JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemie

Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Published: November 05, 2018
doi:
10.3791/58538
, , ,
1Alberta RNA Research and Training Institute, Department of Chemistry and Biochemistry,University of Lethbridge, 2Department of Biochemistry,University of Alberta, 3Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 4DiscoveryLab, Faculty of Medicine & Dentistry,University of Alberta

Summary

Hier presenteren we hoe kleine Angle X-Ray Scattering (SAXS) kan worden gebruikt om informatie op lage resolutie enveloppen die vertegenwoordigen de macromoleculaire structuur te verkrijgen. Wanneer gebruikt in combinatie met hoge resolutie structurele technieken zoals röntgendiffractie en nucleaire magnetische resonantie, bieden SAXS gedetailleerde inzichten in multidomain eiwitten en macromoleculaire complexen in-oplossing.

Abstract

Eiwit-eiwit interacties eiwitten met meerdere bolvormige domeinen presenteren technische uitdagingen voor het bepalen van hoe dergelijke complexen vorm en hoe de domeinen zijn georiënteerd/geplaatst. Hier, wordt een protocol met het potentieel voor het ophelderen van welke specifieke domeinen bemiddelen interacties in multicomponent systeem via ab initio modellering beschreven. Een methode voor de berekening van structuren van de oplossing van macromoleculen en hun samenstellingen is op voorwaarde dat gaat gepaard met de integratie van gegevens uit kleine hoek X-ray scattering (SAXS), chromatografie en atomaire resolutie structuren samen in een hybride benadering. Een concreet voorbeeld is dat van het complex van full-length nidogen-1, die de extracellulaire matrix eiwitten assembleert en vormt een uitgebreide, gebogen nanostructuur. Een van zijn bolvormige domeinen hecht aan laminin γ-1, waarbij de kelder membraan structuren. Dit vormt de basis voor het bepalen van de nauwkeurige structuren van flexibele met meerdere domeinen eiwitcomplexen en door synchrotron bronnen in combinatie met Robotica en grootte uitsluiting chromatografie automatiseringssystemen is ingeschakeld. Deze combinatie zorgt ervoor dat snelle analyse waarin meerdere oligomere bestuurlijk vlak voor SAXS gegevensverzameling worden gescheiden. De analyse levert informatie over de straal van traagheidsstralen, deeltje dimensie, moleculaire vorm en beheertaken koppelen. Het protocol voor het genereren van 3D-modellen van complexen door het aanbrengen van high-resolution structuren van de eiwitten van de component wordt ook gegeven.

Introduction

Cellen bevatten ingewikkelde netwerken van eiwitten die als moleculaire machines cellulaire functies fungeren zoals signalering cascades en handhaven van de structurele integriteit te vervullen. De wijze waarop deze verschillende onderdelen verplaatsen en werken in de driedimensionale ruimte geeft aanleiding tot de specifieke functies van de macromoleculen. Het belang van de eiwitstructuur, dynamiek en interactie in het bepalen van de functie heeft gegeven de behoefte aan voortdurend veranderende, complexe technieken voor het meten van deze eigenschappen. Van deze, nucleaire magnetische resonantie (NMR), röntgendiffractie (XRC) en meer onlangs, Cryo-Elektron microscopie (CEM) bieden hoge resolutie structurele informatie. Echter XRC CEM opbrengst structuren van een van de vele biomoleculaire Staten en gebrek aan informatie over de dynamiek van de eiwitstructuur, terwijl 3D structuurbepaling door NMR meestal beperkt tot kleinere bolvormige eiwitten is. Een manier om deze beperkingen te overwinnen is gebruik maken van kleine Angle X-Ray Scattering (SAXS) moleculaire enveloppen van groot, met meerdere domeinen of complexvorm systemen worden gegenereerd, en combineren de high-resolution rigide macromoleculaire structuren voor het ophelderen van de globale architectuur en dynamische functies.

SAXS produceert met een lage resolutie enveloppen van macromoleculaire complexen met een resolutie van ongeveer 10-20 Å 1, geeft inzicht, niet alleen in de structuur, maar ook de dynamische kenmerken die het complex wordt weergegeven. Hoewel SAXS maakt gebruik van röntgenstraling om moleculaire structuur bloot te leggen, is het in tegenstelling tot XRC in dat de willekeurige isotrope oriëntatie van de deeltjes in oplossing niet leidt diffractie, maar verstrooiing, die atomaire resolutie niet kan opleveren. In plaats daarvan wordt een elektron “envelop” van de macromolecule gegenereerd dat betekent een gemiddelde van de conformaties waarin de macromolecule worden weergegeven. Deze informatie kan afleiden van de regio’s flexibiliteit in een enkele eiwit of subeenheid organisatie of dynamiek in een grotere, multi eiwit complex in directe montage van eerder opgelost atomaire resolutie structuren worden gebruikt. SAXS gegevens is verzameld op synchrotrons met hoog-energetische monochromatisch x-stralen, of van interne bronnen, die bieden een zwakkere bron van x-stralen die uren in plaats van seconden van monster blootstellingstijd (Figuur 1). SAXS gegevens worden vaak verzameld uit verschillende monsters met een enkele experimentele opzet en buffer, waarvoor een langere tijd aan een ronde van nuttige gegevens verzamelen over een systeem. Monsters, daarom moet stabiel en niet-aggregeren voor minstens een paar uur op basis van controleerbare kwaliteitscontrole methoden zoals dynamische lichtverstrooiing (DLS) en/of analyse van de analytische ultracentrifuge (AUC) verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige SAXS gegevens2 , 3. hier voorzien wij een praktische beschrijving van SAXS, de principes achter haar gebruik, voordelen, beperkingen en bereiding van de monsters en focus zwaar op gegevensverzameling en analyse, samen met elkaar raken kort op ab initio modellering met behulp van de extracellulaire matrix eiwitten nidogen-1 en laminin γ-1 als een experimentele voorbeeld.

Beginselen, voordelen en beperkingen van SAXS:

De leidende principle(s) achter SAXS is relatief eenvoudig: een oplossing van de voorbereiding van de monodispersed van macromolecule(s) van belang wordt in een capillair geplaatst en wordt blootgesteld aan een hoge monochromatisch X-ray energiestraal. De fotonen veroorzaken elektronen van het Atoom shell om te beginnen oscillerende, resulterend in een sferische golf van de dezelfde energie en golflengte worden uitgestoten. Aangezien elke elektron schommelen zal, een constante achtergrond zal worden bereikt, en de resulterende dichtheid van het elektron van het macromolecule staat in contrast tot de achtergrond. De resulterende verstrooiing intensiteit wordt verzameld als een functie van de hoek van de verstrooiing, 2Θ (Figuur 1).

Terwijl andere technieken zoals XRC, NMR en CEM bieden structuurgegevens op het atomaire niveau, zijn er meerdere voordelen aan SAXS die andere technieken niet kunnen bieden. SAXS kan worden uitgevoerd in bijna elke buffer en vereist speciale monstervoorbereiding. Dit is vooral belangrijk bij het bestuderen van het gedrag en de structuur van macromoleculen onder wisselende omstandigheden, zoals de aanwezigheid of afwezigheid van mono – of divalente kationen of veranderingen in de pH4,5. SAXS heeft de mogelijkheid om gegevens over flexibele regio’s van een macromolecuul6, iets de andere genoemde technieken met worstelen kunnen. Daarom kan SAXS worden gebruikt als een sterke gratis techniek met de stabiele delen van een macromolecuul wezen studeerde met XRC, NRM of CEM en de gehele macromolecule of complexe geanalyseerd in lage resolutie met SAXS en gecombineerd gebruik van verschillende analysehulpmiddelen dergelijke Als FoXSDock7 of8van de CRYSOL. Aangezien SAXS een oplossing-techniek is, wordt het vaak gebruikt om te bevestigen als statische structuren zoals die verkregen XRC in oplossing6 stroken. SAXS heeft ook het voordeel dat een techniek die een relatief kleine hoeveelheid monster investeringen (meestal 50-100 µL) en een relatief kleine hoeveelheid experiment tijd (30 min – 1 h) vereist.

De grootste beperking van SAXS is de kwetsbaarheid voor monster aggregatie en/of degradatie, die tot onjuiste structurele voorspellingen leiden kan. Een samenvoeging, zelfs zo laag als 5%, kan het verstrooien van licht in zeer hoge bedragen, wat leidt tot een overschatting van de maximale deeltje dimensie (D-max) en de radius van traagheidsstralen (Rg). Aan de andere kant, kan de aantasting van het monster leiden tot een onderschatting van moleculaire eigenschappen. Dit beveiligingslek komt voort uit SAXS wordt een gemiddelde techniek, wat betekent dat monster homogeniteit cruciaal is voor een betrouwbare en reproduceerbare resultaten te boeken. Een monster dat moet worden geanalyseerd door SAXS daarom meerdere methoden voor de zuivering en homogeniteit controles, zoals denatureren en inheemse de Elektroforese van het gel, grootte uitsluiting chromatografie, dynamisch licht verstrooiing, moet ondergaan en analytische ultracentrifugatie. SAXS straallijnen loopt vaak monsters door krachtige vloeibare chromatografie als een laatste kwaliteitscontrole stap voordat SAXS (S-SAXS)3,9. SAXS gegevens moeten worden verzameld bij meerdere concentraties en de Rg van elke gegevensset moet worden vergeleken, zorgen voor een nauwe gelijkenis Voorkom interparticle interacties en aggregatie, wat in een overschatting van deeltje resulteert afmetingen, wat leidt tot onjuiste data-analyse en modellering. Aangezien de verstrooiing, is afhankelijk van zowel de concentratie en de grootte, kunnen kleinere macromoleculen een specifiekere optimalisatie van het concentratiebereik vereisen. Dit is te wijten aan de Stelling van de wederkerigheid, waar grote maten naar kleine hoeken en kleine maten tot grote hoeken verstrooien. Dit manifesteert zich in de gegevensverzameling, waar ikO is evenredig aan R6, waarin R de straal van het deeltje is. Een laatste beperking van SAXS is het potentieel voor schade door straling aan het monster tijdens de blootstelling, die tot verstoring van de gegevens leiden kan. Het is verstandig om te vergelijken met monster kwaliteit vóór en na SAXS monster blootstelling om ervoor te zorgen dat dit zich niet voordoet.

Protocol

1. SAXS Sample voorbereiding en Data-acquisitie Bereiding van de monsters: SAXS experimenten vereisen homogene, stabiel en niet-aggregeren EiwitSteekproeven; observeren van stabiliteit en oligomere staat met grootte uitsluiting chromatografie (S), DLS en/of AUC voorafgaand aan het verzamelen van gegevens. Onderwerpen van monsters (nidogen-1 en laminin γ-1 in dit geval) aan DLS analyse en tricine SDS-pagina te visualiseren monster zuiverheid10.Opmerking: Monsters kunnen betrekking hebben op een aantal uiteenlopende concentraties (1-4 mg/mL) afhankelijk van hun grootte, hun oplossing gedrag zoals zelfstandige vereniging en aggregatie samen met stabiliteit; hier vijf concentraties van nidogen-1, (139 kDa), drie laminin γ-1 (109 kDa) en vier van het S-gezuiverd mengsel complex werden voorbereid als eerder beschreven10. Gegevensverzameling: SAXS gegevens met behulp van een in-house systeem of synchrotron, verzamelen volgens de richtlijnen van de fabrikant of faciliteit.Opmerking: Gegevens die worden gebruikt in dit werk werd verzameld met behulp van een in-house systeem (Zie Tabel van materialen) dat bevat een 3-pinhole camera uitgerust met + 002 microfocus verzegelde buis (Cu Kα straling bij 1,54 Å) en Confocal Max-Flux (CMF) optica op 40 W. Het systeem is ook voorzien van een 200 nm multi draad 2D detector voor gegevensverzameling. Echter, met de beschikbaarheid van moderne synchrotrons in Frankrijk, Duitsland, UK, USA en andere landen, die toegang verschaffen tot een S-SAXS set-up die scheiding van de bereiding van een monodispersed op basis van mogelijke aggregatie/afbraak, we nu routinematig vergemakkelijkt het verzamelen van gegevens op synchrotron faciliteiten. Een recent gepubliceerd artikel over een DNA G-quadruplex11 is een voorbeeld van een S-SAXS strategie voor de verzameling van de gegevens. In dit geval de SAXS gegevens werden verzameld in het bereik van 0,08 ≤ q ≤ 0.26 Å gedurende 3 uur voor nidogen-1 (2.0, 2.5, 3.0, 3.5 en 4.0 mg/mL); de laminin γ-1 (1.5, 2.0 en 2.5 mg/mL) en hun complex (0,8, 1.0, 1,25 en 1,5 mg/mL). Gegevens voor buffer en voorbeelden met behulp van processing software specifiek voor het systeem te verminderen. Aftrekken van de bijdrage van de buffer van eiwit-gegevens met behulp van een programma zoals PRIMUS/qt12 (figuur 2A). 2. de gegevensanalyse Opmerking: Momenteel zijn er een paar softwarepakketten die handig voor de analyse van de gegevens van de SAXS zijn: ScÅtter43 (download beschikbaar op www.bioisis.net), bioXtas RAW44en de ATSAS suite13. Deze sectie bevat een overzicht van algemene stappen moeten worden genomen bij het analyseren van ruwe SAXS gegevens met behulp van de ATSAS program suite en specifieke stappen zijn ontleend aan de ATSAS 2.8.1 downloaden. Andere programma’s kunnen worden gebruikt en worden even verderop besproken. Buffer aftrekkenOpmerking: Deze stappen zijn relevant voor statische SAXS monsters alleen. De “OPEN” menu optie in PRIMUS/qt en selecteer de gegevensbestanden van belang. Wees ervan bewust dat gegevensbestanden in ASCII-indeling moeten, waarin de eerste kolom de s-vector as is en de tweede kolom de intensiteit is. Herhaal deze stap voor gegevens die worden verzameld voor de buffer zelf door het invoegen van deze gegevens in hetzelfde menu. Selecteer “SUBTRACT” in het venster van de gegevensverwerking, die zal genereren een afgetrokken verstrooiing curve vertegenwoordigt alleen verstrooiing van de macromolecule van belang. Herhaal deze stap voor elke concentratie. Guinier analyse Als u wilt Guinier analyses uit te voeren, door een buffer afgetrokken scatter curve in PRIMUS/qt zoals eerder is beschreven in stap 2.1.1 te laden. Klik op “Radius van Gyration” die zal gaan bij het openen van de Primus Guinier Wizard; een plot van ln(I) vs q2 wordt getoond. Een voorlopige Rg gebruik de functie van “AUTORG”, die is een externe module ingebouwd van PRIMUS/qt. zoeken de “Autorg”-knop en klikt u erop. Invoer van meerdere bestanden tegelijk door te wijzen ze allemaal en deze invoegen in het menu aan de rechterkant, zeer vergelijkbaar met 2.1.1. Gebruik de Guinier plot gemaakt eerder te beoordelen van de kwaliteit van de gegevens; de groene lijn onder de Guinier plot toont de storingswaarden plot vertegenwoordigen een lineariteit van de pasvorm. Wees ervan bewust dat niet-lineariteit in de analyse van de Guinier zou een teken zijn van monster aggregatie en verdere analyse niet in dit geval moet worden uitgevoerd.Opmerking: Een lineaire Guinier pasvorm geeft een Rg met een kleine fout (< 5%) en stelt voor een steekproef van hoge kwaliteit. Kratky analyse Laden van de gegevens die moeten worden gevisualiseerd op een vergelijkbare manier, zoals hierboven beschreven. Klik op “Het selecteren” naast de naam van de data-bestand. Dit zal de gegevens in een afzonderlijk venster uitzetten. Klik op de knop van de “PLOT” gevolgd door “Kartky Plot” selectie in het dropdownmenu. Dit zal de gegevens uitzetten als “q2 x L(q) vs q”. Wees ervan bewust dat bolvormige eiwitten een Gaussiaanse piek, geven terwijl ongevouwen eiwitten zal weer een plateau in plaats van een piek en lijken op een hyperbolische perceel17. Gegevens samenvoegen Buffer van de belasting afgetrokken gegevens voor elke concentratie in PRIMUS/qt nogmaals, zoals in stap 2.1.1. Als u wilt de gegevens samenvoegen, klikt u op de knop “Samenvoegen” in de verwerking venster. Inspecteer elke curve en de I schaal nummer, die met de verdunningen van het oorspronkelijke monster gemaakt correleert.Opmerking: Monsters op hogere concentratie weergeven minder ruis in de regio van de staart van de curven. P(r) distributie Wilt genereren de P(r) plot, laadt u de curven van de samengevoegde gegevens in PRIMUS/qt zoals hiervoor is beschreven. Klik op de knop ‘Afstand Distribution’ te openen een nieuw venster presentatie van de samengevoegde gegevens van intensiteit van verstrooide licht vs. q en paar-afstand distributie functie perceel aan de rechterkant.Opmerking: De informatie op de rechterkant presenteert de algehele kwaliteit van de paar-afstand distributie functie berekeningen. Het gegevensbereik van de samengevoegde gegevens om te voorkomen dat ieder significant geluid aan het eind van de staart van de ruwe gegevens aanpassen. Weglaten van gegevenspunten vlakbij de halte van de bundel in de laag-q-regio. Om te bepalen de Dmax, start met een bereik van 5 keer ~ Rg verkregen uit de analyse van de Guinier. Geleidelijk aan deze waarde te verlagen totdat de P(r) plot niet abrupt tot nul op de y-as dalen doet en niet een lange staart hoeft voor vrijwel nul te reduceren. Controleer of de experimentele Rg/ik0 (afgeleid van aanpassing van de Guinier) en P(r) Rg/ik0getallen zijn vergelijkbaar.Opmerking: In sommige gevallen verdere manipulatie op het bereik van de gegevens, gegevenspunten en ALPHA (een regularisatie parameter die het programma de verhouding vertelt van hoeveel aandacht wordt besteed aan de gladheid van de verdeling in vergelijking met de montage van de experimentele gegevens) is ook vereiste21 te verkrijgen van een goede kwaliteit P(r) perceel. 3. eenb initio kraal modelleren en gemiddeld Zodra de gegevens verzameld in meerdere concentraties worden samengevoegd, of de gegevens die zijn verzameld met behulp van S-SAXS wordt geminimaliseerd, en de Kratky plot, P(r) perceel en Guinier analyse zijn geverifieerd, berekenen lage structuren van macromoleculen en hun complexen. Deze pijpleiding kan worden gebruikt voor het bestuderen van de structuren van de oplossing en interacties van nucleic zuren, proteïnen en nucleïnezuren-eiwit of eiwit-eiwitinteractie complexen10,11,21,22,23 ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 3433, ,. Een van de meest populaire programma’s is DAMMIN, ontwikkeld door Svergun35 en een deel van de ATSAS pakket13, waarin gesimuleerde onthardende protocollen met voorlopige invoergegevens op R,g en Dmax werkzaam . De ab initio modellering benaderingen en beginselen worden beschreven in detail elders18,,36.

Representative Results

De hierboven beschreven aanpak voor de analyse van gegevens werd gebruikt voor het berekenen van de R,g en Dmax voor nidogen-1, laminin γ-1 en hun complex met de P(r) functie. Wij verkregen Rg -waarden van 7.20 (±0.10) nm, 8.10 (±0.20) nm en 10.9 (±0.4) nm voor de nidogen-1, laminin γ-1 en hun complex respectievelijk (figuur 2A-B). Daarnaast Dmax waarden van 24 nm, 26 nm en 35 nm voor de nidogen-1, laminin γ-1 en hun complex respectievelijk (Figuur 2)10 werden verkregen. Het DAMMIF-programma werd gebruikt om te verkrijgen met een lage resolutie structuren van nidogen-1 en laminin γ-1, die suggereerde dat beide eiwitten een uitgebreide vorm in oplossing nemen. De X – en NSD waarden voor nidogen-1 (~ 1 en 0.8) en laminin γ-1 (~0.9 en 0,8 respectievelijk) waren ook in het toegestane bereik. De uitlijning van high-resolution structuren, twee domeinen voor nidogen-1 en twee van laminin γ-1, op hun lage structuren verkregen met behulp van SAXS toegestaan identificatie van hun regio’s N – en C-terminaal10. Nidogen-1 werd geïdentificeerd als een interactie partner van laminin γ-139,40 , en de interactie-site werd in kaart gebracht met behulp van Röntgendiffractie de C-terminal domeinen41. Hoge resolutie structuren betrokken echter alleen interagerende domeinen en niet de volledige nidogen-1 of de gehele laminin γ-1 arm. Dus we gezuiverd een complex met nidogen-1 (volledige lengte) en de laminin γ-1 arm te identificeren alsmede de interactie regio’s over de studie van de relatieve stand van de N-terminale domeinen van beide eiwitten. De SAXS gegevens voor het complex leverde een Rg 10.9 (±0.4) nm en een D-max van 35 nm. We gebruikt MONSA om te verkrijgen van de lage resolutie structuur van het gehele complex, die suggereerde dat inderdaad, alleen de C-terminal regio van beide eiwitten nemen in het bemiddelen van interacties, terwijl de rest van de domeinen zijn ver uit elkaar ( Figuur 3, Video 1). Figuur 1. Schema van SAXS set-up. Een monodispersed preparaat van biomoleculen of hun complexen is bereid, gevolgd door blootstelling met hoge energie x-stralen. Afhankelijk van de bron (bijvoorbeeld, in-house vs. synchrotron), kan de energie van röntgenstralen en de steekproef bron afstand variëren. De x-stralen verstrooiing patroon (dat hangt af van de grootte en vorm van biomoleculen) is opgenomen en radiaal gemiddeld voor een 1-dimensionale perceel (1D) dat informatie over de intensiteit van het verstrooide licht met betrekking tot de hoek van de verstrooiing bevat. Als buffer moleculen ook licht verstrooien, worden de bijdragen van deze moleculen afgetrokken om te verkrijgen van een patroon van de verstrooiing van de biomoleculen van belang. Op de synchrotron, vóór het SAXS gegevens verzamelen, een extra zuivering met behulp van in-lijngrootte uitsluiting/hoogwaardige chromatografie gebeurt meestal ook (bovenaan weergeven). Deze stap is cruciaal voor het verwijderen van een geaggregeerde en/of aangetaste product alsook over het verwijderen van een niet-afhankelijke biomoleculen van het complex. De 1D verstrooiing plot wordt geconverteerd naar de elektronenpaar-afstand distributie plot (P(r) perceel), waarmee de straal van traagheidsstralen en maximale deeltje dimensie van biomoleculen. Dit perceel wordt gebruikt als het invoerbestand voor de ab initio modelleren pakketten (dat wil zeggen, DAMMIN/DAMMIF) te verkrijgen met een lage resolutie structuren van biomoleculen, of andere pakketten (dat wil zeggen, SASREF/koraal) als de hoge-resolutie structuur van delen van de biomoleculen of individuele biomoleculen van het complex is bekend.  Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2. (A) een plot van een intensiteit van verstrooide licht vs. verstrooiing hoek (q = 4πsinθ/λ, nm-1) de kwaliteit van biomoleculen (lage regio) en vorm (hoge regio) van biomoleculen suggereren. (B) de elektronenpaar-afstand verdeling P(r) bepaald op basis van de verstrooiing gegevens suggereren een langwerpige vorm van biomoleculen onderzochte (laminin γ-1, nidogen-1 en hun complex). (C) Kratky perceel suggereren dat nidogen-1 en laminin γ-1 eiwitten zijn niet uitgevouwen. (D) Guinier plot voor nidogen-1, laminin γ-1 en hun complex, met vermelding van de lineaire regio voor bepaling van de straal van traagheidsstralen met behulp van de gegevens in de hoek van de laag-verstrooiing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3. Met een lage resolutie structuur van het complex van nidogen-1 en laminin γ-1 verkregen door analyse van samengevoegde gegevens sets met behulp van het programma MONSA. Het kleurenschema is hetzelfde als Figuur 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Video 1. De lage resolutie structuur van de nidogen-1 en laminin γ-1 complex. Deze film werd opgesteld op basis van PYMOL te visualiseren van verschillende structurele kenmerken van het complex. De kristalstructuur van de laminin-nidogen-complex (VOB-ID: 1NPE) wordt weergegeven als lint tekenfilms, markeren de interactie sites voor dit complex. Het kleurenschema is hetzelfde als Figuur 2. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Discussion

De kritische stappen van SAXS gegevensanalyse die worden beschreven in de sectie protocol van dit papier opnemen buffer aftrekken, Guinier analyse Kratky analyse, gegevens samenvoegen en P(r) distributie. Het modelleren van ab initio kraal is te uitgebreid om hier in detail worden behandeld en is daarom alleen kort bedekt.

Bij synchrotrons (b.v. DESY in Duitsland, de diamant in het Verenigd Koninkrijk en ESRF in Frankrijk), is het mogelijk om SAXS gegevens voor een zeer kleine fractie te verzamelen (~ paar µL) van elk monster als de breuken zijn worden geëlueerd uit de s-kolom dat is aangesloten in-lijn (zie figuur 1 ). De elastisch verspreide SAXS gegevens is radiaal gemiddeld met behulp van de pakketten geleverd door de fabrikant of door de synchrotron voordat de buffer aftrekken kan plaatsvinden. De resulterende gegevens van de 1D vertegenwoordigt de hoeveelheid verspreid licht (In ik(q)) op de Y-as en verstrooiing hoek (q= 4πsinθ/λ, waar λ de golflengte van incident X is-stralen) en is uiteengezet in Figuur 1. Het programma PRIMUS/qt12 rechtstreeks aftrekken elke achtergrond te wijten aan de buffer wordt gebruikt en wordt beschreven in sectie 1.1. Andere programma’s zoals; ScÅtter43 (download beschikbaar op www.bioisis.net) met een tutorial beschikbaar op https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeA, en bioXtas RAW44 (beschikbaar op https:// bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) kan worden gebruikt als alternatief voor het ATSAS-pakket.

De Guinier-analyse verschaft informatie over monster aggregatie en homogeniteit, evenals het verstrekken van de straal van Gyration (Rg) voor de macromolecule van belang op basis van de gegevens van de SAXS uit de lage s regio14. Een perceel is gebouwd met PRIMUS/qt voor SAXS gegevens verkregen uit elke concentratie, gevolgd door curve passend met het maximale bereik van maximaal 1.30 voor q x Rg. De bereiding van de monsters van een monodispersed dienen een lineaire Guinier plot in deze regio (figuur 2D), overwegende dat de resultaten van de samenvoeging in een niet-lineaire Guinier plot15,16. Als de Guinier-analyse lineair is, kan de mate van “unfoldedness” van een macromolecuul van belang worden waargenomen met de Kratky plot, hetgeen nuttig is wanneer besluiten of wilt uitvoeren van vastlichaam modeling of construeren ensembles van lage-resolutie modellen. Een bolvormige eiwit verschijnt in een Kratky plot hebben een klokvormige curve, dat uitgebreid moleculen of ongevouwen peptiden plateau of zelfs verhogen in het grotere bereik van de q en gebrek aan de bell-vorm (figuur 2C) verschijnt.

Verkrijgen van de Rg van Guinier analyse alleen rekening gehouden met gegevenspunten uit de lage q -regio van de 1 D-scatterplot (figuur 2D), het is echter mogelijk om te gebruiken bijna de gehele dataset om uit te voeren van een indirecte Fourier-transformatie de informatie van de wederzijdse-ruimte van ln (I (q)) vs. (q) omzetten in een reële ruimte afstand verdelingsfunctie (P(r)) dat informatie over Dmax en Rg bevat (Figuur 2B) De vorm van het perceel P(r) vertegenwoordigt de bruto oplossing conformatie van de macromolecule van belang18,19. de conversie van gegevens voor een wederzijdse-ruimte naar reële-ruimte gegevens is een belangrijke stap, maar een gedetailleerde beschrijving is niet binnen de werkingssfeer van dit document. Dus, verwijzen naar een artikel door Svergun20 te begrijpen van elke parameter.

Zodra de buffer afgetrokken gegevens in concentraties die afzonderlijk worden verwerkt door Guinier analyse met een consistente waarde voor R,g, gevolgd door het onderzoeken van hun vouwen patroon met behulp van Kratky analyse, deze gegevens kunnen worden samengevoegd. De samengevoegde gegevens worden voor nidogen-1, laminin γ-1 en hun complex werden verwerkt zoals hierboven beschreven en de resulterende P(r) percelen gepresenteerd in figuur 2B. Idealiter moet men ook de paar-distributie afstandsfunctie P(r) voor elke concentratie om te bepalen of SAXS verzamelde gegevens voor elke concentratie vergelijkbare R,g en Dmax waarden biedt berekenen. Als de R,g en Dmax soortgelijke over een brede waaier van concentraties blijven, dan is de gebruiker moet overgaan. Opgemerkt moet worden dat gegevens afhankelijk van het signaal, voorafgaand aan het samenvoegen van gegevens kan worden afgekapt. Dit is vaak het geval als de concentraties en/of moleculair gewicht van de macromoleculen onderzochte slinkt.

Lage resolutie vorm analyse met behulp van DAMMIN kan worden uitgevoerd in verschillende modi (bijvoorbeeld snel, langzaam, deskundige modi, enz.). De Fast-modus is een ideale eerste stap om te beoordelen of de P(r) plot goede kwaliteit modellen biedt. Normaal gesproken moeten ten minste 10 modellen voor ieder waarnemingspunt P(r) om te controleren als reproduceerbare resultaten, in termen van de structuur met lage resolutie worden verkregen, met een lage goedheid van fit parameter met de naam χ (een waarde van 0,5-1,0 wordt beschouwd als goede gebaseerd op onze uitgebreide werk worden verkregen ), een waarde die een overeenkomst tussen experimenteel verzamelde SAXS gegevens en model-afgeleide gegevens beschrijft. Voor publicatie doel, we meestal langzaam of Expert modus gebruiken en berekenen van ten minste 15 modellen. Naast DAMMIN, een snellere versie van het, DAMMIF37, evenals GASBOR38 zijn ook alternatieven. Anderzijds studeren eiwit-eiwit of eiwit-nucleic zuur complexen, is het mogelijk om te gebruiken het MONSA programma35, dat vergemakkelijkt de gelijktijdige montage van de afzonderlijke SAXS gegevens van zowel macromoleculen evenals hun complex. Voor meer informatie over high-resolution modelberekeningen evenals voor RNA-eiwit interactie studies, verwijzen naar een recent artikel door Patel et al.3.

SAXS is theoretisch simpel maar ongetwijfeld een uiterst complementair methode om andere structurele biologie hulpmiddelen en resultaten in lage resolutie structurele gegevens die kan worden gebruikt op eigen of in combinatie met hoge resolutie technieken om het verhelderen van informatie over macromoleculaire structuur en dynamiek. Zolang de voorbereiding van een monodispersed van macromoleculen en hun complexen kan worden verkregen, kan SAXS worden gebruikt om te studeren in-oplossing structuur en interacties van elk type van biologische macromolecule. In het geval van het complex hier besproken, het is opmerkelijk dat minder dan 10% van de totale toegankelijke oppervlakte van stikstof-1 en laminin γ-1 is begraven in dit complex, terwijl de rest van de domeinen van beide eiwitten zijn vrij toegankelijk voor de interactie met andere eiwitten in de extracellulaire matrix te handhaven van de structurele rigiditeit (Figuur 3). Verkrijgen van dergelijke gegevens voor een complex met ~ 240kDa zou zeer uitdagend met behulp van andere technieken van de structurele biologie zoals röntgendiffractie, NMR en Cryo-EM microscopie.

Blootleggen eiwitstructuur via röntgendiffractie of NMR is een inherent tijdrovend proces. Dit knelpunt in structuurbepaling is een gebied waar SAXS haar kracht als een structurele techniek toont; data-acquisitie voor een enkele SAXS experiment kan minder dan een uur en met de hulp van gestroomlijnde analysesoftware, analyse kan worden gedaan, snel en efficiënt. SAXS heeft de potentie om sterk verhogen doorvoer van structurele studies als een zelfstandige techniek omdat het een lage model van de macromoleculaire structuur biedt voordat high-resolution gegevens beschikbaar is. Een belemmering voor andere structurele technieken is de eis voor een zeer pure, geconcentreerde steekproef voor data-acquisitie, die een hoog niveau van eiwit expressie en stabiliteit gedurende een lange periode van tijd vereist. Terwijl SAXS monsters ook moeten worden puur en geconcentreerd, de steekproef-volumes zijn ongeveer 100 µL maken SAXS een relatief goedkope analysemethode in vergelijking met andere structurele technieken. Bovendien is SAXS grootte uitsluiting chromatografie gekoppeld steeds gewoner waarmee een stap extra kwaliteitscontrole. Onlangs is er een sterke vooruitgang in de combinatie van NMR en SAXS gegevens met behulp van de methode van de optimalisering van Ensemble (EOM)45,46 ophelderen van flexibele systemen. In een recent document van de Mertens en Svergun47beschrijven de auteurs meerdere recente voorbeelden van EOM SAXS in combinatie met NMR, samen met vele andere voorbeelden van SAXS gegevens worden gebruikt in combinatie met NMR. Zijn voortdurend vooruitgang geboekt op het gebied van SAXS en nieuwe technieken worden ontwikkeld voor SAXS kan worden gebruikt in combinatie met, niet gewoon gratis aan, andere structurele technieken. Wij zijn bijgevolg van mening dat de vraag naar SAXS slechts na verloop van tijd, vooral in combinatie met NMR te karakteriseren van dynamische systemen waar functies worden gedefinieerd door flexibiliteit zal toenemen.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit project werd ondersteund door NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta innovatie programma (RCP-12-002 C) en Alberta Prion Research Institute / Alberta innoveert Bio oplossingen (201600018) subsidies toegekend aan M.O. TRP is een Canada Research Chair in RNA & Eiwit biofysica (201704) en erkent NSERC ontdekking grant (RGPIN-2017-04003). TM wordt gefinancierd door de toekenning van de ontdekking van de NSERC aan TRP.

Materials

HEK 293 EBNA Cell Line In-Lab availability – Cell line used to overexpress protein(s)
Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin GE Healthcare 17524801 Affinity protein purification resin
Superdex 200 Increase 10/300 GE Healthcare 28990944 SEC Column
ÄKTA Pure FPLC GE Healthcare – FPLC System
Nanodrop Nanodrop – Spectrophotometer
Basic Reagents (NaCl, Tris-HCl etc.)
S-MAX3000 Rigaku – SAXS Pinhole Camera System
Zetasizer Nano-S Malvern Instruments Ltd – Dynamic Light Scattering instrument
0.1µm Filter Millipore JVWP04700 Used to Concentrate Sample Prior to DLS
Thrombin cleavage kit abcam ab207000 Thrombin cleavage to remove His tag
Strep-Tactin Sepharose Column IBA 2-1201-010 Strep-Tag Affinity Purification
D-desthiobiotin Sigma-Aldrich 533-48-2 Elution of Strep Tag Protein
Software
SAXGUI Rigaku – Data Collection for SAXS and data reduction
ATSAS Suit Franke et al., 2017 – SAXS Data Analysis Software program suite
PRIMUS Konarev et al., 2003 – Buffer Subtraction
GNOM Svergun, 1992 – Rg, Dmax and p(r) Calculation
DAMMIF Franke and Svergun, 2009 – Ab initio model calculation
DAMAVER Volkov and Svergun, 2003 – Averaged Solution Conformation calculations
MONSA Svergun, 1999 – Simultaneous model fitting for the complex
GASBOR Svergun et al., 2001 – Alternative Ab initio model calculations
DTS Software V6.20 Malvern Instruments Ltd – DLS supplied instrument software
PyMOL Schrodinger, LLC. – The PyMOL Molecular Graphics System V2.0
The Protein Data Bank Berman et al., 2000 – PDB ID: 1NPE
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Advances in structure analysis using small-angle scattering in solution. Current Opinion in Structural Biology. 12 (5), 654-660 (2002).
  2. Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., McKenna, S. A., Bujnicki, J. M. Structural studies of RNA-protein complexes: A hybrid approach involving hydrodynamics, scattering, and computational methods. Methods. 118, 146-162 (2017).
  3. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  4. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Fink, A. L. Why are “natively unfolded” proteins unstructured under physiologic conditions?. Proteins. 41 (3), 415-427 (2000).
  5. Uversky, V. N., Gillespie, J. R., Millett, I. S., Khodyakova, A. V., Vasiliev, A. M., Chernovskaya, T. V., Abramov, V. M. Natively Unfolded Human Prothymosin α Adopts Partially Folded Collapsed Conformation at Acidic pH. Biochemie. 38 (45), 15009-15016 (1999).
  6. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  7. Schneidman-Duhovny, D., Hammel, M., Tainer, J. A., Sali, A. FoXS, FoXSDock and MultiFoXS: Single-state and multi-state structural modeling of proteins and their complexes based on SAXS profiles. Nucleic Acids Research. 44, 424-429 (2016).
  8. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – a Program to Evaluate X-ray Solution Scattering of Biological Macromolecules from Atomic Coordinates. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 768-773 (1995).
  9. Pérez, J., Vachette, P. A Successful Combination: Coupling SE-HPLC with SAXS. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1009, 183-199 (2017).
  10. Patel, T. R., Bernards, C., Meier, M., McEleney, K., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Structural elucidation of full-length nidogen and the laminin-nidogen complex in solution. Matrix Biology. 33, 60-67 (2014).
  11. Meier, M., Moya-Torres, A., Krahn, N. J., McDougall, M. D., Orriss, G. L., McRae, E. K. S. Structure and hydrodynamics of a DNA G-quadruplex with a cytosine bulge. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Franke, D., Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Panjkovich, A., Tuukkanen, A., Mertens, H. D. T. ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50, 1212-1225 (2017).
  13. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  14. Tuukkanen, A. T., Svergun, D. I. Weak protein-ligand interactions studied by small-angle X-ray scattering. The FEBS Journal. 281 (8), 1974-1987 (2014).
  15. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  16. Koch, M. H., Vachette, P., Svergun, D. I. Small-angle scattering: a view on the properties, structures and structural changes of biological macromolecules in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 36 (2), 147-227 (2003).
  17. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  18. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Applications of small-angle X-ray scattering to biomacromolecular solutions. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (2), 429-437 (2013).
  19. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  20. Patel, T. R., Morris, G. A., Zwolanek, D., Keene, D. R., Li, J., Harding, S. E. Nano-structure of the laminin γ-1 short arm reveals an extended and curved multidomain assembly. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 29 (7), 565-572 (2010).
  21. Patel, T. R., Reuten, R., Xiong, S., Meier, M., Winzor, D. J., Koch, M., Stetefeld, J. Determination of a molecular shape for netrin-4 from hydrodynamic and small angle X-ray scattering measurements. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 31 (2), 135-140 (2012).
  22. Dzananovic, E., Patel, T. R., Deo, S., McEleney, K., Stetefeld, J., McKenna, S. A. Recognition of viral RNA stem-loops by the tandem double-stranded RNA binding domains of PKR. RNA. 19 (3), 333-344 (2013).
  23. Meier, M., Patel, T. R., Booy, E. P., Marushchak, O., Okun, N., Deo, S. Binding of G-quadruplexes to the N-terminal recognition domain of the RNA helicase associated with AU-rich element (RHAU). The Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35014-35027 (2013).
  24. Dzananovic, E., Patel, T. R., Chojnowski, G., Boniecki, M. J., Deo, S., McEleney, K. Solution conformation of adenovirus virus associated RNA-I and its interaction with PKR. Journal of Structural Biology. 185 (1), 48-57 (2014).
  25. Bacik, J. -. P., Tavassoli, M., Patel, T. R., McKenna, S. A., Vocadlo, D. J., Khajehpour, M., Mark, B. L. Conformational itinerary of Pseudomonas aeruginosa 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid kinase during its catalytic cycle. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4504-4514 (2014).
  26. Deo, S., Patel, T. R., Dzananovic, E., Booy, E. P., Zeid, K., McEleney, K. Activation of 2’ 5’-oligoadenylate synthetase by stem loops at the 5’-end of the West Nile virus genome. PloS One. 9 (3), e92545 (2014).
  27. Vadlamani, G., Thomas, M. D., Patel, T. R., Donald, L. J., Reeve, T. M., Stetefeld, J., Mark, B. L. The β-lactamase gene regulator AmpR is a tetramer that recognizes and binds the D-Ala-D-Ala motif of its repressor UDP-N-acetylmuramic acid (MurNAc)-pentapeptide. The Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2630-2643 (2015).
  28. Deo, S., Patel, T. R., Chojnowski, G., Koul, A., Dzananovic, E., McEleney, K., McKenna, S. A. Characterization of the termini of the West Nile virus genome and their interactions with the small isoform of the 2’ 5’-oligoadenylate synthetase family. Journal of Structural Biology. 190 (2), 236-249 (2015).
  29. Ariyo, E. O., Booy, E. P., Patel, T. R., Dzananovic, E., McRae, E. K., Meier, M., McKenna, S. A. Biophysical Characterization of G-Quadruplex Recognition in the PITX1 mRNA by the Specificity Domain of the Helicase RHAU. PloS One. 10 (12), (2015).
  30. Hyde, E. I., Callow, P., Rajasekar, K. V., Timmins, P., Patel, T. R., Siligardi, G., Scott, D. J. Intrinsic disorder in the partitioning protein KorB persists after co-operative complex formation with operator DNA and KorA. The Biochemical Journal. 474 (18), 3121-3135 (2017).
  31. Dzananovic, E., Astha, n. u. l. l., Chojnowski, G., Deo, S., Booy, E. P., Padilla-Meier, P., McKenna, S. A. Impact of the structural integrity of the three-way junction of adenovirus VAI RNA on PKR inhibition. PloS One. 12 (10), (2017).
  32. Krahn, N., Meier, M., To, V., Booy, E. P., McEleney, K., O’Neil, J. D., Stetefeld, J. Nanoscale Assembly of High-Mobility Group AT-Hook 2 Protein with DNA Replication Fork. Biophysical Journal. 113 (12), 2609-2620 (2017).
  33. Patel, T. R., Besong, T. M. D., Meier, M., McEleney, K., Harding, S. E., Winzor, D. J., Stetefeld, J. Interaction studies of a protein and carbohydrate system using an integrated approach: a case study of the miniagrin-heparin system. European Biophysics Journal: EBJ. , (2018).
  34. Svergun, D. I. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  35. Blanchet, C. E., Svergun, D. I. Small-Angle X-Ray Scattering on Biological Macromolecules and Nanocomposites in Solution. Annual Review of Physical Chemistry. 64 (1), 37-54 (2013).
  36. Volkov, V. V., Svergun, D. I. Uniqueness of ab initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 36, 860-864 (2003).
  37. Kozin, M. B., Svergun, D. I. Automated matching of high- and low-resolution structural models. Journal of Applied Crystallography. 34 (1), 33-41 (2001).
  38. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (Pt 2), 342-346 (2009).
  39. Svergun, D. I., Petoukhov, M. V., Koch, M. H. J. Determination of Domain Structure of Proteins from X-Ray Solution Scattering. Biophysical Journal. 80 (6), 2946-2953 (2001).
  40. Baumgartner, R., Czisch, M., Mayer, U., Pöschl, E., Huber, R., Timpl, R., Holak, T. A. Structure of the nidogen binding LE module of the laminin gamma1 chain in solution. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 658-668 (1996).
  41. Stetefeld, J., Mayer, U., Timpl, R., Huber, R. Crystal structure of three consecutive laminin-type epidermal growth factor-like (LE) modules of laminin gamma1 chain harboring the nidogen binding site. Journal of Molecular Biology. 257 (3), 644-657 (1996).
  42. Takagi, J., Yang, Y., Liu, J. -. H., Wang, J. -. H., Springer, T. A. Complex between nidogen and laminin fragments reveals a paradigmatic beta-propeller interface. Nature. 424 (6951), 969-974 (2003).
  43. Förster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J. Appl. Cryst. 43, 639-646 (2010).
  44. Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis. J. Appl. Cryst. 50, 1545-1553 (2017).
  45. Bernadó, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. (17), 5656-5664 (2007).
  46. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  47. Mertens, H. D. T., Svergun, D. I. Combining NMR and small angle X-ray scattering for the study of biomolecular structure and dynamics. Arch Biochem Biophys. 628, 33-41 (2017).

Tags

Small Angle X-ray ScatteringSAXSStructural StudiesMacromoleculesBiomoleculesBiophysical MethodsStructural BiologyStructure-based TherapeuticsNanoparticlesDrug DeliveryData AnalysisATSAS Software SuiteGuinier AnalysisRadius Of Gyration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering. J. Vis. Exp. (141), e58538, doi:10.3791/58538 (2018).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image