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Biochemie

Studi strutturali di macromolecole in soluzione con piccolo angolo x-ray Scattering

Published: November 05, 2018
doi:
10.3791/58538
, , ,
1Alberta RNA Research and Training Institute, Department of Chemistry and Biochemistry,University of Lethbridge, 2Department of Biochemistry,University of Alberta, 3Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 4DiscoveryLab, Faculty of Medicine & Dentistry,University of Alberta

Summary

Qui, presentiamo come Scattering di raggi x piccolo angolo (SAXS) può essere utilizzato per ottenere informazioni sulle buste a bassa risoluzione che rappresentano le strutture macromolecolari. Quando utilizzato in combinazione con tecniche ad alta risoluzione strutturale come la cristallografia a raggi x e risonanza magnetica nucleare, SAXS è in grado di fornire approfondimenti dettagliati in proteine di multidomain e complessi macromolecolari in soluzione.

Abstract

Interazioni proteina-proteina che coinvolgono proteine con più domini globulari presentano sfide tecniche per determinare come tale forma di complessi e come i domini sono orientati/posizionato. Qui, un protocollo con il potenziale per il delucidamento quali domini specifici mediano interazioni nel sistema multicomponente attraverso ab-initio modellazione è descritto. Un metodo per il calcolo di strutture di soluzione di macromolecole e loro assemblee è condizione che comporta l’integrazione di dati da dispersione di raggi x piccolo angolo (SAXS), cromatografia e strutture di risoluzione atomica insieme in un approccio ibrido. Un esempio specifico è quello del complesso di nidogeno Full-Length-1, che assembla le proteine della matrice extracellulare e forma una nanostruttura estesa, curvo. Uno dei suoi domini globulari attribuisce alla laminina γ-1, che strutture di membrana dello scantinato. Questo fornisce una base per la determinazione accurate strutture dei complessi della proteina del multidomain flessibile ed è abilitato per sincrotroni accoppiati con automation sistemi di cromatografia di esclusione robotica e dimensione. Questa combinazione consente un’analisi rapida in cui più Stati oligomerici sono separati appena prima della raccolta dei dati SAXS. L’analisi fornisce informazioni sul raggio di girazione, dimensione delle particelle, forma molecolare e l’associazione tra domini. Il protocollo per la generazione di modelli 3D di complessi inserendo strutture ad alta risoluzione delle proteine componente è anche dato.

Introduction

Le cellule contengono complesse reti di proteine che agiscono come macchine molecolari per svolgere funzioni cellulari quali cascate di segnalazione e mantenere l’integrità strutturale. I modi in cui questi diversi componenti muovono e interagiscono in uno spazio tridimensionale dà luogo a delle funzioni specifiche delle macromolecole. L’importanza della struttura della proteina, dinamiche e interazioni nella determinazione della funzione ha fornito la necessità di tecniche in continua evoluzione, complesse per misurare queste proprietà. Di questi, risonanza magnetica nucleare (NMR), cristallografia a raggi x (XRC) e più recentemente, Cryo-Electron microscopia (CEM) forniscono informazioni strutturali ad alta risoluzione. Tuttavia, XRC e CEM produrre strutture di uno dei molti stati biomolecolari e la mancanza di informazioni circa le dinamiche della struttura della proteina, mentre la determinazione della struttura 3D mediante NMR è in genere limitata a piccole proteine globulari. Un modo per superare queste limitazioni è quello di utilizzare il piccolo angolo x-ray Scattering (SAXS) per generare buste molecolari di sistemi grandi, multidominio o complessati e combinare le strutture macromolecolari rigide ad alta risoluzione per delucidare il globale architettura e caratteristiche dinamiche.

SAXS produce buste a bassa risoluzione di complessi macromolecolari con una risoluzione di circa 10-20 Å 1, dando visione non solo nella struttura, ma anche le caratteristiche dinamiche che Visualizza il complesso. Anche se SAXS utilizza i raggi x per scoprire la struttura molecolare, è a differenza di XRC in quanto l’orientamento isotropo casuale delle particelle in soluzione non conduce alla diffrazione, ma piuttosto di scattering, che non può cedere risoluzione atomica. Al contrario, un elettrone “busta” della macromolecola è generato che rappresenta una media delle conformazioni che visualizza la macromolecola. Questa informazioni possono essere utilizzate nel montaggio diretto delle strutture precedentemente risolto risoluzione atomica per dedurre le regioni di flessibilità in una singola proteina o organizzazione di subunità, o dinamiche in un complesso più grande, della multi-proteina. SAXS dati vengono raccolti presso i sincrotroni utilizzando ad alta energia raggi x monocromatici o da fonti interne, che offrono una fonte di raggi x più debole che richiedono ore anziché secondi di tempo di esposizione del campione (Figura 1). Dati SAXS spesso raccolti da diversi campioni con una singola installazione sperimentale e buffer, che richiedono un tempo prolungato per raccogliere una serie di dati utili su un sistema. Campioni devono, pertanto, essere stabile e non aggregando per almeno un paio d’ore sulla base di metodi di controllo di qualità verificabile come diffusione dinamica della luce (DLS) e/o analisi ultracentrifuga analitica (AUC) di ottenere alta qualità SAXS dati2 , 3. qui forniamo una descrizione pratica di SAXS, i principi dietro sua utilizzo, benefici, limitazioni e preparazione del campione e raccolta dati pesantemente sulla messa a fuoco e analisi, lungo con toccando brevemente in ab-initio modellazione utilizzando il matrice extracellulare proteine nidogeno-1 e laminin γ-1 come un esempio sperimentale.

Principi, vantaggi e limitazioni di SAXS:

I principi guida di funzionamento dietro SAXS è relativamente semplice: una soluzione di preparazione monodispersed di macromolecule(s) di interesse è collocata all’interno di un capillare ed è esposto ad un fascio di raggi x ad alta energia monocromatico. I fotoni provocare gli elettroni del guscio atomico per iniziare oscillante, con un onda sferica emessa della stessa energia e lunghezza d’onda. Poiché ogni elettrone oscillerà, si otterrà un sottofondo costante, e la densità risultante dell’elettrone della macromolecola è in contrasto con lo sfondo. L’intensità dello scattering risultante è raccolti in funzione dell’angolo di scattering, 2Θ (Figura 1).

Mentre altre tecniche come XRC, NMR e CEM forniscono informazioni strutturali a livello atomico, ci sono molteplici vantaggi di SAXS che altre tecniche non possono fornire. SAXS può essere eseguita in quasi qualsiasi buffer e non richiede alcuna preparazione del campione speciale. Ciò è particolarmente importante nello studiare il comportamento e la struttura delle macromolecole sotto diverse condizioni, come ad esempio la presenza o l’assenza di mono – o cationi bivalenti o a cambiamenti di pH4,5. SAXS ha la capacità di fornire informazioni sulle aree flessibile di una macromolecola6, qualcosa le altre tecniche elencate possono lottare con. Pertanto, SAXS può essere utilizzato come una forte tecnica gratuita con le porzioni stabile di una macromolecola di essere studiata con XRC, NRM o CEM e la macromolecola intera o complessa analizzati in bassa risoluzione con SAXS e combinati utilizzando vari strumenti di analisi tali come FoXSDock7 o CRYSOL8. Poiché SAXS è una tecnica di soluzione, esso è spesso utilizzato per confermare se strutture statiche, ad esempio quelli ottenuti da XRC sono coerenti in soluzione6. SAXS ha anche il vantaggio di essere una tecnica che richiede una quantità relativamente piccola di investimento (in genere 50-100 µ l) di campione e una quantità relativamente piccola di esperimento tempo (30 min – 1 h).

La limitazione più grande di SAXS è la vulnerabilità per esempio aggregazione e/o degradazione, che può portare a errate previsioni strutturali. Un’aggregazione, anche a partire da 5%, può diffondono la luce in quantità molto elevate, che portano ad una sovrastima della dimensione massima delle particelle (Dmax) e raggio di girazione (R,g). D’altra parte, la degradazione del campione può portare a una sottostima delle proprietà molecolari. Questa vulnerabilità si pone da SAXS essendo una tecnica media, che significa che l’omogeneità del campione è fondamentale per raggiungere risultati affidabili e riproducibili. Qualsiasi campione che deve essere analizzata da SAXS dovrebbe, pertanto, subiscono più metodi di purificazione e di controlli di omogeneità, come elettroforesi denaturante e nativo, cromatografia di esclusione di formato, dynamic light scattering e analitica ultracentrifugazione. Spesso, SAXS beamlines verrà eseguito campioni mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni come un controllo di qualità finale passo prima SAXS (S-SAXS)3,9. SAXS dati dovrebbero essere raccolti alle concentrazioni più e devono essere confrontati i Rg di ogni set di dati, garantendo una stretta somiglianza per evitare interazioni interparticella e aggregazione, che si traduce in una sovrastima della particella dimensioni, che conduce all’analisi dei dati inesatti e modellazione. Poiché la diffusione dipende dalla concentrazione e la dimensione, più piccole macromolecole possono richiedere un’ottimizzazione più specifica del campo di concentramento. Ciò è dovuto il Teorema di reciprocità, dove grandi dimensioni disperdono verso piccoli angoli e piccole dimensioni verso grandi angoli. Questo si manifesta nella raccolta dei dati, dove IO è proporzionale a R6, dove R è il raggio delle particelle. Una limitazione finale di SAXS è il potenziale per danno da radiazione al campione durante l’esposizione, che può condurre ad una distorsione dei dati. Si consiglia di confrontare la qualità del campione prima e dopo l’esposizione del campione SAXS affinché che questo non si verifica.

Protocol

1. SAXS campione preparazione e acquisizione dati Preparazione del campione: Gli esperimenti SAXS richiedono campioni omogenea, stabile e non-aggregazione proteica; osservare la stabilità e lo stato oligomerico con cromatografia di esclusione di formato (S), liste di distribuzione e/o AUC prima della raccolta dei dati. Sottoporre i campioni (nidogeno-1 e laminin γ-1 in questo caso) per analisi DLS e tricine SDS-PAGE per visualizzare esempio purezza10.Nota: I campioni possono coprire una gamma di concentrazioni (1-4 mg/mL) a seconda delle loro dimensioni, il loro comportamento di soluzione come auto-associazione e aggregazione con la stabilità; qui, cinque concentrazioni di nidogeno-1, (139 kDa), tre di laminina γ-1 (109 kDa) e quattro del complesso equimolare S-purificati sono stati preparati come descritto in precedenza10. Raccolta dati: Raccogliere i dati SAXS utilizzando un sistema in-House o sincrotrone, secondo le linee guida del produttore o struttura.Nota: I dati utilizzati in questo lavoro è stato raccolto usando un sistema interno (Vedi Tabella materiali) che contiene una 3-pinhole camera attrezzata con + 002 microfocus tubo sigillato (radiazione Kα Cu a 1.54 Å) e ottica confocale Max-Flux (CMF) operanti a 40 w. Il sistema è anche dotato di un rilevatore 2D di 200 nm multi-filo per la raccolta dati. Tuttavia, con la disponibilità di moderni sincrotroni in Francia, Germania, UK, USA e altri paesi, che forniscono accesso a un set-up S-SAXS che facilita la separazione di una preparazione di monodispersed da eventuale aggregazione/degradazione, abbiamo ora ordinariamente raccogliere dati a sincrotrone. Un articolo pubblicato di recente su un G-quadruplex di DNA11 è un esempio di una strategia di raccolta dati S-SAXS. In questo caso, sono stati raccolti i dati SAXS nella gamma di 0,08 ≤ q ≤ 0,26 Å per 3 ore per nidogeno-1 (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 e 4,0 mg/mL); la laminina γ-1 (1,5, 2,0 e 2,5 mg/mL) e il loro complesso (0.8, 1.0, 1,25 e 1,5 mg/mL). Ridurre i dati per buffer e campioni utilizzando software di elaborazione specifici del sistema. Sottrarre il contributo di buffer di dati della proteina utilizzando un programma come PRIMUS/qt12 (Figura 2A). 2. analisi dei dati Nota: Attualmente, ci sono alcuni pacchetti di software che sono utili per l’analisi dei dati SAXS: ScÅtter43 (download disponibile in www.bioisis.net), bioXtas RAW44e il ATSAS suite13. Questa sezione fornisce una panoramica dei passaggi generali da adottare quando analizzando SAXS raw dati utilizzando il ATSAS programma suite e passaggi specifici sono presi da ATSAS 2.8.1 scaricare. Altri programmi possono essere utilizzati e brevemente sono discussi più avanti. Sottrazione di bufferNota: Questi passaggi sono rilevanti per i campioni SAXS statici solo. Selezionare l’opzione di menu “Apri” in PRIMUS/qt e selezionare i file di dati di interesse. Essere consapevoli del fatto che i file di dati devono essere in formato ASCII, in cui la prima colonna è l’asse di s-vettore e la seconda colonna è l’intensità. Ripetere questo passaggio per i dati raccolti per il buffer stesso inserendo questi dati nel menu stesso. Selezionare “SUBTRACT” nella finestra di elaborazione dei dati, che genererà una curva di dispersione sottratto che rappresenta solo di scattering dalla macromolecola di interesse. Ripetere questo passaggio per ciascuna concentrazione. Guinier analisi Per eseguire analisi Guinier, caricare una curva di dispersione di buffer sottratto in PRIMUS/qt come precedentemente descritto al punto 2.1.1. Fare clic su “Raggio di girazione”, che procederà ad aprire la procedura guidata Guinier Primus; verrà visualizzato un appezzamento di ln(I) vs q2 . Per ottenere una preliminare Rg utilizzare la funzione “AUTORG”, che è un modulo esterno costruito in PRIMUS/QT. trovare il pulsante “Autorg” e fare clic su esso. Ingresso più file contemporaneamente evidenziandoli tutti e inserendoli nel menu sul lato destro, molto simile a 2.1.1. Utilizzare la trama Guinier precedentemente creata per valutare la qualità dei dati; la linea verde sotto la trama Guinier indica la trama di residui che rappresenta una linearità della fit. Essere consapevoli che non-linearità nell’analisi Guinier potrebbe essere un segno di aggregazione di esempio e ulteriori analisi non deve essere eseguita in questo caso.Nota: Una misura lineare di Guinier dà un Rg con un piccolo errore (< 5%) e suggerisce un campione di alta qualità. Analisi Kratky Caricare i dati possano essere visualizzati in modo simile, come descritto in precedenza. Fare clic su nella finestra”selezionare” accanto al nome del file di dati. Questo consente di tracciare i dati in una finestra separata. Fare clic sul pulsante “Trama” seguito da “Trama Kartky” selezione nel menu a discesa. Questo consente di tracciare i dati come “q2 x L(q) vs q”. Essere consapevoli del fatto che proteine globulari visualizzano un picco gaussiano, mentre proteine “unfolded” visualizzerà un altopiano invece un picco e assomigliano a una trama iperbolica17. L’Unione di dati Buffer di carico sottratto dati per ciascuna concentrazione in PRIMUS/qt ancora una volta, come descritto al punto 2.1.1. Per unire i dati, è sufficiente fare clic sul pulsante “Stampa unione” nella finestra di elaborazione. Ispezionare ogni curva e il numero della scala, che correla alle concentrazioni fatta dal campione originale.Nota: Campioni a più alta concentrazione di visualizzare meno rumore nella regione della coda delle curve. Distribuzione di p (r) Per generare il grafico di p (r), caricare le curve di dati uniti in PRIMUS/qt come descritto in precedenza. Fare clic sul pulsante “Distanza distribuzione” per aprire una nuova finestra che presenta i dati Uniti di intensità di sparsi luce vs q e coppia-distanza distribuzione funzione trama sul lato destro.Nota: Le informazioni sul lato destro presentano la qualità complessiva dei calcoli di funzioni di distribuzione di coppia-distanza. Regolare l’intervallo di dati dei dati Uniti per evitare qualsiasi rumore significativo alla fine della coda dei dati grezzi. Omettere i punti di dati vicino alla fermata del fascio della regione bassa-q. Per determinare l’inizio Dmax, con una gamma di ~ 5 volte la Rg ottenuti dall’analisi Guinier. Gradualmente diminuire questo valore fino a quando la trama di p (r) non scende bruscamente a zero sull’asse y e non ha una lunga coda prima di avvicinarsi a zero. Verifica che lo sperimentale Rg/ho0 (derivato da Guinier approssimazione) e P(r) Rg/ho0numeri sono simili.Nota: In alcuni casi, ulteriore manipolazione sull’intervallo di dati, i punti dati e alfa (un parametro di regolarizzazione che indica al programma il rapporto di quanta attenzione viene pagato per la scorrevolezza della distribuzione rispetto al montaggio i dati sperimentali) è anche richiesto21 per ottenere una trama di P(r) di buona qualità. 3. una perlinab initio modellazione e una media di Una volta che i dati raccolti alle concentrazioni multiple vengono Uniti, o i dati raccolti utilizzando S-SAXS sono ridotto al minimo, e la Kratky trama, la trama di P(r) e l’analisi di Guinier sono stati verificati, calcolare strutture a bassa risoluzione delle macromolecole e loro complessi. Questa pipeline può essere utilizzata per studiare le strutture della soluzione e le interazioni di acidi nucleici, proteine e acidi nucleici-proteina o proteina-proteina complessi10,11,21,22,23 ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ,33,34. Uno dei programmi più popolari è DAMMIN, sviluppato da Svergun35 e una parte del ATSAS pacchetto13, che si avvale di protocolli di ricottura simulate con informazioni preliminari ingresso Rg e Dmax . L’ab-initio approcci di modellazione e principi sono descritti dettagliatamente altrove18,36.

Representative Results

L’approccio di analisi dei dati sopra descritto è stato utilizzato per calcolare la Rg e Dmax per nidogeno-1, γ laminin-1 e il loro complesso utilizzando la funzione P(r). Abbiamo ottenuto valori Rg di 7,20 nm (± 0,10), 8.10 nm (± 0.20) e 10,9 nm (± 0,4) per nidogeno-1, γ laminin-1 e il loro complesso rispettivamente (Figura 2A-B). Inoltre, i valori Dmax di 24 nm, 26 nm e 35 nm per nidogeno-1, γ laminin-1 e il loro complesso rispettivamente (Figura 2)10 sono stati ottenuti. Il programma DAMMIF è stato utilizzato per ottenere strutture a bassa risoluzione di nidogeno-1 e laminin γ-1, che ha suggerito che entrambe le proteine adottano una forma estesa in soluzione. I valori di X e NSD per nidogeno-1 (~ 1 e 0,8) e γ laminin-1 (~0.9 e 0,8 rispettivamente) erano anche nella gamma accettabile. L’allineamento delle strutture ad alta risoluzione, due domini di nidogeno-1 e due di laminina γ-1, sulle loro strutture a bassa risoluzione ottenuta utilizzando SAXS ha permesso l’identificazione delle loro regioni di N – e C-terminale10. Nidogeno-1 è stato identificato come un partner interagente di laminina γ-139,40 e il sito di interazione è stato mappato utilizzando la cristallografia a raggi x al C-terminale domini41. Tuttavia, ad alta risoluzione strutture coinvolte solo domini interagenti e non il full-length nidogeno-1 o il braccio di γ-1 intero laminin. Di conseguenza, abbiamo purificato un complesso contenente nidogeno-1 (integrale) e il laminin γ-1 braccio per identificare le regioni interagenti anche per studiare l’orientazione relativa dei domini N-terminale di entrambe le proteine. I dati SAXS per il complesso ha reso un Rg di 10,9 nm (± 0,4) e un Dmax di 35 nm. Abbiamo utilizzato MONSA per ottenere la struttura a bassa risoluzione dell’intero complesso, che ha suggerito che, infatti, soltanto la regione C-terminale di entrambe le proteine partecipano nel mediare interazioni, mentre il resto dei domini sono molto distanti tra loro ( Figura 3, Video 1). Figura 1. Schemi di set-up SAXS. Una preparazione monodispersed di biomolecole o loro complessi è preparata, seguita dall’esposizione ai raggi x ad alta energia. A seconda dell’origine (ad es., in-House vs synchrotron), l’energia dei raggi x e il campione a distanza di origine può variare. Modello di dispersione dei raggi x (che dipende dalla dimensione e forma di biomolecole) è registrata e radialmente in media per ottenere una trama 1-dimensionali (1D) che contiene informazioni sull’intensità di luce diffusa rispetto all’angolo di scattering. Come molecole di buffer anche diffondono la luce, i contributi da queste molecole vengono sottratte per ottenere un modello di dispersione di biomolecole di interesse. Presso il sincrotrone, prima della raccolta di dati SAXS, un passo ulteriore purificazione mediante cromatografia di esclusione/ad alte prestazioni in linea formato anche in genere viene eseguito (vista superiore). Questo passaggio è fondamentale per rimuovere qualsiasi prodotto aggregato e/o degradato, nonché come per rimuovere qualsiasi biomolecole non associato dal complesso. La trama di scattering 1D viene convertita la trama di distribuzione di coppia elettrone-distanza (P(r) trama), che fornisce il raggio di girazione e dimensione massima delle particelle di biomolecole. Questa trama è utilizzata come file di input per l’ ab-initio modellazione pacchetti (cioè, DAMMIN/DAMMIF) per ottenere strutture a bassa risoluzione di biomolecole, o altri pacchetti (cioè, SASREF/CORAL) se la struttura ad alta risoluzione delle parti di le biomolecole o singole biomolecole del complesso è noto.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2. (A) un terreno di un’intensità di sparsi luce vs angolo di scattering (q = 4πsinθ/λ, nm-1) suggerendo la qualità di biomolecole (bassa regione) e forma (alta regione) di biomolecole. (B) la distribuzione di coppia elettrone-distanza P(r) determinato utilizzando i dati di scattering suggeriscono una forma allungata di biomolecole sotto inchiesta (laminina γ-1, nidogeno-1 e loro complesso). (C) Kratky trama suggerendo che nidogeno-1 e laminin γ-1 proteine non sono spiegati. (D) Guinier trama per nidogeno-1, laminina γ-1 e il loro complesso, che indica la regione lineare per la determinazione del raggio di girazione utilizzando dati a bassa dispersione dell’angolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. Struttura a bassa risoluzione del complesso di nidogeno-1 e laminin γ-1 ottenuta da analisi di insiemi di dati unite utilizzando il programma di MONSA. La combinazione di colori è lo stesso come nella figura 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Video 1. La struttura a bassa risoluzione del nidogeno-1 e laminin complesso γ-1. Questo film è stato preparato utilizzando PYMOL di visualizzare varie caratteristiche strutturali del complesso. La struttura cristallina del complesso laminin-nidogeno (PDB ID: 1NPE) è indicato come cartoni animati nastro, evidenziando l’interazione siti per questo complesso. La combinazione di colori è lo stesso come nella figura 2. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Discussion

Le fasi critiche di analisi dei dati SAXS delineato nella sezione protocollo di questa sottrazione di carta Includi buffer, Guinier analisi analisi Kratky, l’Unione di dati e distribuzione p (r). La modellazione ab-initio della perla è troppo estesa per essere coperto qui in dettaglio e pertanto è coperto solo brevemente.

Al sincrotroni (ad es. DESY in Germania, diamante nel Regno Unito ed ESRF in Francia), è possibile raccogliere dati SAXS per una frazione molto piccola (~ pochi µ l) di ciascun campione come le frazioni sono essere eluiti dalla colonna s che è collegato in linea (Vedi figura 1 ). I dati SAXS elasticamente sparsi sono radialmente media utilizzando i pacchetti forniti dal costruttore dello strumento o dal sincrotrone prima sottrazione di buffer può avvenire. I dati risultanti 1D rappresentano la quantità di luce diffusa (nei io(q)) sul Y-asse e angolo di scattering (q= 4πsinθ/λ, dove λ è la lunghezza d’onda incidente X-raggi) ed è descritto nella Figura 1. Il programma PRIMUS/qt12 viene utilizzato per sottrarre direttamente qualsiasi sfondo a causa di buffer ed è descritto nella sezione 1.1. Altri programmi come; ScÅtter43 (download disponibile in www.bioisis.net) con un tutorial disponibile presso https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeAe bioXtas RAW44 (https:// disponibili presso bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) può essere utilizzato come alternativa al pacchetto ATSAS.

L’analisi di Guinier fornisce informazioni su aggregazione di campione e omogeneità, nonché fornendo il raggio di girazione (Rg) per la macromolecola di interesse sulla base dei dati SAXS dal basso s regione14. Una trama è costruito con PRIMUS/qt per dati SAXS ottenuti da ciascuna concentrazione, seguita dalla curva di raccordo con la gamma massima di fino a 1,30 per q x Rg. Una preparazione del campione di monodispersed dovrebbe fornire una trama lineare Guinier in questa regione (Figura 2D), considerando che risultati di aggregazione in un Guinier non lineare trama15,16. Se l’analisi Guinier è lineare, il grado di “unfoldedness” di una macromolecola di interesse può essere osservato con la trama Kratky, che è utile al momento di decidere se eseguire la modellazione corpo rigido o costruire insiemi di modelli a bassa risoluzione. Una proteina globulare apparirà in un Kratky trama per avere una curva a campana, mentre esteso molecole o peptidi dispiegati apparirà altopiano o addirittura aumentare la più grande gamma di q e mancano la forma a campana (Figura 2).

Ottenendo il Rg da Guinier analisi prende in considerazione solo i punti dati dalla regione basso q del tracciato a dispersione 1D (Figura 2D), tuttavia, è possibile utilizzare quasi l’intero set di dati per eseguire una trasformazione di Fourier indiretta per convertire le informazioni di reciproco-spazio di ln (I (q)) vs (q) in una funzione di distribuzione di distanza di spazio reale (P(r)) che fornisce informazioni su max D e Rg (Figura 2B) La forma della trama P(r) rappresenta la conformazione di soluzione lordo della macromolecola di interesse18,19. la conversione dei dati reciproco-spazio ai dati real-spazio è un passo fondamentale, ma una descrizione dettagliata non è nell’ambito di questa carta. Pertanto, fare riferimento a un articolo Svergun20 a capire ogni parametro.

Una volta sottratto il buffer dati alle singole concentrazioni sono trattati attraverso analisi Guinier con un valore costante per Rg, seguita da indagare il loro modello pieghevole utilizzando Kratky analisi, è possibile unire questi dati. I dati Uniti per nidogeno-1, γ laminin-1 e il loro complesso erano trattati come descritto in precedenza e la risultante p (r) trame sono presentati in Figura 2B. Idealmente, si dovrebbe calcolare anche la funzione di distribuzione di coppia-distanza p (r) per ciascuna concentrazione per determinare se forniscono dati SAXS raccolti per ogni concentrazione simile Rg e i valori Dmax . Se il Rg e Dmax rimangono simili sopra una vasta gamma di concentrazioni, l’utente deve procedere. Si noti che a seconda del segnale, dati possono essere troncati prima l’Unione di dati. Questo è spesso il caso se le concentrazioni e/o il peso molecolare delle macromolecole sotto inchiesta è basso.

Analisi della forma a bassa risoluzione utilizzando DAMMIN può essere eseguita in vari modi (ad es. Fast, Slow, modalità esperto, ecc.). La modalità veloce è un primo passo ideale per valutare se la trama di p (r) fornisce modelli di buona qualità. In genere, almeno 10 modelli dovrebbero essere ottenute per ogni trama di p (r) verificare se si ottengono risultati riproducibili, in termini di struttura a bassa risoluzione, con una bassa bontà di fit parametro denominato χ (un valore di 0,5-1,0 è considerato buono basato sul nostro vasto lavoro ), un valore che descrive un accordo tra dati SAXS sperimentalmente raccolti e derivata dal modello dati. Ai fini della pubblicazione, noi in genere utilizza la modalità Slow o esperto e calcolare almeno 15 modelli. Oltre a DAMMIN, una versione più veloce di esso, DAMMIF37, nonché GASBOR38 sono anche alternative. Inoltre, per lo studio della proteina-proteina o proteina-nucleico acidi complessi, è possibile utilizzare il MONSA programma35, che facilita il montaggio simultaneo dei singoli dati SAXS per macromolecole così come il loro complesso. Per maggiori dettagli sui calcoli di modello ad alta risoluzione anche per studi di interazione della RNA-proteina, fare riferimento a un recente articolo Patel et al.3.

SAXS è teoricamente semplice ma senza dubbio un metodo altamente complementare ad altri strumenti di biologia strutturale e risultati in dati strutturali a bassa risoluzione che possono essere usati in monoterapia o in combinazione con tecniche ad alta risoluzione per delucidare le informazioni su struttura macromolecolare e dinamiche. Come una preparazione monodispersed di macromolecole e loro complessi possa essere ottenuta, SAXS possono essere utilizzate per studiare la struttura in soluzione e interazioni di qualsiasi tipo di macromolecole biologiche. Nel caso il complesso discusso qui, è notevole che meno del 10% della superficie complessiva accessibile di azoto-1 e laminin γ-1 è sepolto in questo complesso, considerando che il resto dei domini di entrambe le proteine sono liberamente accessibili per interagire con altri proteine della matrice extracellulare per mantenere la sua rigidità strutturale (Figura 3). Ottenimento di tali informazioni per un complesso con ~ 240kDa sarebbe stato molto difficile utilizzando altre tecniche di biologia strutturale come microscopia di Cryo-EM, NMR e cristallografia a raggi x.

Scoprire la struttura della proteina tramite cristallografia a raggi x o NMR è un processo intrinsecamente che richiede tempo. Questo collo di bottiglia nella determinazione della struttura è una zona dove SAXS Mostra la sua forza come una tecnica strutturale; acquisizione di dati per un singolo esperimento SAXS può prendere meno di un’ora e con l’aiuto del software di analisi semplificata, analisi possono essere fatto rapidamente ed efficientemente. SAXS ha il potenziale di aumentare notevolmente la velocità effettiva di studi strutturali come tecnica autonoma perché offre un modello a bassa risoluzione della struttura macromolecolare prima di dati ad alta risoluzione sono disponibili. Una barriera ad altre tecniche strutturali è il requisito per un campione altamente puro, concentrato per l’acquisizione di dati, che richiede un elevato livello di espressione della proteina e la stabilità per un lungo periodo di tempo. Mentre SAXS campioni anche bisogno di essere puri e concentrati, i volumi di campione sono all’incirca 100 µ l rendendo SAXS un metodo relativamente economico di analisi rispetto ad altre tecniche strutturali. Inoltre, SAXS accoppiato con cromatografia di esclusione di formato sta diventando sempre più comune che prevede un passaggio ulteriore controllo di qualità. Recentemente c’è stato un forte progresso nella combinazione di dati NMR e SAXS utilizzando il metodo di ottimizzazione Ensemble (EOM)45,46 per delucidare sistemi flessibili. In un recente libro di Mertens e Svergun47, gli autori descrivono esempi più recenti di EOM SAXS in combinazione con NMR, insieme a molti altri esempi di dati SAXS viene utilizzati in combinazione con NMR. I progressi sono stati fatti continuamente nel campo della SAXS e nuove tecniche sono stati sviluppati per SAXS essere utilizzato in combinazione con, non solo gratuito ad, altre tecniche strutturali. Di conseguenza, crediamo che la domanda di SAXS aumenterà solo nel corso del tempo, soprattutto in combinazione con NMR per la caratterizzazione di sistemi dinamici dove le funzioni sono definite dalla flessibilità.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto è stato supportato da NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) e Alberta Prion Research Institute / sovvenzioni Alberta innova soluzioni Bio (201600018) al modus operandi TRP è un Canada Research Chair in RNA & Biofisica della proteina (201704) e riconosce grant NSERC Discovery (RGPIN-2017-04003). TM è finanziato dalla sovvenzione NSERC scoperta di TRP.

Materials

HEK 293 EBNA Cell Line In-Lab availability – Cell line used to overexpress protein(s)
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin GE Healthcare 17524801 Affinity protein purification resin
Superdex 200 Increase 10/300 GE Healthcare 28990944 SEC Column
ÄKTA Pure FPLC GE Healthcare – FPLC System
Nanodrop Nanodrop – Spectrophotometer
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)
S-MAX3000 Rigaku – SAXS Pinhole Camera System
Zetasizer Nano-S Malvern Instruments Ltd – Dynamic Light Scattering instrument
0.1µm Filter Millipore JVWP04700 Used to Concentrate Sample Prior to DLS
Thrombin cleavage kit abcam ab207000 Thrombin cleavage to remove His tag
Strep-Tactin Sepharose Column IBA 2-1201-010 Strep-Tag Affinity Purification
D-desthiobiotin Sigma-Aldrich 533-48-2 Elution of Strep Tag Protein
Software
SAXGUI Rigaku – Data Collection for SAXS and data reduction
ATSAS Suit Franke et al., 2017 – SAXS Data Analysis Software program suite
PRIMUS Konarev et al., 2003 – Buffer Subtraction
GNOM Svergun, 1992 – Rg, Dmax and p(r) Calculation
DAMMIF Franke and Svergun, 2009 – Ab initio model calculation
DAMAVER Volkov and Svergun, 2003 – Averaged Solution Conformation calculations
MONSA Svergun, 1999 – Simultaneous model fitting for the complex
GASBOR Svergun et al., 2001 – Alternative Ab initio model calculations
DTS Software V6.20 Malvern Instruments Ltd – DLS supplied instrument software
PyMOL Schrodinger, LLC. – The PyMOL Molecular Graphics System V2.0
The Protein Data Bank Berman et al., 2000 – PDB ID: 1NPE
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Referenzen

  1. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 654-660 (2002).
  2. Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., McKenna, S. A., Bujnicki, J. M. Structural studies of RNA-protein complexes: A hybrid approach involving hydrodynamics, scattering, and computational methods. Methods. 118, 146-162 (2017).
  3. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  4. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Fink, A. L. Why are “natively unfolded” proteins unstructured under physiologic conditions?. Proteins. 41 (3), 415-427 (2000).
  5. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Millett, I. S., Khodyakova, A. V., Vasiliev, A. M., Chernovskaya, T. V., Abramov, V. M. Natively Unfolded Human Prothymosin α Adopts Partially Folded Collapsed Conformation at Acidic pH. Biochemie. 38 (45), 15009-15016 (1999).
  6. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  7. Schneidman-Duhovny, D., Hammel, M., Tainer, J. A., Sali, A. FoXS, FoXSDock and MultiFoXS: Single-state and multi-state structural modeling of proteins and their complexes based on SAXS profiles. Nucleic Acids Research. 44, 424-429 (2016).
  8. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 768-773 (1995).
  9. Pérez, J., Vachette, P. A Successful Combination: Coupling SE-HPLC with SAXS. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 183-199 (2017).
  10. Patel, T. R., Bernards, C., Meier, M., McEleney, K., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Structural elucidation of full-length nidogen and the laminin-nidogen complex in solution. Matrix Biology. 33, 60-67 (2014).
  11. Meier, M., Moya-Torres, A., Krahn, N. J., McDougall, M. D., Orriss, G. L., McRae, E. K. S. Structure and hydrodynamics of a DNA G-quadruplex with a cytosine bulge. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Franke, D., Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Panjkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H. D. T. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, 1212-1225 (2017).
  13. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  14. Tuukkanen, A. T., Svergun, D. I. Weak protein-ligand interactions studied by small-angle X-ray scattering. The FEBS Journal. 281 (8), 1974-1987 (2014).
  15. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  16. Koch, M. H., Vachette, P., Svergun, D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 36 (2), 147-227 (2003).
  17. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  18. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Applications of small-angle X-ray scattering to biomacromolecular solutions. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (2), 429-437 (2013).
  19. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  20. Patel, T. R., Morris, G. A., Zwolanek, D., Keene, D. R., Li, J., Harding, S. E. Nano-structure of the laminin γ-1 short arm reveals an extended and curved multidomain assembly. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 29 (7), 565-572 (2010).
  21. Patel, T. R., Reuten, R., Xiong, S., Meier, M., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Determination of a molecular shape for netrin-4 from hydrodynamic and small angle X-ray scattering measurements. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 31 (2), 135-140 (2012).
  22. Dzananovic, E., Patel, T. R., Deo, S., McEleney, K., Stetefeld, J., McKenna, S. A. Recognition of viral RNA stem-loops by the tandem double-stranded RNA binding domains of PKR. RNA. 19 (3), 333-344 (2013).
  23. Meier, M., Patel, T. R., Booy, E. P., Marushchak, O., Okun, N., Deo, S. Binding of G-quadruplexes to the N-terminal recognition domain of the RNA helicase associated with AU-rich element (RHAU). The Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35014-35027 (2013).
  24. Dzananovic, E., Patel, T. R., Chojnowski, G., Boniecki, M. J., Deo, S., McEleney, K. Solution conformation of adenovirus virus associated RNA-I and its interaction with PKR. Journal of Structural Biology. 185 (1), 48-57 (2014).
  25. Bacik, J. -. P., Tavassoli, M., Patel, T. R., McKenna, S. A., Vocadlo, D. J., Khajehpour, M., Mark, B. L. Conformational itinerary of Pseudomonas aeruginosa 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid kinase during its catalytic cycle. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4504-4514 (2014).
  26. Deo, S., Patel, T. R., Dzananovic, E., Booy, E. P., Zeid, K., McEleney, K. Activation of 2’ 5’-oligoadenylate synthetase by stem loops at the 5’-end of the West Nile virus genome. PloS One. 9 (3), e92545 (2014).
  27. Vadlamani, G., Thomas, M. D., Patel, T. R., Donald, L. J., Reeve, T. M., Stetefeld, J., Mark, B. L. The β-lactamase gene regulator AmpR is a tetramer that recognizes and binds the D-Ala-D-Ala motif of its repressor UDP-N-acetylmuramic acid (MurNAc)-pentapeptide. The Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2630-2643 (2015).
  28. Deo, S., Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., Dzananovic, E., McEleney, K., McKenna, S. A. Characterization of the termini of the West Nile virus genome and their interactions with the small isoform of the 2’ 5’-oligoadenylate synthetase family. Journal of Structural Biology. 190 (2), 236-249 (2015).
  29. Ariyo, E. O., Booy, E. P., Patel, T. R., Dzananovic, E., McRae, E. K., Meier, M., McKenna, S. A. Biophysical Characterization of G-Quadruplex Recognition in the PITX1 mRNA by the Specificity Domain of the Helicase RHAU. PloS One. 10 (12), (2015).
  30. Hyde, E. I., Callow, P., Rajasekar, K. V., Timmins, P., Patel, T. R., Siligardi, G., Scott, D. J. Intrinsic disorder in the partitioning protein KorB persists after co-operative complex formation with operator DNA and KorA. The Biochemical Journal. 474 (18), 3121-3135 (2017).
  31. Dzananovic, E., Astha, n. u. l. l., Chojnowski, G., Deo, S., Booy, E. P., Padilla-Meier, P., McKenna, S. A. Impact of the structural integrity of the three-way junction of adenovirus VAI RNA on PKR inhibition. PloS One. 12 (10), (2017).
  32. Krahn, N., Meier, M., To, V., Booy, E. P., McEleney, K., O’Neil, J. D., Stetefeld, J. Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork. Biophysical Journal. 113 (12), 2609-2620 (2017).
  33. Patel, T. R., Besong, T. M. D., Meier, M., McEleney, K., Harding, S. E., Winzor, D. J., Stetefeld, J. Interaction studies of a protein and carbohydrate system using an integrated approach: a case study of the miniagrin-heparin system. European Biophysics Journal: EBJ. , (2018).
  34. Svergun, D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  35. Blanchet, C. E., Svergun, D. I. Small-Angle X-Ray Scattering on Biological Macromolecules and Nanocomposites in Solution. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 37-54 (2013).
  36. Volkov, V. V., Svergun, D. I. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 36, 860-864 (2003).
  37. Kozin, M. B., Svergun, D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. Journal of Applied Crystallography. 34 (1), 33-41 (2001).
  38. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (Pt 2), 342-346 (2009).
  39. Svergun, D. I., Petoukhov, M. V., Koch, M. H. J. Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophysical Journal. 80 (6), 2946-2953 (2001).
  40. Baumgartner, R., Czisch, M., Mayer, U., Pöschl, E., Huber, R., Timpl, R., Holak, T. A. Structure of the nidogen binding LE module of the laminin gamma1 chain in solution. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 658-668 (1996).
  41. Stetefeld, J., Mayer, U., Timpl, R., Huber, R. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factor-like (LE) modules of laminin gamma1 chain harboring the nidogen binding site. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 644-657 (1996).
  42. Takagi, J., Yang, Y., Liu, J. -. H., Wang, J. -. H., Springer, T. A. Complex between nidogen and laminin fragments reveals a paradigmatic beta-propeller interface. Nature. 424 (6951), 969-974 (2003).
  43. Förster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J. Appl. Cryst. 43, 639-646 (2010).
  44. Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. J. Appl. Cryst. 50, 1545-1553 (2017).
  45. Bernadó, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. (17), 5656-5664 (2007).
  46. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  47. Mertens, H. D. T., Svergun, D. I. Combining NMR and small angle X-ray scattering for the study of biomolecular structure and dynamics. Arch Biochem Biophys. 628, 33-41 (2017).

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Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).
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