腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離
Summary
ここでマウスの体内でビオチンと腎糸球体細胞表面タンパク質のラベリングのためのプロトコルを提案する.このプロトコルは、マウス腎臓の灌流、腎糸球体に分離および興味の蛋白質の内因性の免疫沈降を実行する方法について説明します。
Abstract
蛋白尿は糸球体のフィルター窓内皮細胞、糸球体基底膜とスリットにダイアフラムの足で構成されているの中断に起因します。デリケートな糸球体のフィルター、特にスリット ダイヤフラムの構造は、さまざまな細胞表面蛋白質の相互作用に依存しています。これらの細胞の表面蛋白質を勉強ところの in vitro研究や組織学的分析にとどまってきた。標識法は、生理学的および病態生理学的条件下での腎糸球体細胞表面タンパク質の研究を可能にするマウス体内の講演を紹介します。このプロトコルは、マウス腎臓の灌流、腎糸球体に分離および興味の蛋白質の内因性の免疫沈降を実行する方法について説明します。腎糸球体細胞表面豊かな半定量はこの手法とビオチン血流にアクセス可能なすべての蛋白質ですぐに利用できる、免疫沈降法を学ぶことができます。さらに、ビオチン化の有無は糸球体を分離できますさらに主糸球体細胞培養 (つまり、プライマリ ポドサイト細胞培養) と同様、糸球体の RNA とタンパク質の解析であります。
Introduction
蛋白尿は糸球体傷害の特徴で、通常糸球体のフィルター1の破壊を伴います。糸球体のフィルターは、穴あきの内皮細胞、糸球体基底膜と足細胞で構成されます。デリケートな糸球体のフィルターの分子構造は非常に動的かつセル表面蛋白質両方健康と病気の腎臓2,3,4,5,6 で人身売買の対象.セル表面蛋白質のエンドサイトーシスは、足7の生存のために不可欠であると示されています。ネフリンとポドカリキシン足細胞に発現する膜貫通タンパク質であります。ネフリンはスリット糸球体ダイヤフラムのバックボーン ポドカリキシンはコーティング足8,9,10の二次足プロセス シアロ糖タンパク質。エンドサイトーシスの人身売買は、ネフリンとポドカリキシン3,11,12,13,14以前示されています。
我々 の知る限り、セル表面蛋白質のエンドサイトーシスまだ記載されていない文献で糸球体の内皮細胞。ところが、血管内皮細胞は、一般にエンドサイトーシス (すなわち、クラスリン依存、いかだ依存エンドサイトーシス)15,16のさまざまな種類のすべての必要な蛋白質を表現します。したがって、血管内皮 (VE) を使用してこのメソッドを学ぶことができる血管内皮細胞表面の人身売買-カドヘリンおよび細胞の細胞接着分子 (ICAM-2)17糸球体内皮細胞のマーカー蛋白質の表面.
残念ながら、繊細な糸球体 3 層のフィルター表面蛋白質の売買を検討する、セルの正確な体外モデルはありません。このメソッドの目的は、人身売買生体腎糸球体蛋白を勉強します。さらに、このプロトコルには、糸球体、さらに糸球体の RNA、蛋白質、または細胞の解析を有効にするを分離する方法に関する情報が含まれています。18,19のテクニックは別によって記述されていると同様の糸球体分離グループの。
以前は、私たちと他の人の使用している前のヴィヴォビオチン化2,3,4,20,21腎糸球体細胞表面蛋白質の分類します。ただし、この前のヴィヴォメソッドで孤立した糸球体は、エンドサイトーシス人身売買に影響を与える可能性があります機械的ストレスにさらされました。また、腎糸球体細胞表面タンパク質の蛍光標識は広範囲で使用されて文学2,20,22。この方法では、しかし、少数の蛋白質だけを 1 つのスライド内で分析できる、蛍光画像の定量は困難です。
この新しい体内法腎糸球体細胞表面蛋白質豊かさと人身売買で正確に健康と病気、腎臓を勉強する信頼性の高いツールを提供しています、蛍光抗体テストへの追加として使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
提案手法により糸球体糸球体 RNA か蛋白質を調査するための分離を成功させる。さらに、プライマリの腎糸球体細胞文化は分離の腎糸球体から実行できます。ビオチンは、糸球体の分離の前に適用されます、腎糸球体細胞表面蛋白質の分類が実行できます。この方法では、体内の腎糸球体細胞表面タンパク質輸送を学ぶことができると蛋白質量の半定量が可能です。腎糸球体細胞の表?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼女の卓越したテクニカル サポートにブランカ Duvnjak をありがとうございます。この作品は、ドイツ研究振興協会 (www.dfg.de) WO1811/2-1 m. w. に、QU280/3-1 星に想いを支えられました。出資者には、研究デザイン、データ収集、データ分析、意思決定、公開する、原稿の準備の役割はなかった。
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
Referenzen
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