구두 항생제 치료 후 Murine 장 Microbiota의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응-기반 분석

여기에 설명 된 실험 6-8 주 오래 된 야생-타입 (C57BL6/J) 마우스는 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 시설에서 유지 관리를 사용 하 여 수행 했다. 모든 동물 실험은 왕의 대학 런던 및 프랜시스 크릭 연구소 동물 복지와 윤리적 검토 기관 및 영국 홈 오피스에 의해 승인 되었다. 어떤 동물 절차를 시작 하기 전에 적절 한 권한을 지역 기관/단체를 통해 가져온 확인 하십시오. 1입니다. 항생제의 관리 참고: 항생제 치료에 대 한 두 가지 대체 방법을 제공 됩니다: 구강 (단계 1.1) 및 식 수 (1.2 단계)를 통해 항생제의 관리. 구강 다음과 같은 농도에서 압력가 마로 소독 물에 그들을 용 해 하 여 개별 항생제의 주식을 준비: 100 mg/mL에서 암 피 실린, 100 mg/mL에서 Gentamicin, 100 mg/mL에서 네오 마이 신, 10 mg/mL에 Metronidazole 및 100 mg/mL에서 Vancomycin. 필터는 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 약 수와-20 ° c.에 게 위에 준비 하는 주식을 혼합 하 여 항생제의 칵테일을 준비 합니다. 1 mL의 볼륨에 대 한 암 피 실린 (5 mg/mL 최종)의 50 µ L, Gentamicin (5 mg/mL 최종)의 50 µ L, 네오 마이 신 (5 mg/mL 최종)의 50 µ L, Metronidazole (5 mg/mL 최종)의 500 µ L, Vancomycin (2.5 mg/mL 최종)의 25 µ L과 325 µ L의 물 혼합. 사용 하기 전에 칵테일 신선한 준비. 살 균 1 mL 주사기로 항생제 혼합을 로드 하 고 모든 거품을 제거 하는 동안 적절 한 게이지 gavage 바늘 (20 G 15-20 g 마우스)을 수정. 항생제 혼합의 200 µ L와 gavage 쥐입니다. 마우스 어깨 피부를 단단히 잡고, 머리와 목 식도을 스트레칭. 볼-지붕 입 및 인 두의 뒤쪽을 따라 먹이 바늘의 팁을 직접. 그런 다음, 부드럽게 식도로 통과 하 고 200 μ 솔루션을 주입. 실험의 기간에 대 한 항생제 칵테일 한 번을 매일 관리 합니다. 식 수에 항생제주의:은 신중 하 게 항생제 관리 식 수에서의 첫 2 주 동안 매일에 마우스 체중을 모니터링 합니다. 압력가 마로 소독 물 1 L에 다음을 용 해 하 여 항생제의 칵테일을 준비: 암 피 실린 (1 g/L 최종), 네오 마이 신 (1 g/L 최종)에 Metronidazole (1 g/L 최종), Vancomycin (0.5 g/L 최종) 및 인공의 8 향 낭 (각 0.75 g) 0.5 g 1 g 1 g 1 g 감미료 (60 g/L 최종)입니다. 해산 때까지 흔들어. 4 ° c.에 게참고: 감미료를 항생제의 맛을 숨기고 쥐 탈수를 방지 추가 됩니다. 몇 가지 감미료 브랜드 수 있습니다 작동 하는 동안 필요한 최종 농도 각 특정 브랜드에 대 한 달라질 수 있습니다. 물 병에 항생제 칵테일을 입력 (~ 100 mL/병) 마우스 케이지는 병을 놓습니다.참고: 갈색 병을 사용 하거나 빛에서 항생제를 보호 하기 위해 호 일 병을 커버. 실험 기간 동안 일주일에 두 번 신선한 주식으로 항생제 칵테일을 바꿉니다. 2.의 자, 회장, 내용과 회장 벽에서 배설물 샘플의 수집 무게 및 레이블 2 mL 샘플 컬렉션 압력가 관. 신선한 대변 샘플의 컬렉션에 대 한 각 마우스는 restrainer에 놓고 컬렉션 튜브의 항문에서 직접 분 변 알갱이 수집 합니다.참고: 샘플 또한 깨끗 한 압력가 장에 마우스를 배치 하 고 깨끗 한 소독된 집게와 대변 샘플을 수집 하 여 얻을 수 있습니다. CO2 질 식 자 궁 경관 탈 구 다음으로 쥐를 안락사. 완전히 노출 하는 복 부와 마우스 시체를 복 부 지역 70% 에탄올 스프레이. 소독된 집게와가 위를 사용, 어떤 내부 조직을 손상 하지 않고 복 노출 하 복 부에 가로 절 개를 만들. 복 들어올린 내장 노출 절 개. 집게와가 위 (위장 콜론)에서 내장을 제거 하 고 멸 균 페 트리 접시에 놓습니다. 신중 하 게 사용 하 여 집게 소장 (SI)를 애타게 mesenteric 동맥과 지방. 소장을 확장 하 고 깨끗 한 실험실 지우기에 배치. 통치자, 측정 고 시 (맹에 가까운 부분)의 말 초 회장의 4 cm를 잘라. 잘라내어 버리고 맹 근 위 소장 1 cm. 회장은 장내 박테리아를 수집 하는 데 사용할 것입니다 왼쪽의 3 cm 부분 있을 것입니다. 2 mL 무 균 튜브에 회장 부분 (3 cm)를 개최. 밀어내어 직접 장과 colleting 튜브에서 샘플 장 콘텐츠를 수집 합니다. 이 샘플은 회장 내용에서 박테리아를 있을 것 이다. 버퍼링 차가운 인산 염 (PBS)와 20 mL 주사기를 준비 하 고 플러시 회장 부분 (흐름을 통해 삭제). 깨끗 한 종이 타월에 회장 부분을 놓고가 위 경도 열. 메스와 회장 벽의 내부를 다쳤어요. 깨끗 한 원심 분리기 튜브 위에 PBS의 1 mL를 메스를 세척 하 여 메스에 어떤 박테리아를 수집 합니다. 작은 박테리아는 상쾌한 삭제를 5 분 동안 8000 × g 에서 회전 합니다. 이 샘플은 회장 벽에서 박테리아를 포함 합니다.참고:의 자, 회장 콘텐츠 및 벽에서 배설물 샘플 냉동 고 사용까지-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 무게는 튜브의 자 및 회장 콘텐츠 샘플을 포함 하 고 각 샘플에 배설물로 무게를 (에서 2.1 단계) 빈 관에서 체중을 빼기. 자, 회장 콘텐츠 및 상용 키트를 사용 하 여 회장 벽 샘플에서 세균성 DNA를 추출 합니다. 사용까지-20 ° C에서 DNA 샘플을 저장 합니다. 3입니다. 정량에 의해 장 Microbiota의 정량화 참고:이 절차 포함 표준 (3.1 단계)의 생성 및 표준과 배설물 샘플 (3.2 단계)에 대 한 정량 설정 하는 방법 정량에 대 한 표준의 생성 연쇄 반응 (PCR)를 사용 하 여 게놈 DNA 추출 시 약13 및 표 1에 자세히 설명 하는 PCR 조건 사용 하 여 세균성 문화에서에서 16S rRNA 유전자를 증폭 하는. 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 하 고 상용 DNA 추출 키트를 사용 하 여 DNA 밴드를 정화. 순화 된 DNA 조각 사용 하 여 참조 테이블의 자료, 항생제 내성 마커 및 블루/화이트 식민지 선택에 대 한 β-galactosidase (LacZ) 유전자 융해를 포함 하는 벡터를 사용 하 여 키트는 복제 선 DH10 유능한 변환 대장균 제조업체의 지침에 따라. 암 피 실린에 변환 접시 (100 µ g/mL), X-여자 (20 µ g/mL) Luria Bertani (파운드) 한 천 배지 (10 g/L Tryptone, 효 모 추출 물, 10 g/L NaCl, 15 g/L 한 천 5 g/L). 품 어 오버 나이트 (O/N) 37 ° c. 접시에서 단일 포지티브 (흰색) 식민지를 선택 합니다. 5 mL 파운드 국물 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 된에서 예방 하 고 O/N 37 ° C, 250 rpm에서 떨고에서 품 어. O/N 문화에서 분리 하 고 제조업체의 지침에 따라 상업 miniprep 키트를 사용 하 여 플라스 미드 정화.참고:이 단계에서 플라스 미드 16S rRNA 유전자의 복사본을 하나만 포함 되어 있는지 확인 하 고 자료 쌍 (bp)의 길이 결정 하는 플라스 미드 삽입 순서 중요 하다. 플라스 미드를 한 번만 인하를 제한 효소로 플라스 미드 선형화 상업적으로 사용할 수 있는 키트를 사용 하 여 선형화 플라스 미드 정화. 260에서 흡 광도 측정 하 여 플라스 미드의 농도 결정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여. 다음 수식14를 사용 하 여 샘플의 플라스 미드 복사본 / µ L의 수를 계산.복사본의 수 = (금액 * 6.022 × 1023) / (길이 * 1 × 109 * 650)금액이 3.1.8 (ng / µ L);에 단계에서 얻은 DNA 농도 그리고 길이 혈압에 (삽입)와 플라스 미드의 총 길이. 사본의 수 복사본 / µ L로 얻을 것 이다.참고: 플라스 미드 사본의 수의 쉬운 계산 수 있도록 위의 수식에 따라 온라인 도구가 있습니다. 약 수 그리고 저장소 사용까지-20 ° C에서 필요에 따라 표준. 정량 표준 및 배설물 샘플에 대 한 설정 녹여 정량 (에서 단계 3.1.10) 표준, (에서 단계 2.15) 배설물 샘플 DNA 및 얼음에 (에서 상용 키트) 정량 시 약.참고:이 예제에서 사용 하는 정량 Pcr 시 약 포함 SYBR 녹색 정량 Pcr 반응 혼합 및 역방향 뇌관 (표 2). 10에서 범위에서 살 균 DNA 무료 물에서 표준 희석7 102 복사본 / µ L (10에서예를 들어, 1/5 직렬 희석7 102 복사본 / µ L x 6.4). 희석 배설물 샘플 DNA를 1/2, 1/5, 1/10. 반응 플러스 1 (표 2)의 총 수에 대 한 마스터 혼합 반응을 확인 합니다. 믹스 마스터 및 서식 파일 (표준, 샘플 또는 부정적인 제어를 위한 물)의 5 µ L의 믹스 30 µ L 384 잘 광 정량 접시에 각 잘에이 혼합의 10 µ L를 추가 합니다. 3 중 각 반응을 수행 합니다. 정량 장소 인감, 간단히 원심 및 로드 자전거 다음과 프로그램 정량 Pcr 기계에 접시: 95 ° C의 40 주기 뒤 20 분 동안 95 ° C 15 s를 1 분 동안 60 ° C. 표준 및 샘플에 대 한 CT 값을 가져옵니다. (으로 단계 3.1.9에서에서 계산) 플라스 미드의 사본 숫자의 로그 대 표준에 대 한 CT 값을 플롯 하 여 표준 곡선을 생성 합니다. 표준 곡선의 직계 회귀를 수행 합니다. 표준 곡선에서 (단계 3.2.2에서에서 얻은) CT 값을 보간하여 배설물 샘플 16S rDNA 복사본 수를 계산 합니다.참고: 각 샘플에 대 한 16S rDNA 복사 번호 수정 해야 합니다 (으로 단계 3.2.2에서에서 준비) 샘플의 희석 비율을 고려 하 고 최종 볼륨 핵 산 (2.15 단계)에서 eluted 했다 그를 분 변 샘플 (에서 계산된 단계 2.14)의 양 유전자는 배설물의 그램 당 복사합니다.