Bu iletişim kuralı görüntüleme sistemi içinde çeşitli hücre tiplerinin bir canlı hücre kullanarak gerçek zamanlı akını oranları ile LDL kolesterol alımını ölçme verimli bir yaklaşım sağlar. Bu teknik Farmakolojik aktivite LDL akını hücre morfolojisi ve dolayısıyla potansiyel sitotoksisite izleme sırasında etkileyen bileşiklerin ekran için bir platform sağlar.
LDL kolesterol alımını LDLR aracılı endositoz ile düzenlenmesi çalışmada metabolik bozukluğu, kalp-damar hastalıkları ve böbrek hastalığı da dahil olmak üzere çeşitli büyük patolojileri önemli bir alandır. Şu anda, aynı anda için hücrelerin sağlığını izleme sırasında LDL alımını değerlendirmek için kullanılabilir hiçbir yöntemi yoktur. Çalışmada eşzamanlı hücre sağlık için izleme ile LDL akını seri ölçümler elde etmek için canlı hücre görüntü analiz sistemi kullanan bir Protokolü sunar. Bu roman tekniği üç insan hücre hatlarında (karaciğer, böbrek borulu epitel ve koroner arter endotel hücreleri) dört saat boyunca test edilmiştir. Ayrıca, bu teknik duyarlılığını iyi bilinen LDL alım inhibitörleri, Dynasore ve rekombinant PCSK9 protein ile yanı sıra bir LDL alımını organizatörü, Simvastatin tarafından doğrulanır. Birlikte ele alındığında, bu yöntem aynı anda Farmakolojik aktivite eleme hem de hücre morfolojisi, dolayısıyla sitotoksisite LDL akını düzenleyen bileşiklerin izleme için bir orta yüksek üretilen iş platformu sağlar. Analiz farklı görüntüleme sistemleri ve analitik yazılım ile kullanılabilir.
Dolaşan LDL kolesterol düzeyleri kalp-damar hastalıkları1, böbrek hastalığı2 gibi çeşitli inflamatuar özünde LDL düşük yoğunluklu Lipoprotein reseptör LDLR-aracılı endositoz çalışmanın önemli bir alan olduğu hastalıklar3 ve genetik bozukluklar mutasyonlar kolesterol taşıma genler4,5,6,7ile. LDLR-aracılı kolesterol akını çalışmalarda kimyasal Dynasore8,9,10, aynı zamanda LDL düzenleyen de dahil olmak üzere Dynamin inhibitörleri gibi birden çok araştırma araçları tanımlaması yol açmıştır proteinler gibi Proprotein konvertaz Subtilisin/Kexin 9 (PCSK9)11,12yazın.
LDL-LDLR endositoz yolu clathrin kaplı çukurlar13içine hücre yüzeyindeki LDL-LDLR kompleks iyon ile başlar. Veziküller sonra taşıma hücre içindeki boşluklara da LDL-LDLR komplekse özümseyerek hücre yüzey membran invagination tarafından oluşturulur. Kurulan vezikül erken ve o zaman geç endosomes geliştikçe, pH LDL ayırma–dan onun reseptör14neden geç endosome içinde bırakır. Geçmişte, LDL akını miktar yöntemleri radyo etiketli 125-LDL Co kuluçka hücreleri ve sonraki çıkarma hücreler miktar15için radyo etiketli protein ile bağlıydı. Bu o zaman kullanım dıı-LDL ve sonraki immunostaining gibi fluorescently etiketli LDL proteinlerin veya floresan okuma bir spektrofotometre veya plaka okuyucu15,16kullanarak için protein çıkarımı tarafından değiştirildi. Fluorescently etiketli LDL da (FACS) sıralama floresans aktif hücreye LDL ve hücre yüzey LDL bağlama17içselleştirilmesi analizi için kullanılmıştır. Hücrelerin canlılık tedavi sırasında izleme veri toplama sonra tedavi için bu yöntemleri izin verirken mümkün değildir.
Geç endosome Asidik pH floresan LDL pH-harekete geçirmek sonda pHrodo sonra içselleştirilmesi18,19fluoresces kırmızı LDL gibi bir kullanımına izin verir. LDL alımını değerlendirme canlı hücrelerdeki sürekli zamanlı kurs için bu özellik sağlar. Bu nedenle, bu iletişim kuralını pHrodo kırmızı-LDL floresans görüntüleme canlı hücre Analizi hücre sağlık için eş zamanlı izleme ile seri olarak ölçü LDL alımı için kullanır. Bu roman tekniği güvenilirliğini olarak üç farklı insan hücre hatları, insan hepatik Karsinomu (HepG2) hücreleri, insan renal epitel (HK2) hücreleri ve insan koroner damar endotel hücreleri (HCAEC dört saatlik zaman ders üzerinde test sonuçlar gösterir ). Bu hücre satırları LDL izni20,21,22,23,24,25,–26,27 klinik olarak anlamlı , böbrek hastalığı28,29,30,31ve kalp hastalığı32,33, anılan sıraya göre. LDL akını izleme özelliğine ek olarak, bu protokolü ile iki iyi bilinen LDL alım inhibitörleri, Dynasore hidrat ve rekombinant PCSK9 protein yanı sıra LDLR ifade ve LDL alımı, simvastatin statin bir uyarıcı tedavi içerir. Dynasore ve rekombinant PCSK9 her LDL alımını azaltmak için farklı yollar çalışır.
Dynasore Dynamins10 küçük molekül inhibitörü ve clathrin bağımlı endositoz LDL-LDLR karmaşık10,34engelleyerek LDL alımını azaltır. Rekombinant PCSK9, öte yandan, peptidaz LDLR için bağlar ve onun hücre yüzeyine LDL içselleştirilmiş karmaşık gerekli konformasyon değişiklikleri35,36 bloke ederek bırakmadan sonra geri dönüşüm engeller S8 ailesinin bir üyesidir . Azalma hücre yüzey LDLR yoğunluğu sonunda hücre tarafından düşük LDL alımı için yol açar. Statinler, doğrudan 3-hidroksi-3-methylglutaryl-koenzim (HMG-CoA) redüktaz enzim ve böylece kolesterol sentezi, engelleme de upregulate için artan LDL alımı için önde gelen LDLR25,38 ifade bilinir. Bu iletişim kuralı duyarlılığını LDL akını üç klinik insan hücre hatları, HK2, HepG2 ve HCAECs, Dynasore ve/veya rekombinant PCSK9, ve HepG2 hücreleri tarafından LDL Anlamazdın belirgin bir artış önemli indirimler algılayarak doğrulanır Simvastatin hücre morfolojisi/sağlık için izleme ile dört saatlik zaman ders. Birlikte ele alındığında, bu yöntem için aynı anda tarama Farmakolojik aktivite ve sitotoksisite bileşiklerin canlı hücrelerdeki LDL alımını düzenleyen bir orta yüksek üretilen iş platformu sağlar.
Geçerli protokol canlı hücre görüntüleme bir zaman ders çeşitli insan hücre hatlarında üzerinden gerçek zamanlı LDL alımını ölçmek için yeni ve daha etkili bir yöntem olarak kullanımını göstermektedir. İnsan hepatik Karsinomu (HepG2) hücreler kolesterol düşürücü tedavi21,22,23,24,25,26içineleme çalışmalarda yaygın olarak kullanılır, 39,40. Bu nedenle, bu hücre tipi canlı hücre görüntüleme sistemin LDL akını araştırmalar yeteneğini test etmek için seçti. Sonuçlarımız HepG2 hücreleri birarada olabilir ile bu yeni teknik ve sonuç olarak sürekli LDL alımını akını tahlil süresince kadar 4,33 h son bitiş noktası olarak gösteren bir sigmoid benzeri eğride gösterir (Şekil 2A ve Şekil 3 ).
Kolesterol homeostazı çeşitli nephropathies patofizyolojisi içinde önemli bir rol oynar. Nitekim, kolesterol birikimi böbrek dokusunda böbrek fibrozis kronik böbrek hastalığı için lider için büyük bir katkıda bulunuyor ve çeşitli nephropathies28,29,30,31yılında büyük bir patolojisi. Bu nedenle, Nefroloji alanında kullanılan bir popüler ve güvenilir hücre satır olarak insan hücrelerinde renal epitel (HK2) bizim yöntemi incelenmiştir. Bizim veri aynı zamanda LDL akını HK2 hücrelerdeki ölçmek için canlı hücre görüntüleme sistemi fizibilite desteklenen. Şekil 2‘ deBgösterildiği gibi HK2 hücreleri LDL kolesterol (4 saat) akını çalışma süresi boyunca doğrusal olarak aldı.
Gelişme ve ilerleme ateroskleroz32,33,41, dünya çapında bir numaralı katil sırayla olan kardiyovasküler hastalık, önde gelen nedenidir kolesterol metabolizmasında önemi nedeniyle 42, bizim Yöntem ateroskleroz ilgili bir hücreye doğrulamak amaçladık. Bu koroner arter lümen ateroskleroz hastada bir kolesterol aşağılamaya maruz ilk hücre tiplerinden birini olarak biz insan koroner damar endotel hücreleri (HCAECs) kullanılır. Şekil 2‘C de gösterilen veriler bu LDL akını yöntemi de etkili HCAECs ile çalışır gösteriyor. HepG2 hücreleri için benzer bir sigmoid benzeri eğrisi sonuç grafiktir.
Geçerlilik ve LDL-kolesterol alımını etkileyen bileşikler süzmek için geliştirilmiş bu LDL akını Testin duyarlılığı sınamak için üç denetim, LDL alımını düşürücü ajanlar Dynasore ve rPCSK9 ve LDL akını harekete geçirmek Simvastatin kullanılır. Burada, biz yukarıdaki tedavi hücre hatları (HepG2, HK2 ve HCAECs) Dynasore veya rPCSK9 akını tahlil önce en iyi duruma getirilmiş konsantrasyonları ile belirtilen. Tüm üç test hücre satır 4 saatlik bir zaman boyunca (Şekil 2) LDL akını önemli indirimleri ile tedavilere yanıt bizim sonuçlar gösterdi. Örneğin, son kez noktası olarak 4,33 h 40 µM Dynasore ile tedavi % 53, %68 ve % 54, LDL akını HepG2 hücreleri, HK2 hücreleri ve HCAECs sırasıyla azaltılmış anlamlı (p < 0,0001; Resim 2 A-C ve Tablo 2A-C). Buna ek olarak, rPCSK9 10 µg/mL, bir işaretli % 55 indirim HK2 hücrelerinde LDL akını neden (p < 0,0001; Resim 2 B ve tablo 2B). Ayrıca, bizim bulgular Simvastatin HepG2 hücrelerle tedavi önemli değişiklikler LDL akını algılamak için bu yöntem duyarlılığını destekleyen LDL alımı (Şekil 3), belirgin artış içinde sonuçlandı gösterdi. RPCSK9 iyi belgelenmiş sonuçları ile bir ek denetim tedavi olarak kullanılır ama küçük miktarlarda satın almak pahalı olarak rPCSK9 HepG2 ve HCAEC hücreleri ile tedavi çalışmaları bu protokol için dahil değildir. Bu nedenle rPCSK9 sadece bu protokol HK2 hücreleri için doğrulamak için kullanılmıştır.
Hücre analizi, LDL akını, sağlık ve hücre morfolojisi sürekli izlenmesi için izin fonksiyonel ve zamanında ölçümü ile birlikte görüntüleme yaşıyor. Bu avantajı verimli bir şekilde aynı anda Farmakolojik aktivite ve sitotoksisite izlemek için ideal bir tekniği yapım bu yöntemi uygulanan bileşiklerin potansiyel sitotoksisite algılayabilir. Rakamlar 5-7 üzerinde net LDL akını tedavilerin etkisi için görsel bir referans olarak son bitiş noktası (4,33 h) adlı üç test hücre satır temsilcisi görüntüleri göstermek ve ayrıca sınanan aşağıdaki hücrelerinin sağlıklı morfoloji gösterir tedaviler. Hücrelerin heathy morfoloji çalışma süresi için sağlamak için her kuyudan tüm görüntülerin görsel kontrol öneririz. Örneğin, verileri gösterilmez, ne zaman HepG2 hücrelerin görüntülerini 80 mikron ile tedavi Dynasore kontrol, tabağını kaldırma, hücre dekolmanı daha yüksek konsantrasyonları, düşündüren için hücre kenarlarına göründüğü gibi biz hücre dekolmanı belirtileri gözlenen Dynasore. Ayrıca, yüksek konsantrasyonları da değişmiş morfoloji gösteren için liderliğindeki simvastatin (3-10 mikron) olarak yüksek dozlarda statin45için rapor apoptosis indüklenen. Bu iletişim kuralı, 20-80 mikron Dynasore tedavi ve hücre görüntüleri hücreleri durumunu çözümlemek ve tedavilerin potansiyel ctotoxicity belirlemek için kullanılan aşağıdaki Simvastatin, 0,5-10 mikron konsantrasyon, titrasyon gerçekleştirmek için kullanılan çeşitli konsantrasyonları. Sonuçları 40 mikron kullanım için Dyansore ve simvastatin için 1 mikron en uygun konsantrasyonlarda önerdi.
Son olarak, biz başka bir hücre satır bu yöntem ile tutarlı sonuçlar elde etmek için en uygun cep numarasını iyi ücret belirlemek için test edilecek ise bir hücre yoğunluğu titrasyon çalışma yapmak öneririz. Hücre yoğunluğu optimizasyonu çalışmamıza 10.000 hücre/iyi bir 24-şey plaka tutarlı LDL akını sonuçları HK2 ve HCAE hücreler için yol gösterdi. Hücre kümeleri son normalleştirilmiş LDL akını değerleri hataları ortaya çıkmasına gibi canlı hücre görüntüleme sistemi kullanarak bu LDL akını tahlil için eşit olarak dağıtılmış wells birleşmesi hücre monolayer arzu olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bunun nedeni için akın veri normalleştirme, faz nesne alanının hücre yoğunluğu bir önlem olarak kullanılır ve ne zaman hücre kümeleri oluşturulur Bu parametre olumsuz etkilenebilir var. Biz HepG2 hücreler hücreleri/iyi tutarsız akını sonuçlara neden 5.000 yüksek yoğunlukları, seribaşı zaman form kümeleri için bir eğilim var gözlenen; Bu nedenle, biz 5000 hücreleri 24-şey plaka bir kuyu başı en uygun yoğunluk HepG2 hücreler için kullanılır.
Toplu olarak, bizim Yöntem Farmakolojik aktivite ve sitotoksisite LDL akını aynı anda düzenleyen bileşiklerin eleme için bir orta yüksek üretilen iş platformu sağlar. Bu yöntem, ligand alımı gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için lizozomal yuvası girin diğer fluorescently etiketli ligandlar kullanılmak üzere kolayca uyarlanabilir. Bu iletişim kuralı sunarken InCucyte için özellikleri görüntüleme yaşamak ve analiz sistemi, protokol Cellomics gibi alternatif görüntüleme sistemleri için adapte edilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser LAS için aşağıdaki hibe tarafından desteklenmiştir: Ulusal Sağlık Enstitüsü (R56HL132209 ve 1R01HL140468) ve Miami kalp Araştırma Enstitüsü. KY Amerikan Kalp Derneği HGUGM Bursu (18PRE33960070) bir alıcı var. HepG2 hücreleri nazikçe Doktor Emmanuel Thomas, Miami Üniversitesi-Miller okul tıp46,47,48tarafından temin edilmiştir.
pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
MEM | Sigma | M0325 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
24 well plate | Falcon | 353226 | |
40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |