Analisi delle dinamiche di Actomyosin su scale cellulari e tissutali locali utilizzando film time-lapse di camere d'uovo di Drosophila coltivate

Il continuo sviluppo di nuove tecnologie di imaging e software con applicazioni nelle scienze della vita ha fornito un enorme impatto sulla comprensione dei principi di base della vita. Una delle sfide principali è la visualizzazione affidabile dei processi di sviluppo in combinazione con la loro imaging dal vivo in vari tessuti. I tessuti sono parti di organi e corpi e, in quanto tali, la maggior parte non sono facilmente accessibili per l’imaging. Pertanto, sono stati sviluppati protocolli che consentono la loro dissezione e la loro coltura in vitro al fine di visualizzare eventi biologici che riflettono sufficientemente la situazione in vivo all’interno di un corpo vivente.

Negli ultimi decenni, la coltura e l’imaging dal vivo delle camere d’uovo della Drosophila, strutture simili acinari e simili a organi primitivi, ha contribuito immensamente alla comprensione dei principi di base dello sviluppo primitivo degli organi^{1 , 2 Il} nome del sistema ^{, 3}. Attualmente, ci sono diversi protocolli di coltura disponibili, e il loro utilizzo dipende dal tempo di acquisizione, tipo di cella da imageizzare, e la loro accessibilità (ad esempio, germinainterna e linea somatica esterna)⁴.

Una caratteristica comune in tutti questi protocolli di coltura è la necessità di immobilizzare le camere d’uovo analizzate che mostrano un’elevata attività contrattile nei supporti liquidi. L’attività contrattile delle camere d’uovo è causata principalmente dal foglio muscolare che copre una lunga serie di camere d’uovo collegate^5,6,7. Pertanto, per ottenere una corretta immobilizzazione delle camere d’uovo giovani, sono stati sviluppati vari approcci, che prevedono la copertura delle camere d’uovo con coperchi rivolti^6,8,9 o coperte flessibili^{4, 10} o incorporandoli in agarose a basso punto di fusione^3,11. Questi approcci sono popolari in quanto consentono anche l’imaging di un piano visivo più grande a causa del sottile appiattimento della superficie circonferenziale delle camere d’uovo.

Tuttavia, recentemente, è stato dimostrato che le camere delle uova giovani (stadio 1-8) ruotano intorno al loro asse anteriore-posteriore⁶ e che questo movimento del tessuto è alimentato da una rete di actomiosina fine vicino alla superficie circonferenziale di queste giovani camere ^{d’uovo 12}. Pertanto, l’alterazione artificiale della superficie cellulare causata da un sottile appiattimento di questo tessuto può avere un impatto negativo sul comportamento del meccanismo di actomiosina che genera forza. Il contrappunto è che se il tessuto della camera dell’uovo non è appiattito, l’imaging microscopico delle proteine sulla superficie circonferenziale delle camere d’uovo diventa ancora più limitato dalla diminuzione delle dimensioni del piano di acquisizione.

Pertanto, abbiamo combinato protocolli da Prasad et al.⁹ e il laboratorio di Berg Celeste^4,10 e ulteriormente modificato in modo che nessun coverslip / coperta flessibile / agarose viene utilizzato nel metodo sviluppato. Le camere delle uova di Drosophila sono liberamente coltivate nei media e il protocollo qui presentato si applica solo microscopia invertita. Ci sono due parti del protocollo. La prima parte è focalizzata sull’analisi dei segnali di actomiosina su scala cellulare locale (fino a 15 celle) all’interno delle camere d’uovo. Nella seconda parte, ci concentriamo sul superamento dei limiti associati a un piccolo piano di acquisizione causato dalla libera coltura delle camere d’uovo. A questo proposito, abbiamo sviluppato un nuovo metodo computazionale basato sulle Fiji con un’interfaccia utente grafica semi-interattiva che estrae e dispiega selettivamente strati definiti di una superficie del tessuto circonferenzale. Questo è seguito da un protocollo che descrive come analizzare l’actomiosina su scala tissutale (cioè, >50 cellule). Poiché l’estrazione selettiva di un sottile strato definito di tessuti epiteliali curvi non è stata facilmente possibile utilizzando una proiezione classica dello z-stack (Figura 1), questo metodo facile da usare funge da prerequisito importante per comprendere in modo completo il comportamento di una sottile rete di actomyosina (<1 m) su scala tissutale nelle camere d'uovo della Drosophila.

Inoltre, per facilitare il protocollo, forniamo esempi di filmati time-lapse (TLM) e file di esempio del comportamento di Myosin aI convenzionale con tag fluorescenti (vedere File supplementare 3). Myosin II è una proteina motoria e rappresenta la parte contrattile attiva del meccanismo di actomyosin. Per immaginare Myosin II, utilizziamo linee transgeniche della Drosophila che contengono una catena di luce regolatoria modificata di Myosin II chiamata MRLC::GFP (vedi Tabella dei Materiali per i dettagli)^12,13. Per visualizzare le membrane cellulari, il protocollo si basa su coloranti commerciali (cfr. Tabella deimateriali). Questo protocollo è adatto non solo per l’analisi dei piccoli segnali mrLC subcellulari::GFP^12, ma anche per particelle subcellulari di dimensioni simili intorno a 300 m, come quelle osservate con Life-Act::GFP^12,14.

Anche se entrambi questi protocolli sono presentati utilizzando camere d’uovo di Drosophila coltivate in vitro, l’acquisizione di segnali di actomiosina può essere eseguita anche utilizzando altri tessuti sull’ottimizzazione dei supporti di coltura e a seconda della disponibilità di proteine con etichettaflue fluorescenti con coloranti commerciali corrispondenti o, ad esempio, microiniezioni di mRNA per ottenere profili di espressione genica transitoria. Allo stesso modo, il protocollo basato su Fiji per l’estrazione di uno strato sottile da una superficie circonferenziale può essere applicato più in generale ai tessuti ellissoidi e simili ad organi.