Isolierung der Glomeruli und In Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine mit Biotin murinen in Vivo . Dieses Protokoll enthält Informationen zur Maus Nieren durchspülen, Glomeruli zu isolieren und endogenen Immunopräzipitation des Proteins des Interesses durchführen.
Abstract
Proteinurie ergibt sich aus der Störung des glomerulären Filters, der die gefensterten Endothels, glomeruläre Basalmembran und Podocytes mit ihren Schlitz Membranen zusammensetzt. Die zarte Struktur des glomerulären Filters, vor allem die Schlitz-Membran, stützt sich auf das Zusammenspiel der verschiedenen Zelle Oberflächenproteine. Studieren diese Zelle Oberflächenproteine wurde bisher zur in-vitro- Studien oder histologische Analyse beschränkt. Hier präsentieren wir Ihnen einen murinen in Vivo Biotinylierungen Kennzeichnung Methode, die die Untersuchung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine physiologische und pathophysiologische Bedingungen ermöglicht. Dieses Protokoll enthält Informationen zur Maus Nieren durchspülen, Glomeruli zu isolieren und endogenen Immunopräzipitation eines Proteins des Interesses durchführen. Semi-Quantifizierung der glomerulären Zelle Oberfläche Fülle ist leicht zugänglich mit dieser neuartigen Methode und alle Proteine für Biotin Perfusion zugänglich und Immunopräzipitation kann untersucht werden. Isolierung der Glomeruli mit oder ohne Biotinylierungen ermöglicht darüber hinaus weitere Analyse der glomerulären RNA und Protein sowie primäre glomeruläre Zellkultur (z. B. primäre hemolytic Zellkultur).
Introduction
Proteinurie ist ein Markenzeichen der glomerulären Verletzungen und Störungen der glomerulären Filter1in der Regel begleitet. Der glomeruläre Filter besteht aus den gefensterten Endothels glomerulären Basalmembran und Podocytes. Die zarte molekulare Struktur des glomerulären Filters ist sehr dynamisch und je nach Zelle Oberfläche Protein Menschenhandel sowohl gesunden und kranken Nieren2,3,4,5,6 . Endozytose Zelle Oberflächenproteine nachweislich essentiell für das Überleben der Podocytes7. Nephrin und Podocalyxin sind transmembrane Proteine auf Podocytes. Nephrin ist das Rückgrat der glomerulären Schlitz Membran, während Podocalyxin eine Beschichtung die sekundäre Fuß Prozesse der Podocytes8,9,10Sialoglycoprotein. Endocytic Handel wurde zuvor für Nephrin und Podocalyxin3,11,12,13,14gezeigt.
Nach bestem Wissen und gewissen wurde Endozytose Zelle Oberflächenproteine nicht noch in glomerulären Endothelzellen in der Literatur beschrieben. Allerdings äußern Endothelzellen im Allgemeinen alle notwendigen Proteine für die verschiedenen Arten von Endozytose (d. h. Clathrin-abhängige, Floß-abhängige Endozytose)15,16. Daher kann Endothelzellen Oberfläche Handel mit dieser Methode verwenden, z. B. vaskulären endothelialen (VE) untersucht werden-Cadherin und intrazellulären Adhäsionsmolekül (ICAM-2) als Zelle Oberfläche Marker Protein für glomeruläre Endothelzellen17 .
Leider gibt es keine genaue in Vitro -Modell für zarte dreischichtigen glomerulären Filters in welche Zelle Oberfläche Protein Menschenhandel studiert werden kann. Das Ziel dieser Methode ist somit glomerulären Protein des Drogenhandels in Vivozu studieren. Dieses Protokoll enthält darüber hinaus Informationen zum Glomeruli, wodurch weitere Analyse der glomerulären RNA, Proteinen und Zellen zu isolieren. Ähnliche glomerulären Isolation beschrieb Techniken von verschiedenen Gruppen18,19.
Wir und andere haben früher, ex Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine von Biotinylierungen2,3,4,20,21. Jedoch wurden in diese ex-Vivo -Methode isoliert Glomeruli mechanischen Belastung ausgesetzt, die endocytic Handel beeinflussen können. Alternativ ist die Immunfluoreszenz Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine beträchtlich in der Literatur2,20,22benutzt worden. Mit dieser Methode jedoch nur eine kleine Anzahl von Proteinen innerhalb einer Folie analysiert werden kann, und Quantifizierung von Immunfluoreszenz Bildern ist oft schwierig.
Diese neuartige in-Vivo -Methode bietet ein zuverlässiges Werkzeug um glomerulären Zelle Oberfläche Protein Fülle und Menschenhandel genau in gesunden und kranken Nieren zu untersuchen, und es kann als Ergänzung zum Immunofluoreszenz Tests verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorgestellte Methode ermöglicht erfolgreiche Isolierung der Glomeruli glomerulären RNS oder Protein zu untersuchen. Darüber hinaus können primäre glomeruläre Zellkulturen aus isolierten Glomeruli durchgeführt werden. Biotin vor glomerulären Isolierung angewendet wird, kann der glomerulären Zelle Oberflächenproteine Kennzeichnung durchgeführt werden. Mit dieser Methode in Vivo glomerulären Zelle Oberfläche Protein des Menschenhandels kann untersucht werden, und semi-Quantifizierung der Protein F?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Blanka Duvnjak für ihre außergewöhnliche technische Hilfe. Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1, M.W. und QU280/3-1, IQ Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Datenerhebung, Datenanalyse, Entscheidung, zu veröffentlichen und der Manuskripterstellung.
Materials
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | PZN:01320422 | anesthesia |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors, for cut into the aorta |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for abdominal cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery until the abdomen is opened |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | biotin |
| Dynabeads Untouched Mouse T-cells | Invitrogen | 11413D | to embolize glomeruli |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | to digest kidney tissue |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | Magnet catcher |
| 100µm cell stainer | Greiner-bio | 542000 | for glomerular isolation |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | non available | to confirm glomerular purity |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | Tissue homogenizer |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | for lysis buffer |
| Tris-HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | for lysis buffer |
| NaCl | VWR chemicals | 27810295 | for lysis buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | for lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | for lysis buffer |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | for lysis buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Follow the manufacturer's instructions |
| nephrin antibody | Progen | GP-N2 | for westernblot |
| Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody | R&D Systems | AF15556-SP | for westernblot |
| Streptavidin Agarose Resin | Thermo Scientific | 20347 | for immunoprecipitation |
| Protein A sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | for immunoprecipitation |
| polyclonal rabbit anti-p57 antibody | SCBT | sc-8298 | for Immunohistochemistry |
| mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot loading control |
| rabbit anti-p44/42 | cell signalling | 4695 | for westernblot |
| Pierce High sensitivity streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21130 | for westernblot |
| polyclonal mouse ICAM-2 antibody | R&D Systems | AF774 | for westernblot |
| polyclonal mouse anti-VE-cadherin | R&D Systems | AF1002 | for westernblot |
Referenzen
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