タバココナジラミの迅速同定のループ介在増幅法 (LAMP) アッセイ

1. 準備 アルカリの DNA 抽出液の因数を準備しています。 600 μ M 水酸化カリウム (KOH) を添加した分子レベルの水を使用してアルカリの DNA 抽出液のストックを生産し、2 μ M クレゾールレッド。注意: 島は水に溶解した強力な拠点です。流出、皮膚と眼との接触は避けてください。 0.5 mL の遠心管に (1.1.1 の手順で準備) アルカリの DNA 抽出液の 30 μ L を分注、4 ° C で因数を格納注: は、1 年以内の検体の DNA 抽出液を使用します。 B. タバココナジラミ肯定的な増幅制御 (PAC) を準備しています。 ランプのターゲット DNA 断片の PCR 産物を生成します。注: 一般的な PCR の原理と実践への導入は、ローレンツ23によって与えられます。 合成または C1-J-2195 プライマーを取得 (5′-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3′) と TL2-N-3014 (5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3 ‘) ミトコンドリア COI 遺伝子24,25のフラグメントを増幅します。 PCR の反作用の表 1で説明するようを設定します。DNA の抽出物を使用 (手順 2.1 参照) DNA のテンプレートとして参照B. タバココナジラミ標本。注: 必要に応じて、製造元の指示に従って商業キットを使用して PAC のためB. タバココナジラミDNA を抽出することが可能です。 次の条件を使用してサーマルサイクラーをプログラム: 95 ° C で 15 分40 45 サイクル 95 ° c、15 s 45 ° c、60 以上のランプ s から 60 ° C、72 ° C で 2 分 s72 ° C で 7 分4 ° C で保持します。 製造元のプロトコルに従って商業 PCR クリーン アップ キットを使用して PCR 増幅産物をきれいにし分子グレード水に最終製品を溶出します。 DNA 間をインターカ レート染付商業キットを使用し、製造元の指示に従って PCR 増幅産物の DNA 濃度の測定し、分子グレード 1 の濃度に水で希釈して ng/μ L 希薄化後の PCR の拡大のストア。-20 ° C にて PAC 原液として製品注: は、1 年以内の PAC 原液を使用します。 0.6 μ m 島 (1.2.1.5 の手順で準備) PAC 在庫ソリューションを補完し、分子グレード 5 x 10-3 ng の濃度に水で希釈/μ L 4 ° c で保管。メモ: すぐに使えるB. タバココナジラミランプの準備のため 5 時間以内 PAC を使用してキットを次の手順で説明します。 準備準備ができて-使用B. タバココナジラミランプ キット (20 単位のプロトコル) 2 4 管ランプ短冊 8 チューブ ランプ ストリップを切るにはさみを使用。 図 1に示すスキームに従って 4 管ランプ ストリップのチューブにラベルを付けます。 B. タバココナジラミランプ反応マスター ミックス (80 の反作用のためのプロトコル) を準備します。 使用する準備ができて GspSSD 等温マスター ミックス (GspSSD ポリメラーゼ、ピロホスファターゼ、硫酸マグネシウム、弱まり、二重鎖結合 DNA 結合色素を含む) の 1195.1 μ l 添加とB. のタバココナジラミランプ プライマー ミックス 2 mL の 717.4 μ L遠心チューブ。簡単に渦とパルス遠心分離します。 4 管ランプ ストリップ (の準備ステップ 1.3.1) とパルスの遠心分離機の各チューブにB. タバココナジラミランプ反応マスター ミックス (手順を 1.3.3.1 詳細ページで準備) の 22.5 μ L を調剤します。 B. タバココナジラミランプ PAC (1.2 の手順で準備) すぐに渦とパルスが遠心分離機します。その後、各 4 管ランプ ストリップ (図 1) の「PAC」が付いた管に 2.5 μ L を追加します。 閉じる蓋とストアすぐに使えるB. タバココナジラミランプ キット-20 ° C の単位注: は、1 年以内にそれらを使用します。 2. 敷地内ランプ解析 DNA の抽出 生殖不能のつまようじを使用すると、30 μ L の DNA 抽出液 (1.1.2 の手順で準備) を含む 0.5 mL 遠心チューブに昆虫の標本を転送します。注: 昆虫が抽出液に没頭していることを確認します。 Thermomixer (300 の rpm) の 95 ° C で 5 分間のサンプルをインキュベートします。簡単に渦とパルス遠心分離します。 B. タバココナジラミランプ アッセイ 雪解けすぐに使えるB. タバココナジラミランプ キット 1.3 のステップで準備します。渦迅速とパルスの遠心分離機。注: 各キットにはいずれかの可能な 2 つの異なる標本をテストするのには、重複の 1 つの検体の DNA 抽出を分析したり。 「S1」と「S2」すぐに使えるB. タバココナジラミランプ キット (図 1) ラベルの付いたチューブにサンプル DNA 抽出物 (ステップ 2.1 の準備) の 2.5 μ l を追加します。 チューブの負性増幅制御 (図 1) の「NAC」ラベルに純粋なアルカリ DNA を抽出溶液 (1.1 節準備) の 2.5 μ l を追加します。 渦すぐに使えるB. タバココナジラミランプは、迅速キットし、遠心分離機をパルスします。 挿入に使えるB. タバココナジラミランプ (リアルタイム蛍光測定) とランプの分析装置やリアルタイム PCR プラットフォームにキットし、60 分の 65 ° C での等温 DNA 増幅特性の解析を行います。 冷却段階で 98 ° C まで加熱することによって DNA 増幅製品の溶融温度を測定 (0.05 の勾配 ° C/s) リアルタイムで蛍光を測定しながら、75 ° c。 ランプ アッセイ読み出し ランプ読み出しを次のように手動で検証します。 としてランプの結果を考慮して、サンプルと PAC の DNA 増幅を測定した場合、NAC の測定した DNA 増幅がないと増幅製品のアニーリングの温度の間にあった 80.0 85.5 ° C 正 (図 2)。 (すなわち、チューブ ラベル付きの S1 と S2) サンプルの DNA 増幅がない場合、PAC と NAC としてランプの結果を考慮し負 (図 2)。 サンプルの DNA 増幅を測定したが、対応する増幅製品のアニーリングの温度範囲 80.0 \u2012 85.5 ° C、外にいたおよび/または DNA 増幅を与えた PAC や NAC を与えた DNA 増幅、検討結果をランプとして(図 2) が無効です。 必要に応じて、ランプの検証アプリケーション (補足ファイル 1) を使用してランプの読み出しを検証します。 対象種を定義し、テストされたサンプル数を定義します。”Generate Report”ボタンをクリックします。 転送、読み出し (はい/いいえ、焼鈍温度増幅産物、結果の DNA 増幅 PAC と NAC の) 敷地内のランプ分析装置やリアルタイム PCR プラットフォーム検証アプリケーションの対応する入力フィールドから。検証の結果がすぐにデータを入力した後表示されます。