Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular
Summary
Aquí presentamos un protocolo para murino en vivo etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular con biotina. Este protocolo contiene información sobre la perfusión de los riñones de ratón, aislar glomérulos y realizar endógena inmunoprecipitación de la proteína de interés.
Abstract
Proteinuria resulta de la alteración del filtro glomerular que está conformada por el endotelio fenestrado, la membrana basal glomerular y podocytes con sus diafragmas de abertura. La delicada estructura del filtro glomerular, especialmente el diafragma de la raja, se basa en la interacción de proteínas de superficie de diversas células. Estudio de estas proteínas de superficie celular hasta el momento se ha limitado a estudios en vitro o análisis histologic. Aquí, presentamos un murino en vivo Biotinilación etiquetado método, que permite el estudio de las proteínas de superficie celular glomerular bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Este protocolo contiene información sobre la perfusión de los riñones de ratón, aislar glomérulos y realizar endógena inmunoprecipitación de la proteína de interés. Semi-cuantificación de la abundancia de superficie celular glomerular está disponible con este nuevo método y todas las proteínas accesibles a perfusión de biotina e inmunoprecipitación puede estudiarse. Además, aislamiento de glomérulos con o sin Biotinilación permite más análisis de RNA glomerular y proteínas así como glomerular primaria de la célula cultura (es decir, Podocito primario de la célula).
Introduction
Proteinuria es un sello de lesión glomerular y generalmente acompaña alteración del filtro glomerular1. El filtro glomerular está compuesto por el endotelio fenestrado, la membrana basal glomerular y podocytes. La delicada estructura molecular del filtro glomerular es altamente dinámico y sujeto a la proteína de la superficie de la célula trata de ambos riñones sano y enfermo2,3,4,5,6 . Endocitosis de proteínas de la superficie de la célula se ha demostrado para ser esencial para la supervivencia de los podocytes7. Nefrina y podocalyxin son proteínas transmembranales expresadas en podocytes. Nephrin está la espina dorsal de la membrana glomerular raja, podocalyxin es una Sialoglicoproteína capa los procesos secundario pies de podocitos8,9,10. Trata endocíticas se ha demostrado previamente para nefrina y podocalyxin3,11,12,13,14.
Al mejor de nuestro conocimiento, endocitosis de proteínas de la superficie de la célula todavía no se ha descrito en las células endoteliales glomerulares en la literatura. Sin embargo, las células endoteliales expresan en general todas las proteínas necesarias para los diferentes tipos de endocitosis (es decir, endocytosis clathrin-dependiente, dependiente de la balsa)15,16. Por lo tanto, trata de superficie de célula endotelial puede ser estudiada con este método, por ejemplo, vascular endotelial (VE)-cadherin y molécula de adhesión intracelular (ICAM-2) como una célula superficie marcador proteico de las células endoteliales glomerulares17 .
Desafortunadamente, existe un modelo exacto en vitro para el filtro glomerular tres capas delicado en que la célula trata de la proteína de la superficie puede ser estudiada. El objetivo de este método es por lo tanto para el estudio de proteína glomerular tráfico en vivo. Además, este protocolo contiene información acerca de cómo aislar los glomérulos, lo que permite más análisis de RNA, proteínas o células glomerulares. Aislamiento glomerular similar técnicas han sido descritas por diferentes grupos de18,19.
Previamente, nosotros y otros hemos usado ex vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular Biotinilación2,3,4,20,21. Sin embargo, en este método ex vivo , glomérulos aislados fueron expuestos a esfuerzos mecánicos que pueden influir en tráfico endocítico. Por otra parte, inmunofluorescencia etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular ha ampliamente utilizado en la literatura2,20,22. Con este método, sin embargo, sólo un pequeño número de proteínas puede ser analizado dentro de una diapositiva, y cuantificación de imágenes de inmunofluorescencia es a menudo difícil.
Este método de novela en vivo ofrece una herramienta confiable para el estudio celular glomerular proteína superficial abundancia y trata exactamente en sanos y enfermos riñones, y puede ser utilizado como una adición a las pruebas de inmunofluorescencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado permite aislamiento exitoso de glomérulos investigar glomerular ARN o proteína. Además, pueden realizarse cultivos de células glomerulares primarios de los glomérulos aislados. Si la biotina se aplica antes de aislamiento glomerular, etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular se puede realizar. Con este método, se puede estudiar en vivo células glomerulares trata de proteína de la superficie, y semi-cuantificación de la abundancia de la proteína es posible. Los p…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Blanka Duvnjak para su asistencia técnica excepcional. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 a M.W. y QU280/3-1 al coeficiente intelectual La donante no tenía ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos, análisis de datos, publicación y preparación del manuscrito.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
Referenzen
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