JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemie

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

Published: November 05, 2018
doi:
10.3791/58538
, , ,
1Alberta RNA Research and Training Institute, Department of Chemistry and Biochemistry,University of Lethbridge, 2Department of Biochemistry,University of Alberta, 3Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 4DiscoveryLab, Faculty of Medicine & Dentistry,University of Alberta

Summary

כאן, אנו מציגים כיצד פיזור קרני רנטגן זווית קטנה (SAXS) יכול להיות מנוצל כדי לקבל מידע על מעטפות ברזולוציה נמוכה המייצג את המבנים macromolecular. בעת שימוש בשילוב עם טכניקות מבניים ברזולוציה גבוהה כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית, SAXS יכול לספק נתונים היסטוריים תובנות וחשבונות חלבונים ו macromolecular מתחמי בפתרון.

Abstract

אינטראקציות חלבון-חלבון לערב חלבונים עם תחומים מרובים הכדוריים מציגים אתגרים טכניים לקביעת איך מהטפסים מתחמי ואת האופן שבו קבוצות המחשבים אוריינטציה/מוצבים. . הנה, מתואר פרוטוקול עם פוטנציאל שחקרתי אינטראקציות התחלקות אילו תחומים ספציפיים במערכת ל דרך ab initio דוגמנות. שיטה לחישוב פתרון מבנים של מקרומולקולות וההרכבות שלהם הוא בתנאי המערבת שילוב נתונים זווית קטנה רנטגן פיזור (SAXS), ביולוגיה מולקולרית, ברזולוציה אטומית מבנים יחד בגישה היברידית. דוגמה ספציפית היא של המתחם של nidogen באורך מלא-1, אשר מרכיב חלבוני מטריצה חוץ-תאית וצורות של ננו-מבנה מורחב, מעוגל. אחד התחומים הכדוריים שלו מייחסת laminin γ-1, אשר מבנים קרום המרתף. זה מספק בסיס לקביעת מבנים מדויק של מתחמי חלבון וחשבונות גמיש, מופעלת על ידי מקורות synchrotron בשילוב עם רובוטיקה וגודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה מערכות אוטומציה. שילוב זה מאפשר ניתוח מהיר שבו מופרדים למספר מצבים oligomeric רק לפני איסוף נתונים SAXS. הניתוח התשואות מידע על הרדיוס של רגע, ממד של חלקיקים, הצורה המולקולרית, זיווג בין קבוצות מחשבים. הפרוטוקול ליצירת דגמי תלת-ממד של מתחמי על ידי התאמת מבנים ברזולוציה גבוהה של החלבונים רכיב ניתנת גם.

Introduction

התאים מכילים רשתות מורכבות של חלבונים שפועלים למכונות המולקולריות כדי לבצע פונקציות הסלולר כגון איתות cascades ושמירה על שלמות מבנית. הדרכים שבה מרכיבים שונים אלה לנוע ולתקשר במרחב תלת הולידה פונקציות ספציפיות של מקרומולקולות. החשיבות של מבנה החלבון, דינמיקה, אינטראקציות בקביעת פונקציה סיפק את הצורך טכניקות המתפתחת ללא הרף, מורכבים למדידת תכונות אלו. אלה, תהודה מגנטית גרעינית (NMR), קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן (XRC) ועוד לאחרונה, הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ (CEM) לספק נתוני מבנה ברזולוציה גבוהה. אולם, XRC ו CEM תשואות מבנים של אחת המדינות למערכות ביולוגיות רבות, חוסר מידע אודות הדינמיקה של מבנה החלבון, תוך קביעת מבנה תלת-ממדי על ידי NMR מוגבל בדרך כלל קטן יותר הכדוריים חלבונים. דרך אחת כדי להתגבר על מגבלות אלה היא לנצל את קטן זווית צילום רנטגן פיזור (SAXS) כדי ליצור מעטפות המולקולרי של מערכות גדולות, וחשבונות ומורכבת או, ולשלב את המבנים macromolecular נוקשה ברזולוציה גבוהה התירי העולמי אדריכלות ותכונות דינמי.

SAXS מייצר מעטפות ברזולוציה נמוכה של מתחמי macromolecular עם רזולוציה של 10-20 Å 1, נותן תובנה לא רק לתוך המבנה, אלא גם את מאפייני דינמי המציג המתחם. למרות SAXS מנצל רנטגן כדי לחשוף את המבנה המולקולרי, זה בניגוד XRC בכך כיוון איזוטרופיות אקראי של החלקיקים בתמיסה אינו מוליד עקיפה, אלא מעדיף פיזור, אשר לא יכול להניב ברזולוציה אטומית. במקום זאת, אלקטרון “מעטפת” מקרומולקולה נוצר מייצג ממוצע של הצורות המציג מקרומולקולה. מידע זה יכול לשמש ישירה ההתאמה של מבנים ברזולוציה אטומית פתור בעבר להסיק מחוזות גמישות חלבון יחיד או יחידת משנה בארגון, או דינאמיקה של מתחם גדול יותר חלבון רב. SAXS נתונים נאספים synchrotrons שימוש באנרגיה גבוהה רנטגן מונוכרומטי או ממקורות ללא צורך במיקור חוץ, אשר מציעים מקור רנטגן חלש יותר הדורשים שעות ולא שניות של המדגם זמן החשיפה (איור 1). SAXS נתונים נאספים לעתים קרובות מדגימות מספר עם הגדרת הניסוי יחיד, מאגר, הדורשים זמן ממושך כדי לאסוף את סיבוב של נתונים שימושיים במערכת. דוגמאות, לכן, להיות ויציבה ללא צבירה לפחות לכמה שעות המבוסס על שיטות בקרת איכות לאימות כגון פיזור אור דינאמי (DLS) ו/או ניתוח אנליטי ultracentrifuge (AUC) כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה SAXS2 , 3. כאן אנו מספקים תיאור מעשי של SAXS, העקרונות מאחורי השימוש שלה, הטבות, מגבלות, הכנת הדוגמא, המוקד בכבדות על איסוף נתונים, ניתוח, יחד עם נגיעה בקצרה על ab initio מידול בעזרת מטריצה חוץ-תאית חלבונים nidogen-1 ו- laminin γ-1 כדוגמה ניסיוני.

עקרונות, יתרונותיה וחסרונותיה של SAXS:

Principle(s) המנחה מאחורי SAXS היא פשוטה יחסית: פתרון של הכנת monodispersed macromolecule(s) עניין ממוקם בתוך נימי והוא חשוף קרן רנטגן באנרגיה גבוהה מונוכרומטי. חלקיקי האור לגרום אלקטרונים של מעטפת האטום כדי להתחיל נדנוד, וכתוצאה מכך גל כדורית הנפלטת של אותה אנרגיה, אורך הגל. מאז כל אלקטרון נעים, רקע מתמיד תושג, צפיפות אלקטרונים וכתוצאה מכך מקרומולקולה הוא מנוגד לרקע. עוצמת הפיזור וכתוצאה מכך נאסף כפונקציה של זווית פיזור, 2Θ (איור 1).

ואילו טכניקות אחרות כגון XRC NMR, צ’ם לספק מידע מבניים ברמה אטומית, קיימים יתרונות מרובים SAXS טכניקות אחרות לא יכול לספק. SAXS ניתן לבצע כמעט כל מאגר, אינו דורש כל הכנה מיוחדת מדגם. הדבר חשוב במיוחד ללמוד את התנהגות ואת המבנה של מקרומולקולות בתנאים שונים, כגון נוכחות או היעדרות של מונו – או קטיונים דו ערכיים או שינויים ב- pH4,5. SAXS יש את היכולת לספק מידע אודות אזורים גמישים של מקרומולקולה6, משהו טכניקות המפורטים אחרות נאבקות עם. לכן, SAXS יכול לשמש חזקה ללא תשלום טכניקה בחלקים יציב של ישות מקרומולקולה למדה עם XRC, NRM או צ’ם של מקרומולקולה כולו או מורכבות ניתח ברזולוציה נמוכה עם SAXS ושילב באמצעות מגוון כלי ניתוח, כזה FoXSDock7 או CRYSOL8. מאחר SAXS היא טכניקה פתרון, זה משמש לעתים קרובות כדי לאשר אם סטטי מבנים כגון אלו המתקבל XRC יהיו עקביות פתרון6. SAXS יש גם את היתרון של להיות טכניקה הדורשת כמות קטנה יחסית של מדגם ההשקעה (בדרך כלל µL 50-100) ואת כמות קטנה יחסית של זמן הניסוי (30 דקות – 1h).

המגבלה הגדולה של SAXS היא הפגיעות מדגם צבירת ו/או השפלה, אשר יכול להוביל תחזיות מבניים שגוי. מצבור, אפילו המתחילים 5%, יכול פיזור אור בכמויות גבוהות מאוד, המוביל אל הערכה מופרזת של חלקיקים מקסימלי ממד (Dmax), רדיוס עומדים (Rg). מצד שני, דוגמת השפלה יכול להוביל אל תזלזל של תכונות מולקולאריות. פגיעות זו נובע SAXS להיות שיטת חישוב ממוצע רגיל, מה שאומר כי המדגם הומוגניות הוא קריטי להשגת תוצאות אמין לשחזור. דוגמה זו כדי להיות מנותח על ידי SAXS צריך, לכן, עוברים בשיטות מרובות של היטהרות, בדיקות הומוגניות, כגון denaturing, יליד אלקטרופורזה בג’ל, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה, אור דינאמי פיזור, אנליטיים ultracentrifugation. לעתים קרובות, SAXS beamlines יפעל דגימות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים כפקד איכות סופית צעד לפני3,SAXS (S-SAXS)9. SAXS נתונים צריכים להיאסף בריכוזים מרובים ו Rg של כל ערכת נתונים להשוות, להבטיח דמיון קרוב כדי למנוע צבירת, ובאמצעי הערכה מופרזת של החלקיקים אינטראקציות interparticle מידות, שמוביל ניתוח נתונים לא מדויקים, מידול. מאז פיזור תלוי ריכוז וגודל, מקרומולקולות קטנים יותר עשויים לדרוש אופטימיזציה יותר ספציפי של טווח הריכוז. זאת בשל משפט ההדדיות, איפה במידות גדולות פיזור לקראת קטן זוויות וגדלים קטן לכיוון בזוויות גדולות. דבר הבא לידי ביטוי באוסף נתונים, אניO איפה פרופורציונליים ל- R6, כאשר R הוא הרדיוס של חלקיקים. מגבלה הסופי של SAXS הוא פוטנציאל נזק הקרינה לדגימת במהלך חשיפה, מה שעלול לגרום לעיוות של הנתונים. . זה תרגול טוב כדי להשוות איכות מדגם לפני ואחרי חשיפה מדגם SAXS כדי להבטיח שזאת אינה מתרחשת…

Protocol

1. SAXS לטעום הכנה ורכישת נתונים הכנת הדוגמא: ניסויים SAXS דורשים דגימות חלבון הומוגנית, יציבה, ללא צבירה; צפו יציבות המדינה oligomeric עם גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (S), DLS ו/או חאן אל לפני איסוף נתונים. נושא דגימות (nidogen-1 ו- laminin γ-1 במקרה זה) ועד ניתוח DLS tricine מרחביות-דף להמחיש מדגם טוהר10.הערה: דגימות עשוי לכסות טווח הריכוזים (1-4 מ”ג/מ”ל) בהתאם לגודל שלהם, התנהגותם פתרון כגון האגודה עצמית וצבירת יחד עם יציבות; . חמש ריכוזי nidogen-1, (139 kDa), שלוש laminin γ-1 (109 kDa) וארבע של המתחם equimolar S-טיהור הוכנו כמו שתואר לעיל10. איסוף הנתונים: איסוף נתונים SAXS באמצעות מערכת פנימית או סינכרוטרון, בהתאם להנחיות היצרן או מתקן.הערה: הנתונים המשמשים בעבודה זו נאסף באמצעות המערכת ללא צורך במיקור חוץ (ראה טבלה של חומרים) המכילה 3-pinhole המצלמה מצויד + microfocus 002 אטום צינור (קרינה Cu Kα-1.54 Å) ואופטיקה קונאפוקלית מקס השטף (CMF) פועלים ב 40 W. המערכת מצויד גם עם 200 ננומטר האזנה מרובה 2D גלאי עבור איסוף נתונים. עם זאת, עם הזמינות של synchrotrons מודרני ב צרפת, גרמניה, בריטניה, ארה ב, ומדינות נוספות, המספקות גישה הגדרת S-SAXS אשר מקלה על ההפרדה של הכנה monodispersed של צבירת אפשרי/השפלה, אנחנו עכשיו באופן שגרתי איסוף נתונים סינכרוטרון מתקנים. מאמר שפורסם לאחרונה הדי ג’י-quadruplex11 הוא דוגמה של אסטרטגיית אוסף נתונים S-SAXS. במקרה זה, הנתונים SAXS נאספו בטווח של עד 0.08 q ≤ 0.26 Å במשך 3 שעות nidogen-1 (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 ו 4.0 מ”ג/מ”ל); ה-laminin γ-1 (1.5, 2.0 ו- 2.5 מ”ג/מ”ל) ומורכב שלהם (0.8, 1.0, 1.25 ו- 1.5 mg/mL). להפחית את הנתונים עבור מאגר ודוגמאות באמצעות תוכנת עיבוד ספציפיים למערכת. להחסיר את התרומה מאגר נתונים חלבון באמצעות תוכנית כמו פרימוס/qt12 (איור 2 א). 2. ניתוח נתונים הערה: כיום יש כמה חבילות תוכנה שימושיים עבור ניתוח נתונים של SAXS: ScÅtter43 (הורד זמין במלון www.bioisis.net), bioXtas גלם44ו- סוויטת ATSAS13. סעיף זה מספק מבט כולל על שלבים כלליים שיש לנקוט בעת ניתוח SAXS גלם נתונים באמצעות ATSAS את תוכנית סוויטת צעדים ספציפיים לקוחים את ATSAS 2.8.1 להוריד. תוכניות אחרות יכול לשמש, בקצרה נידונות מאוחר יותר. מאגר חיסורהערה: השלבים הרלוונטיים עבור דגימות SAXS סטטי בלבד. בחר את אפשרות התפריט ‘פתח’ פרימוס/qt, בחר את קבצי הנתונים של עניין. להיות מודע כי נתוני הקבצים להיות בתבנית ASCII, שבה העמודה הראשונה הוא הציר s-וקטור, העמודה השניה ויש העוצמה. חזור על שלב זה עבור הנתונים שנאספו עבור מאגר עצמה על-ידי הוספת הנתונים באותו התפריט. בחר “חיסור” בחלון עיבוד נתונים, אשר יפיק עקומת פיזור החיבור המייצג רק פיזור מקרומולקולה עניין. חזור על שלב זה עבור כל הריכוז. ניתוח Guinier כדי לבצע ניתוח Guinier, טען עקומת פיזור מאגר המופחת פרימוס/qt כפי שתואר קודם לכן בשלב 2.1.1. לחץ על “רדיוס של רגע” אשר ימשיך לפתוח את אשף Guinier פרימוס; מגרש של ln(I) לעומת q2 יוצגו. כדי להשיג ראשוני Rg להשתמש בפונקציה “AUTORG”, אשר נבנה מודול חיצוני לחיפוש פרימוס/qt. על כפתור “Autorg” ואז לחץ עליו פעמיים. קלט קבצים מרובים בו-זמנית על-ידי סימונם כל והכנסת אותם לתוך התפריט בצד ימין, דומה מאוד 2.1.1. השתמש העלילה Guinier יצר קודמת כדי להעריך את איכות הנתונים; הקו הירוק תחת העלילה Guinier מציג את העלילה תמלוגים המייצג של ליניאריות של התאים. להיות מודע כי אי-ליניאריות בניתוח Guinier יכול להיות סימן של מצבור לדוגמה, ניתוח נוסף לא לבצע במקרה זה.הערה: התאמה לינארית Guinier נותן של Rg עם טעות קטנה (< 5%) ומציעה דגימה באיכות גבוהה. ניתוח Kratky לטעון את הנתונים ניתן לאבחן באופן דומה כפי שתואר לעיל. לחץ על “בחר בתיבת” לצד שם קובץ הנתונים. זה להתוות את הנתונים בחלון נפרד. לחץ על לחצן “עלילה” ואחריו “”מזימה Kartky”בחירה בתפריט הנפתח. זה להתוות את הנתונים כמו “קיו2 x vs L(q) q”. שימו לב כי חלבונים הכדוריים להציג לשיא לפי עקומת גאוס, בעוד חלבונים פרש להציג רמה במקום לשיא ומזכירים את העלילה היפרבולי17. מיזוג נתונים מאגר עומס המופחת נתונים עבור כל ריכוז פרימוס/qt שוב, כמו שלב 2.1.1. כדי למזג את הנתונים, פשוט לחץ על לחצן “מיזוג” בחלון עיבוד. לבדוק כל עקומה ואני את סולם מספר, לאפקטים דילולים זני המדגם המקורי.הערה: דגימות-ריכוז גבוה יותר להציג פחות רעש באזור הזנב של העקומות. P(r) הפצה כדי להפיק את העלילה P(r), לטעון את הנתונים הממוזגים העקומות לתוך פרימוס/qt כאמור תיאר. לחץ על לחצן “מרחק הפצה” כדי לפתוח חלון חדש המציג את הנתונים הממוזגים של עוצמת פזורים אור לעומת q וזוג-המרחק הפצה הפונקציה plot בצד ימין.הערה: המידע בצד ימין מציג את האיכות הכוללת של חישובים פונקציית התפלגות זוג-המרחק. התאם את טווח הנתונים הנתונים הממוזגים כדי למנוע רעש משמעותית בקצה הזנב של הנתונים הגולמיים. להשמיט נקודות נתונים בקרבת התחנה קרן באזור נמוך-q. כדי לקבוע את ההתחלה Dmax, עם מגוון של 5 פעמים ~ Rg המתקבל הניתוח Guinier. בהדרגה להקטין את הערך עד העלילה P(r) אינה ירידה בבת אחת אפס בציר ה-y ואין לו סירה ארוכת־זנב בטרם הם פונים אל אפס. בדוק כי ניסיוני Rg/אני0 (נגזר Guinier קירוב) ו- P(r) Rg/אני0מספרים דומים.הערה: במקרים מסוימים, בהמשך מניפולציה על הטווח של נתונים, נקודות נתונים אלפא (ההסדרה פרמטר אשר מספרת התוכנית על היחס של כמה תשומת לב מוקדשת את החלקות של ההתפלגות בהשוואה התאמת המידע מהניסוי) נמצא גם נדרש21 כדי לקבל מגרש P(r) באיכות טובה. 3.b initio חרוז מידול, בממוצע לאחר מיזוג הנתונים שנאספו בריכוזים מרובים, או הנתונים שנאספו באמצעות S-SAXS הוא ממוזער, מגרש Kratky, P(r) העלילה וניתוח Guinier אומתו, לחשב מבנים ברזולוציה נמוכה של מקרומולקולות, מתחמי שלהם. צינור זה יכול לשמש כדי ללמוד פתרון מבנים ואינטראקציות של חומצות גרעין, חלבונים, חומצות גרעין-חלבון או חלבון מתחמי10,11,21,22,23 ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 33, ,34. אחת התוכניות הפופולריות ביותר היא DAMMIN, שפותחה על ידי Svergun35 , וחלק ATSAS החבילה13, אשר מעסיקה פרוטוקולים מחזק מדומה עם מידע ראשוני קלט על Rg ו- Dmax . Ab initio דוגמנות גישות ועקרונות מתוארים ב פירוט במקום18,36.

Representative Results

הגישה ניתוח הנתונים שתוארו לעיל היה מנוצל כדי לחשב את Rg ו- Dמקס nidogen-1, laminin γ-1 של מתחם שלהם באמצעות הפונקציה P(r). השגנו ערכי Rg 7.20 nm (±0.10), 8.10 חת אקו nm (±0.20) ו- 10.9 nm (±0.4) nidogen-1, laminin γ-1, מתחם שלהם בהתאמה (איור 2 א-ב). בנוסף, ערכי Dמקסימום 24 nm, 26 ננומטר, ו-35 ננומטר nidogen-1, laminin γ-1 של מתחם שלהם בהתאמה (איור 2)10 התקבלו. התוכנית DAMMIF שימש כדי להשיג מבנים ברזולוציה נמוכה של nidogen-1 ו- laminin γ-1, אשר הציע שני חלבונים לאמץ צורת מורחב בפתרון. ערכי X ו- NSD nidogen-1 (~ 1 ו- 0.8) ו- laminin γ-1 (~0.9 ו- 0.8 בהתאמה) גם הם היו על הטווח המקובל. היישור של מבנים ברזולוציה גבוהה, שתי קבוצות המחשבים של nidogen-1 ו-2 laminin γ-1, על מבנים ברזולוציה נמוכה שלהם תוך שימוש SAXS מותר זיהוי של האזורים שלהם N – ו C-מסוף10. Nidogen-1 זוהה שותף אינטראקציה של laminin γ-139,40 , האתר אינטראקציה מופה בעזרת קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן כדי תחומים C-מסוף41. עם זאת, מבנים ברזולוציה גבוהה רק מעורב שמעצבת תחומים ולא את nidogen-1 באורך מלא או הזרוע γ-1 laminin כולו. לכן, אנחנו טהור של קומפלקס המכיל nidogen-1 (באורך מלא) וזרוע γ-1 laminin כדי לזהות את האזורים שמעצבת גם כדי ללמוד את הכיוון היחסי של N-מסוף קבוצות המחשבים של שני חלבונים. הנתונים SAXS למתחם הניב של Rg של 10.9 nm (±0.4) ו יחמרבי של 35 ננומטר. אנחנו מנוצל MONSA כדי להשיג את המבנה ברזולוציה נמוכה של המתחם כולו, אשר הציע כי אכן, רק אזור C-מסוף של שני חלבונים להשתתף תיווכה אינטראקציות, ואילו שאר התחומים הם רחוקים אחד מהשני ( איור 3, וידאו 1). איור 1. . השרטוטים של הגדרת SAXS הכנה monodispersed של מולקולות או קומפלקסים שלהם מוכן, ואחריו חשיפה עם אנרגיה גבוהה רנטגן. בהתאם לסוג מקור (למשל, ללא צורך במיקור חוץ לעומת סינכרוטרון), האנרגיה של צילומי רנטגן, המדגם מקור מרחק יכול להשתנות. דפוס הפיזור של צילומי הרנטגן (זה תלוי הגודל והצורה של מולקולות) הוקלט, בצורה רדיאלית בממוצע כדי לקבל מגרש חד-מימדי (1 ד) המכיל מידע על עוצמת האור מפוזר ביחס הזווית פיזור. כמו מאגר מולקולות גם פיזור אור, התרומה מולקולות אלה הן המופחת כדי לקבל דפוס הפיזור של מולקולות עניין. ב סינכרוטרון, לפני איסוף הנתונים SAXS, גם בדרך כלל מתבצע שלב טיהור נוסף באמצעות כרומטוגרפיה הדרה/ביצועים גבוהים בתוך שורה בגודל (מבט מלמעלה). שלב זה הוא קריטי כדי להסיר כל מוצר צבורים ו/או מפורק גם כדי להסיר את כל מולקולות לא מאוגד מהמתחם. העלילה פיזור 1D מומר העלילה זוג אלקטרון-המרחק הפצה (P(r) העלילה), אשר מספק את רדיוס עומדים וממד חלקיקים המרבי של מולקולות. מגרש זה משמש את קובץ הקלט עבור ab initio מידול חבילות (קרי, DAMMIN/DAMMIF) להשיג מבנים ברזולוציה נמוכה של מולקולות או חבילות אחרות (קרי, SASREF/אלמוג) אם המבנה ברזולוציה גבוהה של חלקים מולקולות או מולקולות בודדות של המתחם ידוע.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2- (א) חלקת עוצמה של פזורים אור לעומת פיזור זווית (q = 4πsinθ/λ, nm-1) מציע את האיכות של מולקולות (אזור נמוך) וצורה (אזור גבוה) של מולקולות. (ב) התפלגות זוג אלקטרון-המרחק P(r) נקבע מתוך נתוני הפיזור מציעים צורה מוארכת של מולקולות תחת חקירה (laminin γ-1, nidogen-1 ומתחם שלהם). (ג) Kratky עלילה רומז כי nidogen-1 וחלבונים γ-1 laminin אינם פרש. (ד) העלילה Guinier nidogen-1, laminin γ-1, מתחם שלהם, המציינת את האזור הליניארי לקביעת רדיוס עומדים שימוש בנתונים בזווית נמוכה-פיזור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3- מבנה ברזולוציה נמוכה של המתחם של nidogen-1, וγ laminin-מתקבל על ידי ניתוח של ערכות נתונים ממוזגים באמצעות התוכנית MONSA 1. ערכת הצבעים היא אותו הדבר כמו באיור 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. וידאו 1. המבנה ברזולוציה נמוכה של nidogen-1 ו- laminin γ-1 מתחם. הסרט הזה הוכן בעזרת PYMOL להציג באופן חזותי תכונות מבניות שונות של המתחם. מבנה הגביש של המתחם laminin-nidogen (מזהה PDB: 1NPE) מוצג בתור קריקטורות רצועת הכלים, הדגשת למרבה הצער באתרי מתחם זה. ערכת הצבעים היא אותו הדבר כמו באיור 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Discussion

השלבים הקריטיים של ניתוח נתונים SAXS המתוארים בסעיף פרוטוקול זה נייר כלול מאגר חיסור, Guinier ניתוח, ניתוח Kratky, מיזוג נתונים והפצה P(r). הדגמים חרוז ab initio מדי נרחב מכוסה כאן בפירוט, לכן רק מכוסה בקצרה.

ב- synchrotrons (למשל דזי בגרמניה, יהלום בבריטניה, ESRF בצרפת), זה אפשרי לאיסוף נתונים SAXS עבור חלקיק קטן מאוד (~ µL כמה) של כל מדגם כשברים להיות eluted מהעמודה זה מחובר בשורה (ראה איור 1 ). הנתונים SAXS elastically פזורים הוא בממוצע בצורה רדיאלית באמצעות החבילות המסופקים על ידי היצרן מכשיר או את סינכרוטרון לפני מאגר חיסור יכול להתקיים. הנתונים המתקבלים 1D מייצג את כמות האור מפוזר (ב אני(q)) ב- Y-ציר והזווית פיזור (q= 4πsinθ/λ, איפה λ הוא אורך הגל של האירוע X-קרני), המותווה באיור1. התוכנית פרימוס/qt12 משמש להפחתת ישירות איזשהו רקע עקב מאגר, המתוארת בסעיף 1.1. תוכניות אחרות כגון; ScÅtter43 (הורד זמין במלון www.bioisis.net) עם ערכת לימוד זמינים ב https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeAוב bioXtas גלם44 (https:// לרשותכם bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) יכול להיות מנוצל כחלופה החבילה ATSAS.

הניתוח Guinier מספק מידע על צבירת מדגם הומוגניות וכן מתן רדיוס של רגע (Rg) מקרומולקולה עניין בהתבסס על הנתונים SAXS מכל אזור נמוך s 14. מגרש נבנה עם פרימוס/qt עבור נתונים SAXS המתקבל בכל ריכוז, ואחריו עקומה פולינומיאלית עם הטווח המרבי של עד 1.30 עבור q x Rg. הכנת הדוגמא monodispersed צריך לספק מגרש Guinier ליניארית באזור זה (איור דו-ממדי), ואילו צבירת תוצאות ב Guinier לא לינארית מגרש15,16. אם הניתוח Guinier הוא ליניארי, מידת “unfoldedness” של מקרומולקולה עניין יכול להיות שנצפו עם העלילה Kratky, אשר הוא שימושי כאשר מחליטים לבצע דוגמנות של גוף קשיח או לבנות הרכבים של מודלים ברזולוציה נמוכה. חלבון הכדוריים יופיעו Kratky העלילה יש עקומת פעמון, ואילו מורחב מולקולות או פפטידים פרש יופיעו מישור או אפילו להגדיל בטווח q גדול, חסר הצורה בל (איור 2C).

קבלת את Rg מניתוח Guinier רק מחשיבה נקודות נתונים מאזור נמוך q של העלילה פיזור 1 י (איור דו-ממדי), זאת, אפשר להשתמש כמעט את כל הנתונים (dataset) כדי לבצע שינוי צורה עקיפה של פורייה כדי להמיר את מידע הדדיים-שטח של ln (I (q)) לעומת (q) מרחב אמיתי מרחק פונקציית ההתפלגות (P(r)) אשר מספק מידע על Dמקס ו- Rg (איור 2B) הצורה של העלילה P(r) מייצג את קונפורמציה פתרון דוחה מקרומולקולה של עניין18,19. ההמרה של נתוני הדדיים-החלל לנתוני אמת-שטח הוא שלב קריטי אך תיאור מפורט אינו בתוך הטווח של מאמר זה. לכן, עיין מאמר מאת Svergun20 להבין כל פרמטר.

ברגע המופחת למאגר נתונים בריכוזים בודדים מעובד באמצעות ניתוח Guinier עם ערך עקבית עבור Rg, ואחריו חוקרים דפוס קיפול שלהם באמצעות ניתוח Kratky, ניתן למזג נתונים אלה. הנתונים הממוזגים nidogen-1 laminin γ-1, מתחם שלהם עובדו כמתואר לעיל, P(r) וכתוצאה מכך מתווה מוצגים איור 2B. באופן אידיאלי, אחד צריך גם לחשב את פונקציית ההתפלגות של זוג-המרחק P(r) עבור כל ריכוז כדי לקבוע אם SAXS הנתונים שנאספו עבור כל ריכוז מספק דומה Rg וערכי Dmax . אם Rg Dmax נותרו דומים בטווח רחב של ריכוזים, ואז המשתמש צריך להמשיך. יצוין כי בהתאם האות, נתונים יכול להיחתך לפני מיזוג הנתונים. לעתים קרובות זהו המקרה אם ריכוז ו/או המשקל המולקולרי של מקרומולקולות תחת חקירה של נמוכה.

ניתן לבצע ניתוח צורה ברזולוציה נמוכה באמצעות DAMMIN מצבים שונים (למשל מהיר, איטי, מצבי מומחה, וכו ‘). מצב מהיר הוא שלב ראשון אידיאלי כדי להעריך אם העלילה P(r) מספק איכות טובה מודלים. בדרך כלל, לפחות 10 דגמים צריכה להתקבל לכל מגרש P(r) לבדוק אם מתקבלים תוצאות לשחזור, מבחינת המבנה ברזולוציה נמוכה, עם מחווה נמוכה של פרמטר מתאים שנקרא χ (ערך של 0.5-1.0 נחשב טוב מבוסס על העבודה הנרחב שלנו ), ערך המתארת הסכם בין הנתונים שנאספו השפעול SAXS נגזר מודל הנתונים. לצורך פרסום, אנו בדרך כלל להשתמש במצב איטי או מומחה, לחשב לפחות 15 דגמים. בנוסף DAMMIN, גירסה מהירה יותר של זה, DAMMIF37, כמו גם GASBOR38 הם גם חלופות. יתר על כן, ללמוד חלבון או חלבון-nucleic מתחמי חומצה, זה ניתן להשתמש MONSA תוכנית35, המאפשרת התאמה בו זמנית של הנתונים SAXS בודדות הן מקרומולקולות, כמו גם מתחם שלהם. לקבלת פרטים נוספים על החישובים דגם ברזולוציה גבוהה גם ללימודי אינטראקציית חלבון ה-RNA, עיין מאמר מאת פאטל ואח3.

SAXS היא תיאורטית פשוטה אבל ללא ספק שיטה משלימה ביותר תוצאות נתונים מבניים ברזולוציה נמוכה, בהם ניתן להשתמש בכוחות עצמו או בשילוב עם טכניקות ברזולוציה גבוהה להבהיר מידע וכלים אחרים ביולוגיה מבנית על מבנה macromolecular ואת הדינמיקה. כל עוד ניתן להשיג monodispersed הכנה של מקרומולקולות, מתחמי שלהם, SAXS יכול להיות מנוצל כדי ללמוד בפתרון מבנה ואינטראקציות של כל סוג של מקרומולקולה ביולוגי. במקרה של המתחם שנדונו כאן, זה מדהים זה פחות מ-10% על פני השטח הכולל הנגיש של חנקן-1 ו- laminin γ-1 קבור במתחם הזה, ואילו שאר התחומים של שני חלבונים נגישים באופן חופשי לקיים אינטראקציה עם אחרים חלבונים-מטריצה חוץ-תאית כדי לשמר את קפדנותה מבניים (איור 3). קבלת מידע כזה עבור מתחם עם ~ 240kDa יהיה מאוד מאתגר באמצעות טכניקות טיפול נוספות ביולוגיה מבנית קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן NMR, מיקרוסקופיה הקפאה-EM.

חשיפת מבנה החלבון באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או NMR היא תהליך מטבעו גוזלת זמן. זה צוואר בקביעת מבנה זה תחום אחד שבו SAXS מראה את עוצמתה כמו טכניקה מבניים; חדרי קירור והקפאה עבור ניסוי SAXS יחיד יכול לקחת פחות משעה, בעזרת ניתוח יעיל תוכנה, ניתוח יכול להיעשות במהירות וביעילות. SAXS יש פוטנציאל להגדיל באופן משמעותי את התפוקה של מחקרים מבניים כמו טכניקה עצמאית כי הוא מציע מודל ברזולוציה נמוכה של המבנה macromolecular לפני נתונים ברזולוציה גבוהה זמינה. מחסום טכניקות מבניות אחרות היא הדרישה מדגם מאוד טהור, מרוכז עבור ייבוא נתונים, אשר מחייבת רמה גבוהה של חלבון ביטוי ויציבות על פני תקופה ארוכה של זמן. בעוד SAXS דוגמאות גם צריך להיות טהור ומרוכז, אמצעי האחסון מדגם הם בערך 100 µL שהופך SAXS שיטה זולה יחסית של ניתוח לעומת טכניקות מבניות אחרות. יתר על כן, SAXS יחד עם גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה הופך להיות נפוץ יותר ויותר אשר מספק צעד בקרת איכות נוספים. לאחרונה חלה ההתקדמות חזק השילוב של נתונים NMR, SAXS באמצעות45,את שיטת אופטימיזציה אנסמבל (לבחירות)46 התירי מערכות גמיש. בעיתון זה התבצעה על ידי מרטנס ולא Svergun47, המחברים מתארים מספר דוגמאות לבחירות SAXS בשילוב עם NMR, יחד עם דוגמאות רבות אחרות של נתונים SAXS בשימוש בשילוב עם NMR האחרונות. ההתקדמות נעשים ללא הרף בשדה של SAXS, טכניקות חדשות מתבצעת שפותחו עבור SAXS לשמש בשילוב עם, לא רק מחמאה, טכניקות מבניות אחרות. כתוצאה מכך, אנו מאמינים כי הביקוש SAXS רק יגביר לאורך זמן, במיוחד בשילוב עם לאפיון מערכות דינאמיות איפה פונקציות מוגדרות על-ידי גמישות NMR.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה בתמיכתם NSERC RGPIN-2018-04994, חדשנות תוכנית הקמפוס אלברטה (RCP-12-002 C), מכון מחקר פריון אלברטה פתרונות ביו מחדשת של אלברטה (201600018) מענקים על שיטת הפעולה TRP זה כיסא מחקר קנדה ב- RNA & ביופיזיקה חלבון (201704) ובהיותו גילוי NSERC גרנט (RGPIN-2017-04003). TM ממומן על ידי מענק גילוי NSERC TRP.

Materials

HEK 293 EBNA Cell Line In-Lab availability – Cell line used to overexpress protein(s)
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin GE Healthcare 17524801 Affinity protein purification resin
Superdex 200 Increase 10/300 GE Healthcare 28990944 SEC Column
ÄKTA Pure FPLC GE Healthcare – FPLC System
Nanodrop Nanodrop – Spectrophotometer
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)
S-MAX3000 Rigaku – SAXS Pinhole Camera System
Zetasizer Nano-S Malvern Instruments Ltd – Dynamic Light Scattering instrument
0.1µm Filter Millipore JVWP04700 Used to Concentrate Sample Prior to DLS
Thrombin cleavage kit abcam ab207000 Thrombin cleavage to remove His tag
Strep-Tactin Sepharose Column IBA 2-1201-010 Strep-Tag Affinity Purification
D-desthiobiotin Sigma-Aldrich 533-48-2 Elution of Strep Tag Protein
Software
SAXGUI Rigaku – Data Collection for SAXS and data reduction
ATSAS Suit Franke et al., 2017 – SAXS Data Analysis Software program suite
PRIMUS Konarev et al., 2003 – Buffer Subtraction
GNOM Svergun, 1992 – Rg, Dmax and p(r) Calculation
DAMMIF Franke and Svergun, 2009 – Ab initio model calculation
DAMAVER Volkov and Svergun, 2003 – Averaged Solution Conformation calculations
MONSA Svergun, 1999 – Simultaneous model fitting for the complex
GASBOR Svergun et al., 2001 – Alternative Ab initio model calculations
DTS Software V6.20 Malvern Instruments Ltd – DLS supplied instrument software
PyMOL Schrodinger, LLC. – The PyMOL Molecular Graphics System V2.0
The Protein Data Bank Berman et al., 2000 – PDB ID: 1NPE
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 654-660 (2002).
  2. Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., McKenna, S. A., Bujnicki, J. M. Structural studies of RNA-protein complexes: A hybrid approach involving hydrodynamics, scattering, and computational methods. Methods. 118, 146-162 (2017).
  3. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  4. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Fink, A. L. Why are “natively unfolded” proteins unstructured under physiologic conditions?. Proteins. 41 (3), 415-427 (2000).
  5. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Millett, I. S., Khodyakova, A. V., Vasiliev, A. M., Chernovskaya, T. V., Abramov, V. M. Natively Unfolded Human Prothymosin α Adopts Partially Folded Collapsed Conformation at Acidic pH. Biochemie. 38 (45), 15009-15016 (1999).
  6. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  7. Schneidman-Duhovny, D., Hammel, M., Tainer, J. A., Sali, A. FoXS, FoXSDock and MultiFoXS: Single-state and multi-state structural modeling of proteins and their complexes based on SAXS profiles. Nucleic Acids Research. 44, 424-429 (2016).
  8. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 768-773 (1995).
  9. Pérez, J., Vachette, P. A Successful Combination: Coupling SE-HPLC with SAXS. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 183-199 (2017).
  10. Patel, T. R., Bernards, C., Meier, M., McEleney, K., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Structural elucidation of full-length nidogen and the laminin-nidogen complex in solution. Matrix Biology. 33, 60-67 (2014).
  11. Meier, M., Moya-Torres, A., Krahn, N. J., McDougall, M. D., Orriss, G. L., McRae, E. K. S. Structure and hydrodynamics of a DNA G-quadruplex with a cytosine bulge. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Franke, D., Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Panjkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H. D. T. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, 1212-1225 (2017).
  13. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  14. Tuukkanen, A. T., Svergun, D. I. Weak protein-ligand interactions studied by small-angle X-ray scattering. The FEBS Journal. 281 (8), 1974-1987 (2014).
  15. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  16. Koch, M. H., Vachette, P., Svergun, D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 36 (2), 147-227 (2003).
  17. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  18. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Applications of small-angle X-ray scattering to biomacromolecular solutions. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (2), 429-437 (2013).
  19. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  20. Patel, T. R., Morris, G. A., Zwolanek, D., Keene, D. R., Li, J., Harding, S. E. Nano-structure of the laminin γ-1 short arm reveals an extended and curved multidomain assembly. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 29 (7), 565-572 (2010).
  21. Patel, T. R., Reuten, R., Xiong, S., Meier, M., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Determination of a molecular shape for netrin-4 from hydrodynamic and small angle X-ray scattering measurements. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 31 (2), 135-140 (2012).
  22. Dzananovic, E., Patel, T. R., Deo, S., McEleney, K., Stetefeld, J., McKenna, S. A. Recognition of viral RNA stem-loops by the tandem double-stranded RNA binding domains of PKR. RNA. 19 (3), 333-344 (2013).
  23. Meier, M., Patel, T. R., Booy, E. P., Marushchak, O., Okun, N., Deo, S. Binding of G-quadruplexes to the N-terminal recognition domain of the RNA helicase associated with AU-rich element (RHAU). The Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35014-35027 (2013).
  24. Dzananovic, E., Patel, T. R., Chojnowski, G., Boniecki, M. J., Deo, S., McEleney, K. Solution conformation of adenovirus virus associated RNA-I and its interaction with PKR. Journal of Structural Biology. 185 (1), 48-57 (2014).
  25. Bacik, J. -. P., Tavassoli, M., Patel, T. R., McKenna, S. A., Vocadlo, D. J., Khajehpour, M., Mark, B. L. Conformational itinerary of Pseudomonas aeruginosa 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid kinase during its catalytic cycle. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4504-4514 (2014).
  26. Deo, S., Patel, T. R., Dzananovic, E., Booy, E. P., Zeid, K., McEleney, K. Activation of 2’ 5’-oligoadenylate synthetase by stem loops at the 5’-end of the West Nile virus genome. PloS One. 9 (3), e92545 (2014).
  27. Vadlamani, G., Thomas, M. D., Patel, T. R., Donald, L. J., Reeve, T. M., Stetefeld, J., Mark, B. L. The β-lactamase gene regulator AmpR is a tetramer that recognizes and binds the D-Ala-D-Ala motif of its repressor UDP-N-acetylmuramic acid (MurNAc)-pentapeptide. The Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2630-2643 (2015).
  28. Deo, S., Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., Dzananovic, E., McEleney, K., McKenna, S. A. Characterization of the termini of the West Nile virus genome and their interactions with the small isoform of the 2’ 5’-oligoadenylate synthetase family. Journal of Structural Biology. 190 (2), 236-249 (2015).
  29. Ariyo, E. O., Booy, E. P., Patel, T. R., Dzananovic, E., McRae, E. K., Meier, M., McKenna, S. A. Biophysical Characterization of G-Quadruplex Recognition in the PITX1 mRNA by the Specificity Domain of the Helicase RHAU. PloS One. 10 (12), (2015).
  30. Hyde, E. I., Callow, P., Rajasekar, K. V., Timmins, P., Patel, T. R., Siligardi, G., Scott, D. J. Intrinsic disorder in the partitioning protein KorB persists after co-operative complex formation with operator DNA and KorA. The Biochemical Journal. 474 (18), 3121-3135 (2017).
  31. Dzananovic, E., Astha, n. u. l. l., Chojnowski, G., Deo, S., Booy, E. P., Padilla-Meier, P., McKenna, S. A. Impact of the structural integrity of the three-way junction of adenovirus VAI RNA on PKR inhibition. PloS One. 12 (10), (2017).
  32. Krahn, N., Meier, M., To, V., Booy, E. P., McEleney, K., O’Neil, J. D., Stetefeld, J. Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork. Biophysical Journal. 113 (12), 2609-2620 (2017).
  33. Patel, T. R., Besong, T. M. D., Meier, M., McEleney, K., Harding, S. E., Winzor, D. J., Stetefeld, J. Interaction studies of a protein and carbohydrate system using an integrated approach: a case study of the miniagrin-heparin system. European Biophysics Journal: EBJ. , (2018).
  34. Svergun, D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  35. Blanchet, C. E., Svergun, D. I. Small-Angle X-Ray Scattering on Biological Macromolecules and Nanocomposites in Solution. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 37-54 (2013).
  36. Volkov, V. V., Svergun, D. I. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 36, 860-864 (2003).
  37. Kozin, M. B., Svergun, D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. Journal of Applied Crystallography. 34 (1), 33-41 (2001).
  38. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (Pt 2), 342-346 (2009).
  39. Svergun, D. I., Petoukhov, M. V., Koch, M. H. J. Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophysical Journal. 80 (6), 2946-2953 (2001).
  40. Baumgartner, R., Czisch, M., Mayer, U., Pöschl, E., Huber, R., Timpl, R., Holak, T. A. Structure of the nidogen binding LE module of the laminin gamma1 chain in solution. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 658-668 (1996).
  41. Stetefeld, J., Mayer, U., Timpl, R., Huber, R. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factor-like (LE) modules of laminin gamma1 chain harboring the nidogen binding site. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 644-657 (1996).
  42. Takagi, J., Yang, Y., Liu, J. -. H., Wang, J. -. H., Springer, T. A. Complex between nidogen and laminin fragments reveals a paradigmatic beta-propeller interface. Nature. 424 (6951), 969-974 (2003).
  43. Förster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J. Appl. Cryst. 43, 639-646 (2010).
  44. Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. J. Appl. Cryst. 50, 1545-1553 (2017).
  45. Bernadó, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. (17), 5656-5664 (2007).
  46. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  47. Mertens, H. D. T., Svergun, D. I. Combining NMR and small angle X-ray scattering for the study of biomolecular structure and dynamics. Arch Biochem Biophys. 628, 33-41 (2017).

Tags

Small Angle X-ray ScatteringSAXSStructural StudiesMacromoleculesBiomoleculesBiophysical MethodsStructural BiologyStructure-based TherapeuticsNanoparticlesDrug DeliveryData AnalysisATSAS Software SuiteGuinier AnalysisRadius Of Gyration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image