında soğumaya PDMS izin.Not: Vakum damıtma genellikle 4-5 saat içinde ortaya çıkar. α, sentezi ω-bis(3-aminopropyl)-polydimethyl-metil-phenylsiloxaneNot: Bu bölüm ~ 15.500 g·mol-1 ve 14 mol % metil fenil siloxane Moleküler ağırlığı olan bir polysiloxane sentez yordamı açıklamaktadır; Bu yordamı 1.2 bölümünde anlatılan PDMS sentez karşılaştırılabilir. Degas D4 ve kullanımdan önce vakum altında APTMDS. Bir Ģırınga kullanarak APTMDS yaklaşık 1,5 g pipet. Yer D4beni Ph 3-5 h bir vakum odasında tamamen erimeye ve kullanmadan önce ürün homojenize için 70 ° c. D44,54 g (15,3 mmol), 14.96 g (27,5 mmol) D4beni, Phve içine PTFE kaplı bir santrifüj karıştırıcı ve azot giriş ve çıkış ile donatılmış bir 100 mL üç-boyun yuvarlak alt şişesi, 0.9 g (3,6 mmol) APTMDS ekleyin. Katalizör ~ 26 mg (bölümünden 1.1) ekleyin ve sürekli azot akış altında 30 dk 80 ° C’de tepki karışımı ilave edin. D4 45,5 g (153,4 mmol) dropwise (2-3 h) içinde bırakarak huni kullanarak tepki karışımı içine ekleyin ve daha fazla için 24 saat sürekli azot akış altında 80 ° C’de ilave edin.Not: Tepki gecede devam edebilirsiniz. Sentezini ve numaralı adımları uygulayarak tarafından 1.2.5 1.2.6 devam edin. 2. molekül ağırlığı tayini Polysiloxane Polysiloxane teorik molekül ağırlığı Kuramsal Moleküler ağırlığı hesaplamak , polysiloxane göre aşağıdaki denklemi:(1)Burada, polydimethylsiloxane sayı ortalama molekül ağırlığı, m kullanılan monomerler D4 ve APTMDS kitle (g) ise n mol APTMDS tutar. Polysiloxane 1H-NMR spektroskopisi ile molekül ağırlığı tayini 10-20 mg CDCl30.5 ml polysiloxane dağıtılması, onun NMR spektrumu kaydetmek ve kimyasal vardiya [δ] 7,26 ppm, solvent sinyal kalibre. Molekül ağırlığı hesaplamak polysiloxane göre aşağıdaki denklem integral değerlerinden biri.(2) Polysiloxane titrasyon ile molekül ağırlığı tayini Polysiloxane 1.5-2 g bir 250 mL konik şişesi ekleyin ve THF 50 ml sürekli karıştırarak mıknatıslı heyecan çubuğunu kullanarak altında çözülür. 0,1 M HCl bir renk değiştirene kadar maviden sarıya bromophenol mavi kullanarak gözlenen amino grupları titre. Titrasyon sayı ortalama molekül ağırlığı hesaplamak için üç örnek ile yineleyin. 3. Polysiloxane-üre elastomerler sentezi Not: Bu bölüm için PDMS tabanlı üre elastomer 10 w % kesimi sabit içerik (HS %) sentezi yordamı açıklamaktadır. (PDMS: 15.500 g·mol-1). (3) 2.939 g (11,2 mmol) H12MDI huni ve azot giriş ve çıkış, bırakarak bir PTFE kaplı santrifüj karıştırıcı ile donatılmış bir 250 mL dört-boyun yuvarlak alt tepki şişesi içine ekleyin ve 20 mL THF geçiyoruz.Dikkat: H12MDI bir düşük uçucu diisocyanate ve deri ve göz tahrişe neden olur. Koruyucu el eldiven ve koruyucu gözlük giymek.Not: Alternatif olarak, H12MDI bir 50 mL ölçek THF içinde dağıtılması ve solution’ı bir huni veya tulip bardak tepki şişesi ekleyin. Sonra kabı durulayın ve 10 mL ile THF huni. 45,0 g (2.9 mmol) degassed PDMS THF 100 ml dağıtılması; Bu çözüm dropwise bırakarak huni sürekli karıştırmaya ve bir azot akış altında oda sıcaklığında kullanarak H12MDI çözüm içine ekleyin. Kabı ve huni ile THF 50 mL bırakarak durulama ve bu çözüm tepki karışıma ekleyin. Denetim prepolimer üzerinden FTIR spektroskopisi oluşumu.Not: İki şekilde reaksiyon ilerleme takip edilebilir: satır içi veya çevrimdışı ATR-FTIR spektroskopisi kullanarak. Satır içi ATR-FTIR spektroskopisi için merkezi ortak tepki başında Spektrometre için bağlı olduğundan, bir satır içi ATR-FTIR probu takın. Büyük oval manyetik heyecan çubuğunu yerine PTFE kaplı bir karıştırıcı kullanın. H12MDI çözüm spectra kaydetmeye başlamak ve izosiyanat grupları dönüşüm izlemeye 2266 cm-1 NCO emme zirvesinde seçin. Çevrimdışı ATR-FTIR spektroskopisi, Pasteur pipet kullanarak tepki karışımı örnekleri almak ve ATR kristalde birkaç damla ekleyin. Çözücü bir azot akış altında kadar ATR kristal yüzeyinde ince bir film kalır buharlaşır. Kayıt spectra farklı tepki aşamalarında (PDMS tam eklenmesi ve sonra her bir bölümünü APTMDS ilavesi). APTMDS zinciri extender stokiometrik miktarı bölümlerini prepolimer ekleyin.Not: Zincir extender eklenmesi (3.1.3.1 3.1.3.2 bkz:) iki şekilde devam edebilirsiniz. 5-10 ml THF zinciri extender asılı miktarını dağıtılması ve çözüm dropwise Pasteur pipet veya THF 3 mL ile tekrar durulama tarafından takip bırakarak huni kullanarak tepki karışımı ekleyin. Zinciri extender bölümlerini bir şırınga ekleyin ve zincir extender dropwise reaksiyon karışıma ekleyin. Bu durumda, dördüncü ortak bir kauçuk septum tıpa kullanarak kapatın. APTMDS, prepolymer, APTMDS, hesaplanan tutarın % 80’i karşılık gelen, 1.65 g (6,6 mmol) ekleyin. Sonra Denetim FTIR spektroskopisi ile reaksiyon ilerleme. O zaman, 0,21 g (0.8 mmol) APTMDS (içinde hesaplanan miktarı, toplam ) tepki karışıma ekleyin ve reaksiyon ilerleme FTIR tarafından kontrol. (Toplam, ) olarak 0.1 g (0.4 mmol) APTMDS ekleyin reaksiyon karışımı ve kontrol tepki FTIR kullanarak ilerleme. Son olarak, zincir extender (0,102 g, 0,41 mmol) son bölümünü tepki karışıma ekleyin ve FTIR spektrumunda NCO emme grubun kaybolması kontrol edin.Not: zincir extender ilk bölümünü eklenmesinden sonra viskozite artışı kaydetti. Güç kaynağı çözüm PTFE folyo kaplı cam Petri kabına dökün ve solvent gecede duman başlık altında buharlaşır. Ayrıca, güç kaynağı 12 h için 80 ° C’de bir vakum odasında kuru. 4. mekanik test prosedürü Polysiloxane-üre elastomer filmleri hazırlanması 7-8 g küçük PSU adet CHCl3 ‘ te bir 300 mL konik şişesi 200-250 ml dağıtılması, gevşek bir cam kapalı kullanarak şişeye kapatın ve en az 24 saat manyetik heyecan çubuğunu kullanarak karışımı ilave edin. Gerekirse, solvent ek bölümleri ekleyin.Dikkat: Muhtemelen kanserojen kloroform var. Buharları teneffüs üzerine uyuşukluk neden olabilir. Kloroform iyi havalandırılan bir yerde baş. Homojen çözüm bir cam Petri kabına içine ekleyin ve delikli alüminyum folyo ile kapatın. Ya iyi havalandırılan bir yerde veya bir duman başlıklı kanat pencere açık ile Petri kabına koyarak yavaş yavaş buharlaşır çözücü olanak sağlar.Not: Petri kabına duman mahallede yerleştirirken, hava akımı mümkünse azaltın. Son derece hızlı buharlaşma çözücü inhomogeneity ve şeffaf Filmler içinde opak lekeler oluşumu yol açar. Filmin 12 h için bir vakum odasında 80 ° C’de kuru. Dikkatle film küçük bir ince spatula kullanarak cam yüzeyden çıkarın ve PSU filmin sonraki kullanım için mekanik karakterizasyonu üzerine saydam bir zarf içinde saklayın. Stres gerginlik testleri polysiloxane-üre elastomer Filmler Oymalı köpek kemik şeklinde örnekler Keiper45 (türü S2) göre PSU filmlerden hazırlayın. Şekil 4’ te gösterildiği gibi bir şekil ile Delme bıçağı birimi altındaki zarf folyo kaplıdır PSU film yerleştirin. Kolu testi numune yumruk ve ortam sıcaklığı (23 ± 2 ° C) en az 72 h için depolamak için aşağı doğru itin. Gerilme test makine ve bilgisayar geçiş yapar. Yazılım simgesine tıklayarak başlayın. Çekme Testi olarak yöntemi seçin ve doğru yük hücresi (100 N) test makinede yüklü olup olmadığını kontrol edin. Yöntemi Yardımcısı seçin ve tüm test ayarlarınızın doğru olduğundan. Ön-test için gidin ve aşağıdaki ayarları etkinleştirilir kontrol: 20 mm, 0.1 MPa, preload ve preload 5 mm/dak ulaşılana kadar hız, orijinal örnek uzunluğu (L0). Parametre test gidin ve aşağıdaki ayarları etkinleştirilir kontrol: Young katsayısı 1 mm/min, 25 mm/dak, % 80’i Fmax, kopma örnek tespiti tatilinde örnek kadar hız tayini için hız Young katsayısı, regresyon, Young modülü belirlenmesi de %2 zorlanma başlangıcı ve Young modülü belirlenmesi % 6 zorlanma, sonu belirlenmesi. Yöntemi Yardımcısı bırakın ve yazılım ana pencereye geçiş yapar. Test makinede gücüyle düğmeye ve düğme için başlangıç pozisyonuna gidin yazılım ana penceresinde’i tıklatın. Koruma folyoları kaldırmak ve herhangi bir iç stres dışlamak için bir çapraz polarize altında örnek incelemek. Örnek kalınlığı ve bir kalibre kullanarak örnek genişliği ölçmek. Sonra yazılımın ana penceresinde karşılık gelen alanlara örnek kalınlığı ve genişliği değerleri ekleyin. Testi numune test makine üst sıkma çeneler arasında düzeltmek. Yazılımın ana penceresinde sıfır güç düğmesini tıklatın. Testi numune arasında jaws test makine sıkma alt ucuna düzeltmek.Not: sıkma jaws yüzeyleri kaygan, numune örnek ölçüm sırasında kaymasını önlemek için ince gren zımpara kağıdı arasında sonuna yerleştirin. Çekme Testi başlatmak için Ölçüm Başlat düğmesini tıklatın. Ölçüm tamamladıktan sonra 4.2.6 ve 4.2.7 adımlarla devam. Sabitleme sonra testi numune üst sıkma jaws ve sıfır güç, seçme arasında seçin düğmesi için başlangıç pozisyonuna gidin yazılım ana penceresinde. Sonra testi numune arasında çeneleri sıkma alt ucuna düzeltin ve tekrar Ölçüm Başlat ‘ ı tıklatın. 4.2.6 – 4.2.8 bir PSU örnek için en az bir ek 3 x Young’un modülü, çekme dayanımı ve uzama istatistiksel değerlendirilmesi için kopma yineleyin. PSU elastomer filmleri histeresis testleri Gerilme test makine ve bilgisayar geçiş yapar. Yazılım simgesine tıklayarak başlayın. Çevrimsel gerilme test yöntemi seçin ve test makinede doğru yük hücresi (100 N) yüklemesini inceleyin. Yöntemi Yardımcısı seçin ve tüm test ayarlarınızın doğru olduğundan. Ön-test için gidin ve aşağıdaki ayarları etkinleştirilmiş olup olmadığını kontrol edin: 20 mm, 0,05 MPa, preload ve preload 5 mm/dak ulaşılana kadar hız, orijinal örnek uzunluğu (L0). Parametre test için gidin ve harekete geçirmek için aşağıdaki ayarları kontrol edin: 10, % 100 zorlanma, % 0 zorlanma ve 25 mm/dak hızda boşaltma setpoint yükleme setpoint devir sayısı bırakın yöntemi Yardımcısı ve yazılım ana pencereye geçiş yapar. Tarih adımlarla 4.2.5 – 4.2.8 devam. Histeresis ölçümleri iki örnek ile istatistiksel değerlendirme için yineleyin. Mekanik histeresis her döngüsü göre aşağıdaki denklemi hesaplamak.(4) 5. yetiştirme yordamı HaCaT hücreler için Bir cryotube HaCaT hücreleri ile sıcak ve Dulbecco’nın kartal ortamda 37 ° C su banyosu (DMEM) değiştirilebilir. Mikrobiyolojik Güvenlik tezgah altında hücre süspansiyon ile sıcak DMEM dolu bir 10 mL konik santrifüj tüpü hızla aktarın. Hücre süspansiyon Santrifüjü 845 x g6 min için tabi. Tek kullanımlık cam bir vakum pompa bağlı, Pasteur pipet kullanarak süpernatant çoğunluğu atın ve hafifçe yukarı ve aşağı bir Eppendorf pipet kullanarak hücre aglomeralar pipetting tarafından geri kalan sıvı hücre Pelet resuspend. Resuspended hücreleri bir 25 cm2 hücre kültür şişesi aktarmak ve 9 mL % 10 ile desteklenmiş DMEM ekleyin FBS. 37 ± 1 ° C ve % 5 CO2 ‘ de bir kuluçka kabine hücreleri kuluçkaya. Denetim günlük ters bir mikroskop kullanarak hücre çoğalması. DMEM hücreleri subconfluent olana üçüncü her gün değiştirin. Bir hücre geçit Emanet tezgah altında tek kullanımlık cam Pasteur pipet kullanarak DMEM kaldırarak gerçekleştirin. Hücre katmanı yıkamak için PBS arabellek 10 mL ekleyin. Tek kullanımlık cam Pasteur pipet kullanarak yeniden PBS arabellek kaldırın. Hücreleri ayırmak ve onları CO2 kuluçka kabine kuluçkaya 25 cm2 hücre kültür şişesi 1 mL tripsin/EDTA çözeltisi ekleyin. Hücreleri ters bir mikroskop kullanarak süspansiyon, mevcut olup olmadığını kontrol edin. DMEM 3 mL tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için hücre kültür şişeye ekleyin. Hücre süspansiyon bir santrifüj tüpü aktarmak ve hücreleri Santrifüjü vasıl 845 x g6 min için tabi. Bir cam Pasteur pipet kullanarak bir çoğunluğu süpernatant, kaldırın. Kalan DMEM hücrelerde resuspend ve 10 mL % 10 ile takıma taze sıcak DMEM ekleyin FBS. Hücre süspansiyon 5 mL her 75 cm2 hücre kültür şişeler içine aktarmak ve % 10 ile takıma taze sıcak DMEM 15 mL ekleyin FBS. Hücreleri subconfluent olana HaCaT hücreleri 37 ± 1 ° C ve % 5 CO2 ‘ de CO2 kuluçka makinesi kabin yetiştirmek. Hücre geçiş adımları 5.1.3 – 5.1.6 ama bu sefer göre tekrar ediyorum, 2 mL tripsin/EDTA çözüm ve DMEM 6 mL tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için kullanın. 6. yordam HaCaT hücreleri kullanarak bir MTS hücre canlılığı tahlil için Not: Cep orta özleri kullanarak Wenzelewski46göre vitro sitotoksisite testleri yapıldı. PSU örnekleri ve Biyomedikal dereceli poliüretan örnekleri Etilen oksitle sterilize. HaCaT hücreleri 37 ± 1 ° C ve % 5 CO2 ‘ de % 10 ile desteklenmiş DMEM kültür FBS bir 75 cm2 hücre kültür şişesi içinde. Hücreleri vitro sitotoksisite testleri için en az sonra dördüncü geçiş kullanır. Güç kaynağı ve bir referans malzeme (0.7 g) steril örnekleri 50 mL konik santrifüj tüpler içine ekleyin ve DMEM, FBS, olmadan örnekleriyle 72 ± 0,1 g/ml bir ekstraksiyon oranında 37 ° C ve % 5 CO2 2 h için ayıklamak. Üç özleri her PSU örnek için kullanın. Kör örnekleri 50 mL konik santrifüj tüpler içine DMEM, FBS, olmadan doldurarak hazırlamak ve aynı ayıklama gerçekleştirmek. Günü 2 çıkarma yordamı, hücre dekolmanı adımları 5.1.3 – 2 mL tripsin/EDTA ve DMEM 6 mL ile 5.1.5 göre gerçekleştirin. 100 µL hücre süspansiyon aliquot alıp DMEM 100 µL ekleyin. Bu seyreltilmiş süspansiyon gelen aliquot 20 µL alıp 10 µL ölü hücreleri leke için % 0,5 trypan mavi çözüm ekleyin. Hücreler 2 dk. dolgu için bir micropipette kullanarak hemasitometre kuluçkaya ve hemen dört Odaları içinde hücreleri saymak. Hücre canlılığı yüzdelerle değerlendirmek için uygun ve nonviable hücre sayıları hesaplamak.Not: Alternatif olarak, bir hücre sayım sistemi kullanarak hücreleri sayılabilir. Tohum HaCaT (dördüncü bölüm), 20 x 103 hücreleri/iyi’DMEM 200 µL 96-şey Mikroplaka içine bir konsantrasyon hücreleri ve 37 ° C ve % 5 CO224 h için hücreleri kuluçkaya. Gün 3, çıkarma sonra FBS her özü ve kör için örnekler ve örnekler sıcak % 10 Ekle 37 ° bir su banyosu kullanarak C’ye kadar. DMEM her birinden de numaralı seribaşı kaldırın ve özleri, kör örnekleri ve karşılık gelen pozitif ve negatif denetimler tarafından orta değiştirin. Her PSU için (kullanım üç özler her PSU örnek için) özü, altı kuyu içine ekstresinin 200 µL pipet. Kör örnek 200 µL pipet (DMEM + % 10 FBS) altı kuyu içine. Taze DMEM, % 10 ile takıma 200 µL pipet FBS (negatif kontrol), altı kuyu içine. Pozitif kontrol 200 µL pipet (DMEM + % 10 FBS + % 1 SDS) altı kuyu içine. Özleri ve 37 ° C ve % 5 CO224 h için denetimleri hücrelerle kuluçkaya.Not: Pozitif kontrol kursları, bir % 20 SDS çözümde su hazırlamak ve DMEM ile 1:2 seyreltik. O zaman, daha fazla % 1 SDS çözüm hazırlamak için DMEM ile oranında seyreltin. Gün 4, kuluçka zamanın sonuna kısa bir süre önce MTS ve DMEM FBS olmadan hisse senedi bir çözüm (her şey için kullanım 20 µL MTS çözüm + DMEM 100 µL) hazırlayın. Kuluçka süresi, özler, kör çözümleri ve denetimleri kaldırma sonra 120 µL MTS hisse senedi çözümün her kuyuya, hem de arka plan belirlemek için hücreleri olmadan altı kuyu içine pipet. CO237 ° C ve %5 4 h için hücreleri kuluçkaya. Gün 4 MTS çözüm kuluçka sonra 492 her kuyuda Absorbans ölçmek nm, Mikroplaka okuyucu kullanarak. Bu numaralı seribaşı Wells kökenli ölçülen Absorbans çıkarma. Ölçülen Absorbans değerleri pozitif denetimi ‘ % 0 nükleer silahların yayılmasına karşı temsil etmek ve bu Absorbans değerleri 0 olarak ayarlayın varsayalım. Ölçülen Absorbans değerleri negatif kontrol ‘ % 100 nükleer silahların yayılmasına karşı temsil ve bu değerleri 100’e ayarlamak gerektiğini varsayalım. Absorbans değerleri üzerinden hücre çoğalması negatif kontrol (% 100 yayılması) ve pozitif kontrol (%0 yayılması) Absorbans değerleri yüzde olarak hesaplayın. Hücre çoğalması olarak değil sitotoksik % 81’e kadar sergi örnek özleri değerlendirin.Not: Tedarikçi bilgi47göre daha sonra Absorbans ölçün. 25 µL % 10 SDS çözüm reaksiyonu durdurmak ve ilâ 18 h ışık oksijen odası oda sıcaklığında korunan Mikroplaka depolamak için her kuyuya pipet.