生体内でマウスにおける活性酸素種のイメージング創モデル
Summary
L-012、化学発光のルミノール アナログを視覚化し、マウス切除創傷モデルで生成される活性酸素種 (ROS) を定量化を利用した、非侵襲的生体内でイメージ投射は、効率的でコスト効果の高い、プロトコルについて述べる.
Abstract
活性酸素種 (ROS) の生成は炎症性プロセスの特徴が、過剰な酸化ストレスは広くがん、動脈硬化、糖尿病など様々 な疾患に関与。我々 は以前に核因子 (赤血球由来 2) の機能障害-2 (Nrf2) のような糖尿病患者の創傷処置生理: Kelch 様赤芽球細胞由来蛋白質 1 (Keap1) を信号経路は、皮膚の中にロスが極端に不均衡につながる/。ROS レベルは創傷治癒の進行の重要な指標であるので、具体的かつ正確な定量化技術、貴重です。細胞や組織の活性酸素を測定するいくつか生体外の試金が記載されています。しかし、彼らはのみサンプルあたり 1 つの累積的な測定を提供します。最近では、タンパク質ベースのインジケーターおよびイメージ投射様相の開発独自の時空間解析許可されています。L-012 (C13H8ClN4直2)、ルミノール誘導体の生体内と体外の化学発光の両方に使用できるNAPDH 酸化酵素によって生成される活性酸素の検出。L-012 他蛍光プローブより強い信号を出力し、機密とロスを検出するため信頼性の高いことが示されています。L 012 促進イメージングの時間経過の適用性は、犠牲の必要性を削減し、全体的な研究の動物の数を減らす炎症性プロセスに関する貴重な情報を提供します。ここでは、L 012 促進体内糖尿病マウスを用いたローカル機能不全 Nrf2/Keap1 の切除創傷治癒モデルにおける酸化ストレスを定量化するイメージングを利用したプロトコルについて述べる。
Introduction
炎症性プロセスによって生成された酸素代謝は細胞成分1の破壊的な変更と同様、様々 なシグナル伝達カスケードに貢献します。ROS を測定する高感度および特定の技術は、炎症性プロセスを調査し、酸化ストレスの影響を特徴付けるのため重要です。In vivoイメージングは、生体組織の動的空間的および時間的なデータを提供する能力のため貴重です。L-012 はスーパーオキシド陰イオンの高感度は、細胞、組織、および全血1,2,3,その他蛍光プローブより高い光強度を生成する合成化学発光プローブ4. 関節炎、大腸炎の5,6を含むいくつかの炎症性疾患を研究する生体内イメージング マウスモデルでの正常に採用されています。まだ確立された皮膚創傷治癒モデルで採用される必要があります。生成される活性酸素の測定はさまざまな条件下での創傷治癒の進行を評価するために均等に関連です。感度とこのメソッドの非侵襲的自然治癒マウス モデル間でを研究のための有望な技術になります。
Nrf2 は抗酸化反応といくつか抗酸化酵素8のプロモーター領域に一般的な抗酸化剤応答要素 (は) に特異的な転写因子の主要なドライバーです。酸化ストレスのない場合は、Nrf2 は Keap1 は、その後そのユビキチン化と分解を原因によって細胞質内に隔離されます。Nrf2/Keap1 経路の不均衡は、不適切なレドックスの恒常性と酸化ストレスの増加9の設定の遅延の創傷治癒過程に関与しています。我々 は以前、Keap1 の抑制が Nrf2 活性の上昇を刺激し、促進することを示されている糖尿病の病理学的皮膚創傷治癒過程の救助傷9。
ここで ROS や創傷治癒の間の関連付けを強調するため非常に重要です切除皮膚創傷治癒モデルにおける ROS レベルを測定するイメージング L 012 補助発光を利用するプロトコルについて述べる。この手法は、傷および即時の周囲の内で酸化的負担にリアルタイムの変更を示します。さらに、このメソッドは、介入およびメカニズムの迅速な評価のため、影響を与える酸化還元処理をするをできます。ここで酸化還元の恒常性の回復のための戦略の有効性を評価するのにKeap1 ノックダウンのモデルを使用します。本手法は非侵襲的傷が妨げられるため、同じ動物は組織またはセル lysates に基づいてさらに確証的解析に使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ROS を測定するための一般的な手法は、組織抽出または同様に侵襲的な技術を必要とする複雑なプロトコルによって制限されています。近年、酸化ストレスの測定は、革新的な画像診断装置をそれによって時空間評価9,10,11に基づいて報告されています。L-012 は、ルミノール、ルシゲニン、MCLA1,<sup …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
医学 NYU オーランド アリスティバルとユーセフ Zaim Wadghiri のおかげで特別な前臨床イメージング コアに感謝しております。コアは、ローラとアイザック パールミュッターがんセンター サポート助成金 NIH/NCI 5P30CA016087 と NIBIB バイオメディカル技術リソース センター助成金 NIH P41 EB017183、部分的にサポート、共有リソースです。この作業は [許可番号 1-16-エース-08] d. c. と p. r. に NYU 適用研究支援基金に米国糖尿病協会「糖尿病を停止する経路」によって支えられた
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
Referenzen
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