该协议提供了一种有效的方法来测量低密度脂蛋白胆固醇的吸收与实时流入率使用活细胞成像系统在不同的细胞类型。该技术提供了一个平台, 以筛选影响低密度脂蛋白流入的化合物的药理活性, 同时监测细胞形态, 从而潜在的细胞毒性。
通过低密度脂蛋白介导的内吞调节低密度脂蛋白胆固醇的吸收是代谢紊乱、心血管疾病和肾病等各种主要疾病的重要研究领域。目前, 目前还没有可用的方法来评估低密度脂蛋白的吸收, 同时监测细胞的健康。目前的研究提出了一个协议, 利用活细胞成像分析系统, 获取 ldl 流入的串行测量与同时监测细胞健康。这项新技术在四个人的细胞系 (肝、肾小管上皮和冠状动脉内皮细胞) 的四个小时的时间过程中进行了测试。此外, 该技术的敏感性是验证了著名的低密度脂蛋白摄取抑制剂, dynasore 和重组 pcsk9 蛋白, 以及低密度脂蛋白吸收启动子辛伐他汀。总之, 该方法为同时筛选药理活性和监测细胞形态提供了一个中高通量平台, 从而对调节低密度脂蛋白流入的化合物具有细胞毒性。该分析可用于不同的成像系统和分析软件。
低密度脂蛋白受体 (ldlr) 介导的低密度脂蛋白内吞是一个重要的研究领域, 因为循环低密度脂蛋白胆固醇水平是心血管疾病1、肾病2以及各种炎症的核心疾病3和遗传疾病与胆固醇突变运输基因4,5,6, 7.对 ldlr 介导的胆固醇流入的研究确定了多种研究工具, 如动力抑制剂,包括化学 dynasore 8,9,10, 以及低密度脂蛋白调节蛋白质如丙醇转化酶近地利辛/克新9型 (pcsk9)11,12。
ldl-ldr 内吞途径从将细胞表面的 ldl-ldr 复合物隔离成囊蛋白涂层坑 13开始。然后通过在液泡中侵入细胞表面膜, 使 ldl-ldr 复合物在细胞内运输而形成囊泡。当形成的囊泡成熟成早期和晚期内胚层时, ph 值在晚期内胚层内下降, 导致低密度脂蛋白与其受体 14分离。过去, ldl 流入的定量方法依赖于放射性标记125i-ldl 与细胞的共同培养, 并随后从细胞中提取放射性标记的蛋白质进行定量15。然后, 使用荧光标记的低密度脂蛋白蛋白 (如 dii-ldl), 然后使用分光光度计或平板读取器 15, 16 提取用于荧光读数的蛋白质,从而取代了这种方法。荧光标记的低密度脂蛋白也被用于荧光活化细胞分选 (facs), 用于分析低密度脂蛋白和细胞表面低密度脂蛋白结合17的内化。虽然这些方法允许在治疗后收集数据, 但在治疗期间监测细胞的可行性是不可能的。
晚期内生细胞中的酸性 ph 值允许使用 ph 激活的荧光低密度脂蛋白探针, 如 phrodo red 半数致死, 内化 18,19后会发光。此属性允许在活细胞中进行 ldl 吸收评估的连续时间过程。因此, 该协议在活细胞分析中使用 hrodo 红低密度脂蛋白荧光成像, 对低密度脂蛋白的吸收进行连续测量, 同时监测细胞健康状况。结果表明, 在三个不同的人细胞系 (人类肝癌 (hepg2) 细胞、人肾上皮细胞 (hk2) 和人冠状动脉内皮细胞 (hcaec) 中, 这种新技术经过了4个小时的测试, 具有可靠性。).这些细胞系对 ldl 清除20、21、22、23、24、25、26、27 具有重要的临床意义, 肾病 28,29,30, 31, 和心脏病 32,33, 分别。除了监测低密度脂蛋白的流入, 该协议结合了两种著名的低密度脂蛋白摄取抑制剂, dynasore 水合物和重组 pcsk9 蛋白, 以及低密度脂蛋白表达和低密度脂蛋白吸收, 辛伐他汀的司他汀诱导剂。dynasore 和重组 pcsk9 都通过不同的途径来减少低密度脂蛋白的吸收。
dynasore 是一种小分子抑制剂动力学 10 , 通过阻断 ldl-ldr 复合物10,34的 clathrn 依赖性内吞, 降低了 ldl 的吸收。另一方面, 重组 pcsc9 是肽酶 s8 家族的成员, 它与 ldlr 结合在一起, 通过阻断所需构象变化从内化复合物中释放 ldl, 抑制其对细胞表面的回收利用35,36.细胞表面 ldlr 密度的降低最终导致细胞的低密度脂蛋白吸收减少。他汀类药物, 虽然直接阻断 3-羟基-3-甲基谷蛋白辅酶 (hmg-coa) 还原酶, 从而胆固醇生物合成, 也知道提高 ldlr25,38的表达, 导致增加低密度脂蛋白的吸收。通过 dynasore 和/或重组 pcsck9 检测到 hk2、hepg2 和 hcaec 三个临床相关人类细胞系中低密度脂蛋白流入的显著减少, 以及 hpg2 细胞中低密度脂蛋白的吸收显著增加, 从而验证了该协议的敏感性。辛伐他汀在4小时的时间过程中, 对细胞形态/健康进行监测。总之, 该方法提供了一个中至高通量平台, 同时筛选调节活细胞中低密度脂蛋白吸收的化合物的药理活性和细胞毒性。
在目前的协议中, 我们展示了活细胞成像作为一种新的和更有效的方法来测量实时低密度脂蛋白吸收在一个过程中的各种人类细胞系。人类肝癌 (hepg2) 细胞通常用于研究筛查降低胆固醇的疗法21,22,23,24,25, 26, 39,40。因此, 我们选择这种细胞类型来测试活细胞成像系统的能力, 用于低密度脂蛋白流入研究。我们的研究结果表明, hepg2 细胞与这一新技术兼容, 并产生类似 sigmoid-s 的曲线, 表明在流入试验期间连续吸收低密度脂蛋白, 直到 4.33 h 作为最终终点 (图 2a和图 3)).
胆固醇的稳态在各种肾病的病理生理学中起着重要作用。事实上, 肾脏组织中胆固醇的积累是导致慢性肾病的主要导致肾纤维化的因素, 也是28、29、30、31种肾病的主要病理。因此, 我们研究了我们的方法在人肾上皮细胞 (hk2) 作为一个流行和可靠的细胞系在肾脏病学领域。我们的数据还支持了活细胞成像系统的可行性, 以测量 h2 细胞中的低密度脂蛋白流入。如图 2b 所示, h2 细胞在整个流入研究期间 (4小时) 线性吸收低密度脂蛋白胆固醇。
由于胆固醇代谢在动脉粥样硬化的发展和进展中的重要性 32,33,41, 心血管疾病的主要原因, 这反过来又是世界第一杀手42, 我们的目标是验证我们的方法在动脉粥样硬化相关的细胞类型。我们使用人冠状动脉内皮细胞 (hcaec), 因为这些是最早暴露在动脉粥样硬化患者冠状动脉腔中的胆固醇侮辱的细胞类型之一。我们的数据如图 2c所示, 这种 ldl 流入方法也有效地与 hcaec 一起工作。生成的图是类似于 hepg2 细胞的 sigmoid-n 状曲线。
为了验证这种改进的低密度脂蛋白流入方法在筛选影响低密度脂蛋白胆固醇吸收的化合物方面的有效性和敏感性, 我们使用了三种对照, 即低密度脂蛋白降升剂 dynasore 和 rpcsck9, 以及低密度脂蛋白流入激活剂辛伐他汀。在这里, 我们在检测涌入之前, 对上述细胞系 (hepg2、hk2 和 hcaec) 进行了优化浓度的 dynasore 或 rpcsck9。我们的结果表明, 所有三个测试的细胞系对治疗的反应是显著减少 ldl 流入在4小时的时间过程中 (图 2)。例如, 在 4.33 h 作为最后时间点的情况下, 以40μm 的时间对 dynasore 进行治疗, 可使 hepg2 细胞、hk2 细胞和 hcaec 中的低密度脂蛋白流入分别减少53%、68% 和 54% (p<0.0001;图 2a-c和表 2a-c)。此外, 10μgml 的 rpcsck9 使 hk2 细胞 (p<0.0001 的低密度脂蛋白流入量显著减少 55%;图 2b和表 2 b)。此外, 我们的研究结果表明, 辛伐他汀治疗 hepg2 细胞可显著增加低密度脂蛋白的吸收 (图 3), 支持这种方法检测低密度脂蛋白流入的显著变化的敏感性。本协议不包括在 hepg2 和 hcaec 细胞中使用 rpcsk9 进行治疗的研究, 因为 rpcsk9 被用作一种额外的控制治疗, 结果有据可查, 但少量购买的成本很高。因此, rpcsck9 仅用于在 h2 单元中验证此协议。
活细胞成像分析, 以及功能和及时测量低密度脂蛋白流入, 允许持续监测细胞的健康和形态。这一优势可以有效地检测应用化合物的潜在细胞毒性, 使这种方法成为同时监测药理活性和细胞毒性的理想技术。图 5-7显示了在最后终点 (4.33 h) 测试的三个细胞系的代表性图像, 作为治疗对净低密度脂蛋白流入的影响的视觉参考, 并显示了测试后细胞的健康形态治疗。我们建议对每口井的所有图像进行目视检查, 以确保细胞在研究期间的健康形态。例如, 在未显示的数据中, 当检测使用 80μm dynasore 处理的 hepg2 细胞图像时, 我们观察到细胞脱离的迹象, 因为细胞的边缘似乎正在从板上抬起, 这表明细胞脱离的浓度较高。迪纳索尔此外, 高浓度的辛伐他汀 (3-10μm) 也导致形态改变, 表明诱导凋亡, 据报告, 高剂量的司他汀45。该方案用于在20-80μm 的情况下对 dynasore 治疗进行滴定, 辛伐他汀在 0.5-10μm 浓度下进行滴定, 然后使用细胞图像分析细胞的健康状况, 并确定处理的潜在毒性。不同浓度。结果表明, 染料使用 40μm, 辛伐他汀使用1μm 作为最佳浓度。
最后, 我们建议, 如果要使用这种方法测试另一条细胞系, 则进行细胞密度滴定研究, 以确定每口井的最佳细胞数量, 从而获得一致的结果。我们的细胞密度优化研究表明, 在24孔板中, 10, 000 细胞/井可使 hk2 和 hcae 细胞获得一致的低密度脂蛋白流入结果。需要注意的是, 对于使用活细胞成像系统的 ldl 流入检测, 需要在井上均匀分布的非融合细胞单层, 因为细胞团块可能会导致最终归一化 ldl 流入值的错误。其原因是, 为了实现流入数据的规范化, 使用相位对象区域作为细胞密度的度量, 并且当单元团形成时, 此参数可能会受到不利影响。我们观察到 hepg2 细胞在密度高于5000细胞井时有形成团块的倾向, 导致不一致的流入结果;因此, 我们在一个24孔板中使用了每口 5, 000个细胞, 作为 hepg2 细胞的最佳密度。
总之, 我们的方法提供了一个中高通量平台, 筛选同时调节低密度脂蛋白流入的化合物的药理活性和细胞毒性。这种方法可以很容易地适应与其他荧光标记配体进入溶酶体隔间, 以评估配体的实时吸收。虽然该协议提供了 inucyte 实时成像和分析系统的规范, 但该协议可适用于其他成像系统, 如 cellomics。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了以下向阿盟提供的赠款的支持: 国家卫生研究所 (r56hl132209 和 1R01HL140468 68) 和迈阿密心脏研究所。ky 是美国心脏协会博士奖学金 (18pre3360070) 的获得者。迈阿密-米勒医学院46、47、48的 emmanuel thomas 博士为 hepg2细胞提供了亲切的治疗。
pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
MEM | Sigma | M0325 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
24 well plate | Falcon | 353226 | |
40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |