Comment quantifier la Fraction des protéines fluorescentes photoactivation en vrac et dans des cellules vivantes
Summary
Nous présentons ici un protocole qui implique de photoactivatable spectralement distincte génétiquement couplé et des protéines fluorescentes. Ces chimères de la protéine fluorescente permettent de quantification de la fraction de PA-FP est photoactivation être fluorescents, c’est-à-dire l’efficacité de photoactivation. Le protocole indique que les différents modes de photoactivation rendement photoactivation différentes efficacités.
Abstract
Photoactivatable et – protéines fluorescentes convertibles (PA-FPs) ont été utilisés en microscopie de fluorescence cellules vivantes pour analyser la dynamique des cellules et des ensembles de protéines. Jusqu’ici, aucune méthode n’a été disponible à quantifier en vrac et en live cellules exprimé combien du PA-SFP sont photoactivation de fluorescence.
Ici, nous présentons un protocole mettant en cause des règles internes, c’est-à-dire génétiquement couplés protéines fluorescentes spectralement distinctes (photoactivatable), à ratiometrically quantifier la fraction de tous les PA-MF intégré à une cellule qui s’allument pour être fluorescent. Utilisant ce protocole, nous montrons que les différents modes de photoactivation donné photoactivation différentes efficacités. Courte photoactivation haute puissance avec un confocal laser scanning microscope (CLSM) a entraîné jusqu’à quatre fois plus faible photoactivation efficacité que des centaines d’expositions bas niveau appliquées par CLSM ou une brève impulsion appliquée par widefield illumination. Alors que le protocole a été exemplifié ici pour GFP (PA-) et Cherry (PA-), il peut en principe être appliqué à n’importe quelle paire de protéine fluorescente photoactivatable ou et spectralement distinctes et tout montage expérimental.
Introduction
En 2002, le premier largement applicable photoactivatable (PA-GFP1) et des protéines fluorescentes et (Kaede2) ont été décrits. Ces protéines fluorescentes surligneur optique modifier leurs propriétés spectrales lors de l’irradiation UV-lumière, c’est-à-dire, ils deviennent lumineux (protéines fluorescentes photoactivatable, c.-à-d., PA-FPs), ou changer leur couleur (et Images/s). A ce jour, plusieurs réversibles et irréversibles photoactivatable et et protéines fluorescentes ont été développés3,4. Dans les études d’ensemble ou en vrac, surligneurs optiques ont été utilisés pour étudier la dynamique des cellules entières ou des protéines et la connectivité des compartiments subcellulaires. En outre, surligneurs optique activées seule molécule basée superrésolution imaging techniques telles que PALM5 et6de la FPALM.
Bien que la photochimique traite pendant photoactivation ou – conversion ont été décrits pour de nombreuses optiques surligneurs et structures cristallographiques même avant et après photoactivation / – conversion ont disponible7 , 8, le mécanismephysique sous-jacent de photo de photoactivation et – conversion n’est pas complètement élucidé. En outre, jusqu’ici seulement brutes estimations existent de l’efficacité de photoactivation et – conversion, c’est-à-dire la fraction des protéines fluorescentes exprimées autrement dit effectivement photoconverted ou photoactivation être fluorescent. Des études in vitro ensemble ont été signalés à quantifier la Maj dans les spectres d’absorption et de la quantité de natif et activé des protéines dans un gel9,10,11.
Nous présentons ici un protocole impliquant les chimères de la protéine fluorescente afin d’évaluer la fraction des protéines fluorescentes photoactivation en vrac et dans des cellules vivantes. Chaque fois que travaillant avec des protéines fluorescentes génétiquement encodés, la quantité absolue de la protéine exprimée varie de cellule en cellule et ne connaît pas. Si une cellule exprimant une PA-FP présente un signal plus clair après photoactivation qu’une autre cellule, on ne peut pas différencier si ce signal lumineux est due à une expression plus élevée de la PA-FP ou une photoactivation plus efficace du PA-FP. Pour uniformiser le niveau d’expression dans les cellules, nous introduisons des règles internes de protéines fluorescentes spectralement distinctes génétiquement couplés. Par couplage de l’information génétique d’une protéine fluorescente photoactivatable à un spectralement distincts toujours en protéines fluorescentes, règles internes sont créés qui sera toujours exprimé pour un montant inconnu, mais dans une quantité relative fixe et connue de 1 : 1. cette stratégie permet la caractérisation quantitative des différents régimes photoactivation lumière UV, c’est-à-dire l’évaluation de la quantité relative de PA-FPs pouvant être photoactivées avec différents modes de photoactivation, et permet donc pour définir des schémas de photoactivation qui sont plus efficaces que d’autres. En outre, cette stratégie permet en principe de l’évaluation de la quantification absolue de la fraction de photoactivation PA-FP. À cette fin, il est important de réaliser que les études d’ensemble présenté sont fondés sur l’intensité qui rend l’analyse plus complexe comme décrit dans le présent protocole. Paramètres déterminant l’intensité de fluorescence mesurée, c’est-à-dire différentes luminosité moléculaire, absorbance et spectres d’émission et effets de la frette, doivent être examinées lors de la comparaison des intensités de fluorescence de différentes protéines fluorescentes.
La quantification de basé sur l’intensité ratiométrique présenté de photoactivation efficacité est illustrée pour PA-GFP et PA-Cherry dans des cellules vivantes, mais est en principe largement applicables et peut être utilisée pour n’importe quelle protéine fluorescente photoactivatable sous aucune conditions expérimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jusqu’ici, aucune méthode n’existait pour déterminer, en vrac, la fraction de PA-FPs exprimées dans des cellules vivantes qui est photoactivées d’être fluorescente. Le protocole présenté peut être utilisé pour n’importe quelle paire de protéine fluorescente spectralement distinctes. Bien qu’illustrée ici pour l’irréversible PA-FPs PA-GFP et PA-cerise, cette approche est en principe applicable aux protéines et ainsi. La protéine fluorescente spectralement distincte, toutefois, doit être sélecti…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le laboratoire Dorigo et le Service d’imagerie de Neuroscience à la Stanford University School of Medicine pour la fourniture d’équipements et espace pour ce projet.
Materials
| pEGFP-N1 mammalian cell expression vector | Clontech | ||
| DMEM w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Trypsin w/o phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
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