وهنا يصف لنا أسلوب في فيفو ميكرودياليسيس لتحليل الإصدار اسبارتاتي والغلوتامات في الحصين البطني من الفئران الصرع وغير صرع، في تركيبة مع تسجيلات التخطيط الدماغي. قد ترتبط تركيزات خارج الخلية اسبارتاتي وغلوتامات مع المراحل المختلفة للمرض.
ميكرودياليسيس هو تقنية راسخة في علم الأعصاب التي ترتبط تغييرات المواد الفعالة عصبيا نشرها في الفضاء المخ المتداخلة مع السلوك و/أو نتائج محددة لعلم الأمراض (مثل المضبوطات للصرع). عند دراسة الصرع، غالباً ما يقترن تقنية ميكرودياليسيس مع قصيرة الأجل أو طويلة الأجل حتى الفيديو-المخ (EEG) رصد لتقييم تواتر الاستيلاء عفوية وشدته، والتقدم وتجميع. ميكرودياليسيس-التخطيط الدماغي مجتمعة يرتكز على استخدام عدة أساليب وأدوات. وهنا، أجرينا في فيفو ميكرودياليسيس والفيديو المستمر-EEG تسجيل لمراقبة تدفق غلوتامات واسبارتاتي على مر الزمن، في مراحل مختلفة من التاريخ الطبيعي للصرع في نموذج الفئران. ويسمح هذا النهج الموحد الاقتران من التغييرات في الإصدار العصبي بمراحل معينة من تطور المرض والتقدم. أن تركيز الأحماض الأمينية في دياليساتي تحددها اللوني السائل. هنا، يمكننا وصف الأساليب والخطوط العريضة التي ينبغي أن تتخذ التدابير الوقائية الرئيسية واحد خلال في فيفو ميكرودياليسيس-EEG، مع إيلاء اهتمام خاص لعملية جراحية ستيريوتاكسيك، وحفز البوتاسيوم القاعدية وعالية أثناء ميكرودياليسيس، عمق الكهربائي EEG تسجيل وتحليل عالية الأداء اللوني السائل اسبارتاتي والغلوتامات في دياليساتي. وهذا النهج قد تكون مناسبة لاختبار مجموعة متنوعة من المخدرات أو الأمراض الناجمة عن تغيرات التركيزات الفسيولوجية اسبارتاتي والغلوتامات في الدماغ. رهنا بتوافر المقايسة التحليلية المناسبة، قد زيادة استخدامه لاختبار مختلف الجزيئات القابلة للذوبان عند استخدام تسجيل EEG في نفس الوقت.
إلى التبصير بضعف وظيفي لوساطة غلوتامات ضادات وجابايرجيك كبيرة المثبطة أسفر عن المضبوطات عفوية في صرع الفص الصدغي (TLE)، نحن بانتظام رصد تركيزات خارج الخلية GABA1 وبعد ذلك طبعا مستويات الغلوتامات والاسبارتيت2 من ميكرودياليسيس في الحصين البطني من الفئران في نقاط زمنية مختلفة من هذا المرض الطبيعية، أيخلال التنمية والتقدم للصرع. ونحن استغل الطراز pilocarpine TLE في الفئران، الذي يحاكي هذا المرض بشكل دقيق جداً من حيث التغيرات السلوكية والكهربية ونسيجية3،4 ونحن يرتبط تركيز dialysate الأمينية الأحماض بمراحلها المختلفة: المرحلة الحادة بعد الإهانة ابيليبتوجينيك، في مرحلة الكمون، وقت الاستيلاء العفوية الأولى و6،75،فاس المزمنة. تأطير مراحل المرض كان مكن رصد EEG الفيديو الطويلة الأجل ودقة التخطيط الدماغي والسريرية توصيف المضبوطات عفوية. تطبيق تقنية ميكرودياليسيس المرتبطة برصد EEG الفيديو طويل الأجل يسمح لنا باقتراح فرضيات آليا لأمراض الأعصاب TLE. وباختصار، يتيح الأسلوب الموصوفة في هذه المخطوطة الاقتران من التعديلات الكيميائية العصبية داخل منطقة محددة بالدماغ مع التنمية والتقدم للصرع في نموذج حيوان.
الأجهزة المزدوجة، تتكون من عمق القطب محاذياً قنية ميكرودياليسيس، كثيرا ما تستخدم في الدراسات البحثية الصرع حيث ينبغي أن ترتبط التغيرات في الناقلات العصبية، ونواتج الأيض، أو ركائز الطاقة لنشاط الخلايا العصبية. في الغالبية العظمى من الحالات، وهو يستخدم في التصرف بحرية الحيوانات، ولكن يمكن أن تجري أيضا بطريقة مماثلة في البشر، مثلاً، في دراسة معمقة من العقاقير المقاومة مرضى الصرع تمر بعمق مسرى التحقيق قبل الجراحة8. يمكن تنفيذ تسجيل EEG، وجمع دياليساتي على حدة (مثلاً، زرع مسرى في واحد في نصف الكرة وميكرودياليسيس التحقيق في نصف الكرة الغربي الأخرى أو حتى أداء في ميكرودياليسيس في مجموعة واحدة من الحيوانات أثناء أداء التخطيط الدماغي الوحيد في مجموعة أخرى من الحيوانات). على الرغم من ذلك، اقتران أقطاب كهربائية إلى تحقيقات قد مزايا متعددة: أنه يبسط عملية جراحية ستيريوتاكسيك، ويحد من تلف الأنسجة إلى واحد فقط في نصف الكرة (بينما تترك الأخرى، سليمة، كعنصر تحكم لدراسات نسيجية)، وهوموجينيزيس نتائج هذه تم الحصول عليها من نفس المنطقة الدماغ والحيوان نفسه.
من ناحية أخرى، يتطلب إعداد الجهاز قطب كهربائي مسبار ميكرودياليسيس إلى جانب الوقت والمهارات إذا كان الصنع. واحد يمكن أن تنفق مبالغ مالية مرتفعة نسبيا إذا تم شراؤها من السوق. وعلاوة على ذلك، عندما يسبر ميكرودياليسيس (نصائح المسبار هي عادة 200-400 ميكرون في القطر و 7-12 ملم طويلة)9، واقطاب EEG (نصائح القطب عادة من 300-500 ميكرون في القطر، وطويل بما يكفي للوصول إلى هيكل الدماغ لفائدة10) بالإضافة إلى، يمثل الجهاز المحمل كائن ضخمة وثقيلة نسبيا على جانب واحد من الرأس، والتي مزعجة للحيوانات وعرضه لأن تضيع خاصة عندما كان متصلاً بمضخة غسيل الكلي ونظام تسجيل EEG الثابت من الأسلاك. هذا الجانب أكثر صلة بالصرع الحيوانات التي يصعب التعامل معها والتكيف أقل لدورات ميكرودياليسيس. التقنيات الجراحية المناسبة والرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية المناسبة يمكن أن ينتج يزرع طويلة الأمد التي تسبب أدنى إزعاج الحيوان وينبغي اتباعها لتجارب EEG ميكرودياليسيس كومبيناتوري، ،من1011 12.
مزايا وقيود تقنية ميكرودياليسيس قد استعرضت بالتفصيل العديد من علماء الأعصاب. ميزته الأساسية خلال في فيفو نضح تقنيات أخرى (مثلاً، دفع وجذب تدفق سريع أو نضح كأس القشرية) هو قطره صغيرة من التحقيق الذي يغطي منطقة دقيقة نسبيا لفائدة13،14، 15. ثانيا، يقوم الغشاء ميكرودياليسيس حاجز مادي بين الأنسجة وبيرفوساتي؛ ولذلك، المواد الوزن الجزيئي العالية لا عبور ولا تتداخل مع تحليل16،17. وعلاوة على ذلك، حماية الأنسجة من تدفق المضطرب بيرفوساتي18. ميزة هامة أخرى هي إمكانية تعديل تدفق بيرفوساتي لتحقيق أقصى قدر من التركيز أكثر في بيرفوساتي (أيعملية ميكرودياليسيس ويمكن أيضا تعريف رياضيا ويمكن تعديلها تسفر عن ارتفاع 19من تركيزات أكثر في العينة). وأخيراً، قد تستعمل التقنية ضخ الأدوية أو المواد عقاقيري النشط في الأنسجة للفائدة وتحديد أثرها في موقع تدخل20. من ناحية أخرى، قد ميكرودياليسيس وقت قرار محدودة (عادة أكثر من 1 دقيقة بسبب الوقت اللازم لجمع العينات) بالمقارنة مع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية أو البيولوجية؛ هو أسلوب الغازية التي تسبب تلف الأنسجة؛ أنه يعرض للخطر التوازن الكيميائية العصبية داخل الفضاء حول الغشاء بسبب الانحدار تركيز مستمر لجميع المواد القابلة للذوبان الذي يدخل بيرفوساتي جنبا إلى جنب مع أكثر الفائدة. وأخيراً، تقنية ميكرودياليسيس يتأثر عالية بحدود التقنيات التحليلية المستخدمة للتقدير الكمي للمواد في بيرفوساتي9،،من2122،23 . كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) بعد derivatization مع أورثوفثالديالديهيدي لتحليل العينات البيولوجية غلوتامات واسبارتاتي قد تم التحقق من صحتها جيدا24،،من2526 , 27 ومناقشة واسعة النطاق خارج نطاق هذه المخطوطة، ولكن سيتم وصف البيانات المنتجة باستخدام هذه الطريقة بالتفصيل.
عند القيام بشكل سليم ودون إدخال تعديلات على تكوين بيرفوساتي، ميكرودياليسيس يمكن أن توفر معلومات موثوقة حول المستويات القاعدية لإطلاق سراح العصبي. الجزء الأكبر من المستويات القاعدية ومن المرجح نتيجة لامتداد الإرسال من نهايات9. لأنه في كثير من الأحيان عينات بسيطة من العصبي في مساحة إضافية متشابك لا يكفي لتحقيق الأهداف المتمثلة في التحقيق، تقنية ميكرودياليسيس يمكن أن تستخدم أيضا لتحفيز الخلايا العصبية أو لحرمانهم من الأهمية أيونات الفسيولوجية مثل ك+ Ca2 +، أو من أجل استحضار أو منع الإفراج عن العصبي.
غالباً ما يستخدم عالية ك+ التحفيز في بيولوجيا الأعصاب لتحفيز نشاط الخلايا العصبية ليس فقط في الحيوانات مستيقظا ولكن أيضا في الثقافات الابتدائية وأورجانوتيبيك. تعرض نظام صحي العصبي المركزي للحلول مع تركيزات عالية من ك+ (40-100 ملم) تثير افلوكس من العصبية28. يمكن أن يتعرض هذا قدرة الخلايا العصبية على توفير إصدار إضافية استجابة لارتفاع ك+ في الحيوانات الصرع1 في29،أمراض الأعصاب الأخرى30. وبالمثل، Ca2 + الحرمان (التي تم الحصول عليها من بيرفوسينج Ca2 + الحلول مجاناً) يستخدم لوضع الكالسيوم تعتمد على إطلاق سراح معظم أجهزة الإرسال العصبية التي تقاس ميكرودياليسيس. ويعتقد عموما أن Ca2 + تعتمد الإصدار منشأ الخلايا العصبية، بينما تنشأ Ca2 + الإصدار المستقل من إطلاق، ولكن العديد من الدراسات أثارت الجدل حول معنى Ca2 +-قياسات حساسة مثل غلوتامات أو GABA9: وهكذا، إذا كان ذلك ممكناً، فمن المستحسن أن دعم الدراسات ميكرودياليسيس بالدراسات ميكروسينسور، وهذه الأخيرة أعلى القرار المكانية والأقطاب يسمح للحصول على أقرب إلى نهايات31.
فيما يتعلق بالدراسات ميكرودياليسيس في الحيوانات الصرع، من المهم التأكيد على أن البيانات التي تم الحصول عليها من معظم هذه تعتمد على رصد الفيديو أو الفيديو-EEG للمضبوطات، أيحدوث عابرة من علامات أو أعراض غير طبيعية بسبب المفرطة أو متزامن مع نشاط الخلايا العصبية في الدماغ32. وهناك بعض التفاصيل من مضبوطات اليكتروجرافيك في التعامل مع pilocarpine الحيوانات التي ينبغي النظر فيها عند إعداد التجربة. مضبوطات عفوية يتبعها كساد النشاط مع كثرة التخطيط الدماغي المسامير إينتيريكتال3 وتحدث في مجموعات،من3334. شام يشغلها غير صرع الحيوانات قد يحمل نشاط مثل الاستيلاء على35 ولذلك ينبغي أن تكون معايير التقييم تسجيلات التخطيط الدماغي موحدة36 ، وإذا كان ذلك ممكناً، ينبغي أن يكون توقيت الدورات ميكرودياليسيس محددة تحديداً جيدا. وأخيراً، ونحن نوصي بشدة وفقا للمبادئ والمعايير المنهجية لرصد EEG الفيديو في مكافحة القوارض الكبار حددها خبراء الجامعة الدولية ضد الصرع وجمعية الصرع الأمريكية في تقاريرها الأخيرة جداً37 ،38.
وهنا يصف لنا ميكرودياليسيس الغلوتامات واسبارتاتي جنبا إلى جنب مع تسجيلات الفيديو-EEG طويلة الأجل في الحيوانات الصرع وتحليلها في دياليساتي واسطة [هبلك]. وسوف نؤكد على الخطوات الحاسمة من البروتوكول أن المرء يجب العناية لنتيجة أفضل.
نحن في هذا العمل، يظهر كيف يمكن أن يتم تسجيل الفيديو-EEG مستمر مقرونا ميكرودياليسيس في نموذج تجريبي ل TLE. وتستخدم تقنيات تسجيل الفيديو-EEG لتشخيص المراحل المختلفة لتطور المرض في الحيوانات بشكل صحيح ويتم استخدام تقنية ميكرودياليسيس لوصف التغييرات في الإصدار الغلوتامات التي تحدث في الوقت الم?…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أود أن أشكر Anna بيناشي وباولو رونكون وايليونورا بالما لمساهمتها في المخطوطات المنشورة في الأسبقية.
3-channel two-twisted electrode | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
guide cannula | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | Material |
Resin KK2 Plastik | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | Material |
Super Attack gel Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | Material |
Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
Xylazine | Sigma, Milano, Italy | X1251 | Material |
Isoflurane-Vet | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | Solution |
Altadol 50 mg/ ml – tramadol | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | Solution |
Gentalyn 0.1% crm – gentamycine | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | Material |
simplex rapid dental cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
GlasIonomer CX-Plus Cement | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | Material |
probe clip holder | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | Equipment |
Histoacryl® Blue Topical Skin Adhesive | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | Material |
Valium 10 mg/2 ml – diazepam | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | Material |
1 mL syringe with 25G needle | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | Material |
rat flexible feeding needle 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
modular data acquisition and analysis system MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
digital video surveillance system | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | Equipment |
microdialysis probe | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | Material |
microdialysis probe | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | Material |
block heater | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | Equipment |
stirrer | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | Equipment |
infusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | Equipment |
fine bore polythene tubing | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | Material |
blue tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | Material |
red tubing adapters | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | Material |
2.5 mL syringe with 22G needle | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | Material |
vial cap | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | Material |
septum | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum | Material |
glass insert with bottom spring | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | Material |
autosampler vial | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | Material |
Smartline manager 5000 system controller and degasser unit | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | Equipment |
Smartline 1000 quaternary gradient pump | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | Equipment |
spectrofluorometric detector | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | Equipment |
chromatogrphic column | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | Material |
chromatogrphic pre-column | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | Material |
mobile phase solution A | 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0 | Solution | |
mobile phase solution B | 40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5 | Solution | |
Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
modified Ringer solution | composition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSA | Solution | |
saline | 0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0 | Solution | |
sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Solution |