Isolering af Glomeruli og In Vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner
Summary
Her præsenterer vi en protokol for murine i vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner med biotin. Denne protokol indeholder oplysninger om, hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og udføre endogene immunoprecipitation af protein af interesse.
Abstract
Proteinuri skyldes forstyrrelse af det glomerulær filter, der er sammensat af fenestrated endothelium, glomerulær basalmembran og podocytes med deres slids membraner. Filteret glomerulær, især slids mellemgulvet, delikat struktur bygger på samspillet mellem forskellige celle overflade proteiner. At studere disse celle overflade proteiner har hidtil været begrænset til in vitro- undersøgelser eller histologiske analyse. Her præsenterer vi en murine i vivo biotinylation mærkning metode, som giver studier af glomerulær celle overflade proteiner under fysiologiske og patofysiologiske forhold. Denne protokol indeholder oplysninger om, hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og udføre endogene immunoprecipitation af en protein af interesse. Semi-kvantitering af glomerulær celle overflade overflod er let tilgængelige med denne nye metode, og alle proteiner tilgængelige for biotin perfusion og immunoprecipitation kan studeres. Isolering af glomeruli med eller uden biotinylation kan desuden yderligere analyse af glomerulær RNA og protein samt primære glomerulær cellekultur (dvs. primære podocyte cellekultur).
Introduction
Proteinuri er kendetegnende for glomerulær skade og normalt ledsager afbrydelse af glomerulær filter1. Filteret glomerulær er sammensat af fenestrated endothelium, glomerulær basalmembran og podocytes. Filteret glomerulær delikat molekylære struktur er meget dynamisk og underlagt celle overflade protein menneskehandel både raske og syge nyrer2,3,4,5,6 . Endocytose af celle overflade proteiner har vist sig at være afgørende for overlevelse af podocytes7. Nephrin og podocalyxin er transmembrane proteiner udtrykt på podocytes. Nephrin er rygraden i glomerulær slids mellemgulvet, mens podocalyxin er en sialoglycoprotein belægning sekundære mund processer i podocytes8,9,10. Endocytic handel har tidligere vist for nephrin og podocalyxin3,11,12,13,14.
Til bedste af vores viden, har endocytose af celle overflade proteiner ikke endnu blevet beskrevet i glomerulær endotelceller i litteraturen. Imidlertid udtrykke endotelceller generelt alle nødvendige proteiner for de forskellige typer af endocytose (dvs. clathrin-afhængige, tømmerflåde-afhængige endocytose)15,16. Derfor, endotel celle overflade handel kan studeres med denne metode bruger, for eksempel vaskulære endotel (VE)-cadherin og intracellulære vedhæftning molekyle (ICAM-2) som en celle overflade markør protein for glomerulær endotelceller17 .
Desværre, der er ingen nøjagtige in vitro- model for de sarte tre-lags glomerulær filter i hvilken celle overflade protein handel kan studeres. Målet med denne metode er således at studere glomerulær protein menneskehandel i vivo. Denne protokol indeholder desuden oplysninger om, hvordan at isolere glomeruli, muliggør yderligere analyse af glomerulær RNA, proteiner eller celler. Lignende glomerulær isolation teknikker har været beskrevet af forskellige grupper18,19.
Vi og andre har tidligere brugt ex vivo mærkning af glomerulær celle overflade proteiner af biotinylation2,3,4,20,21. Men i denne ex vivo metode, isolerede glomeruli blev udsat for mekanisk stress, som kan påvirke endocytic handel. Alternativt, immunofluorescens mærkning af glomerulær celle overflade proteiner har flittigt blevet brugt i litteratur2,20,22. Med denne metode, men kun et lille antal proteiner kan analyseres inden for ét dias, og kvantitering af immunofluorescens billeder er ofte vanskelig.
Denne roman i vivo metode giver et pålideligt redskab til at studere glomerulær celle overflade protein overflod og menneskehandel præcist i raske og syge nyrer, og det kan bruges som et supplement til immunofluorescens test.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden præsenteres muliggør vellykket isolation af glomeruli at undersøge glomerulær RNA og protein. Derudover kan primære glomerulær cellekulturer udføres fra de isolerede glomeruli. Hvis biotin er anvendt før glomerulær isolation, kan mærkning af glomerulær celle overflade proteiner udføres. Med denne metode, i vivo glomerulær celle overflade protein handel kan studeres, og semi-kvantitering af protein overflod er muligt. De mest kritiske trin til vellykket test glomerulær celle overflade protei…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Blanka Duvnjak for hendes enestående teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 til M.W. og QU280/3-1 til IQ Bidragyder spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling, analyse af data, beslutning om at offentliggøre og forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
Referenzen
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
- Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
- Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).
- Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
- Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein–nephrin–is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).
- Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
- Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
- Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).
- Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
- Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
- Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
- Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
- Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
- Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).
- Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).
