Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren
Summary
Wir beschreiben eine Inhouse entwickelten in-vitro- Flow Kammer-Modell, ermöglicht die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat.
Abstract
Rechtsventrikuläre Abfluss-Darm-Trakt (RVOT) Klappenersatz bei Patienten mit angeborenen Herzfehlern dienen verschiedene Ventil Leitungen und Ventile Stent montiert. Bei Verwendung von prothetische Materialien jedoch, sind diese Transplantate anfällig für bakterielle Infektionen und verschiedene Host Antworten.
Identifizierung von Bakterien und Host Faktoren, die eine entscheidende bei endovaskulären Einhaltung von Mikroorganismen Rolle ist wichtig zum besseren Verständnis die Pathophysiologie der das Auftreten von Infektionen wie infektiöse Endokarditis (IE) und präventiv zu entwickeln Strategien. Daher muss die Entwicklung zuständigen Modelle, bakterielle Adhäsion unter physiologischen scher Bedingungen zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer neu gestalteten in-vitro- Perfusion Kammer basierend auf parallelen Platten, die ermöglicht, dass die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten des Transplantats Gewebe ausgesetzt wie extrazelluläre Matrix, Endothelzellen und inerte Bereiche . Diese Methode kombiniert mit koloniebildenden Stückzählen (CFU) ist ausreichend, um die Neigung des Knochenmaterials gegen bakterielle Adhäsion unter Strömung zu bewerten. Könnte die Flow-Kammer-System weiterverwendet werden, die Rolle von Blutbestandteilen in bakterielle Adhäsion unter Scherung Bedingungen zu untersuchen. Wir bewiesen, dass die Quelle der Gewebe, ihre Oberflächenmorphologie und Bakterienarten Spezifität sind nicht die großen bestimmenden Faktoren im bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat durch unsere hauseigene gestaltete in-vitro- Perfusion Modell.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. Aureus) beschäftigt eine Vielzahl von Virulenz Strategien zur Umgehung der Host Immunabwehr besiedeln biologische oder nicht-biologischen Oberflächen implantiert in den menschlichen Kreislauf, führt zu schweren intravaskuläre Infektionen wie Sepsis und IE1,2,3,4,5. IE bleibt eine wichtige Behandlung verbundene Komplikation bei Patienten nach Implantation der Prothese Herzklappen während der einzelnen Faktoren für das Auftreten von IEare nicht noch völlig verstanden6,7. Unter Strömungsbedingungen begegnen Bakterien Scherkräfte, die sie benötigen, zu überwinden, um das Schiff Wand8einhalten. Modelle, die studieren des Zusammenspiel zwischen Bakterien und prothetische Ventil Gewebe oder Endothel unter Strömung zu ermöglichen, sind von Interesse, da sie die in-Vivo -Situation mehr widerspiegeln.
Mehrere spezifische Mechanismen ermöglichen bakterielle Einhaltung der Endothelzellen (ECs) und der exponierten subendothelial Matrix (ECM) führt zu Gewebe Kolonisation und Reifung der Vegetationen, wesentlichen frühen Schritte in IE9. Verschiedene Staphylokokken Oberflächenproteine oder MSCRAMMs (mikrobielle DGM-Komponenten erkennen Haftmatrix Moleküle) wurden als Vermittler der Adhäsion Wirtszellen und ECM Proteine beschrieben durch die Interaktion mit Molekülen wie Fibronektin, Fibrinogen, Kollagen und von-Willebrand-Faktor (VWF)8,10,11. Jedoch haben viele dieser Interaktionen aufgrund intramolekularer Falte der einige Virulenzfaktoren, meist unter statischen Bedingungen untersucht unterschiedliche Relevanz endovaskuläre Infektion im Blut zirkulieren.
Deshalb präsentieren wir ein Inhouse gestalteten in-vitro- Parallel-Platte Fluss Kammer-Modell, ermöglicht die Beurteilung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten von ECM und ECs im Zusammenhang mit Gewebetransplantate in die RVOT-Position implantiert. Das allgemeine Ziel des in dieser Arbeit beschriebenen Verfahrens ist es, Mechanismen der Interaktion zwischen Bakterien und darunter liegende endovaskuläre Gewebe in Strömungsverhältnisse, die eng, für die in-Vivo -Umwelt Blutkreislauf Krankheitserreger wie verbunden sind zu studieren S. Aureus. Dieser neuartige Ansatz konzentriert sich auf die Anfälligkeit der Transplantat Gewebe Oberflächen zu bakteriellen Einhaltung der Risikofaktoren für die Entwicklung von IE zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neuere klinische Beobachtungen geben besondere Aufmerksamkeit auf IE als Komplikation bei Patienten nach einer Klappenersatz des RVOT6,13. Dysfunktion der implantierten Ventil im IE ist das Ergebnis der bakteriellen Interaktion mit der endovaskuläre Prothese führt zu umfangreichen Entzündungs- und gerinnungsfördernden Reaktionen1,14. Präsentiert neue in-vitro- Modell erlaubt uns zu untersuch…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde gesponsert durch einen Zuschuss von der Research Fund KU Leuven (OT/14/097), RH gegeben. TRV war Postdoctoral Fellow der FWO Research Foundation – Flandern (Belgien; Gewährungsnummer – 12K0916N) und RH stützt sich auf die klinische Forschung Fonds UZ Leuven.
Materials
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | – | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF – ultrapure water – H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides – Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel – surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
Referenzen
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