En vindtunnel til lugt medieret insekt adfærdsmæssige Assays

Vindtunnelen er et vigtigt redskab i insekt kemiske økologi undersøgelser, der giver mulighed for laboratorietest af insekt flyvning svar til semiochemicals. Ved at frigive lugte i en kontrolleret vind strøm, kan insekter adfærdsmæssige reaktion på disse stimuli overvåges direkte ved at studere deres vindretningen flugt mod kilden. Lugtesansen er den vigtigste sensoriske mekanisme som mange insekter interagere med deres biotiske miljø¹. Insekter bruger lugt stikord til at finde egnede partnere til parring. På samme måde, de bruger lugt buketter fra værten ressourcer til at finde føde selv, eller afkom. Planter frigive blomster lugte i kombination med nektar og pollen belønninger til sikre insekt bestøvning effektivitet. Alle disse flygtige stikord diffuse passivt i miljøet og insekter skal identificere og fortolke deres individuelle relevans. Som flygtige stoffer der frigives i miljøet, rejser molekylerne med vinden som filamenter, bevarer den oprindelige koncentration for lange afstande vindretningen, før til sidst at blive brudt op og fortyndet af turbulens og diffusion². Insekter kan registrere minute ændringer i ustabile signal og direkte deres bevægelse vindretningen, mod kilden. Insekter vise en flyvning adfærd med hurtigt vindretningen strømstød ved kontakt med en attraktiv lugt, og støbning sidelæns ved tab til at flytte lugten plume^3,4. Olfaktoriske neuroner i sensilla af insekt antenner Co lokaliserede arrangementet kan lette adfærdsmæssige reaktioner på debut og tab af plume kontakt med bemærkelsesværdig høj opløsning⁵ og aktiverer insekter kan skelne mellem lignende lugt molekyler med oprindelse fra forskellige kilder⁶. Visuel feedback samtidig i flugt, betegnes optomotor anemotaxis, er grundlæggende at identificere vindretningen, objekter og relative forskydning^2,7. Ved hjælp af sensoriske interaktion og sofistikeret adfærd, kan insekter finde punktkilder i en tre-dimensionelle miljø.

Identifikation af insekt attraktanter og afskrækningsmidler kan have flere vigtige anvendte aspekter. Sex feromoner (intraspecific signaler) på mange skadedyr insekter kan syntetiseres og udgivet i luften for at forstyrre den parring adfærd⁸. Både feromoner og kairomones (artskrydsede signaler) kan bruges til masse diffusering, tiltrække og dræbe i overvågning fælder for at give direkte oplysninger af skadedyr status. Insektmidler, såsom myg⁹, kan også studeres i vindtunnel bioassays. Disse metoder spille en vigtig rolle for integreret bekæmpelse af skadegørere styring og beslutning støtteordninger for landmænd.

Vindtunnel bioassays, hvor lugt medieret adfærd repertoire af en art kan overvåges, er en kraftfuld metode til at identificere potentielle nye værktøjer til skadedyrsbekæmpelse til at erstatte eller mindske virkningerne af anvendelsen af pesticider.

Det teoretiske ræsonnementet bag vindtunnel-design er grundigt beskrevet¹⁰. Her, beskriver vi vindtunnel byggeri, lugt ansøgning og flight adfærd, der er blevet brugt i flere forsøg for at bestemme vindtunnel bioassay protokol. Vindtunnel (figur 1) på Nibio (Ås, Norge) er fremstillet af ridsefast gennemsigtig polycarbonat. Flight arena er 67 cm høj, 88 cm bred og 200 cm lang. Foran flyvning arena er der en ekstra polycarbonat sektion, 30 cm lang. Denne del af vindtunnel fungerer som et hjælpeprogram sektion for anvendelsen af lugte. Hvis de flygtige stoffer kommer i kontakt med polycarbonat boliger i arenaen fly de kan senere blive genudgivet og forurene mellem sessioner. På hver ende af afsnittet nytte er der derfor en perforeret metal gitter. Begge gitre begrænse luftstrømmen og skabe et lille overtryk på vindretningen side. Dette resulterer i øget laminar flow i vindretningen side. Gitteret vindretningen er lavet af en perforeret metal plade med 8 mm huller jævnt fordelt i hele tværsnittet af tunnelen med 54% åbne område. Vindretningen gitteret har huller på 3 mm og en 51% åbne område. Dette reducerer turbulensen og sikrer, at lugt plume rejser centralt ned på længden af flyvningen arena. Lugt plume vil have form af en smal kegle og kan visualiseres ved hjælp af røg. På gulvet i flyvningen er arena, plast eller papir cirkler af forskellig størrelse (fra 5 til 15 cm i diameter) lagt ud til at give insekter visuel feedback under flyvningen. Der er en 25 af 50 cm adgang dør på vindretningen slutningen af flyvningen arena og i afsnittet nytte. Mellem vindretningen slutningen af flyvningen arena og afsnittet udstødning filter er der en 60 cm åbent område for insekt håndtering. Denne adgang område er dækket på sider med en 0,8 mm fintmaskede stof til at forhindre insekter undslipper til rummet.

Luften er trukket ind i den første filter boliger af en fan. Luften passerer gennem en støv filter før det er renset af 24 høj kapacitet aktivt kul filtre og udgivet i tunnelen. Luften forlader tunnelen er passeret gennem en lignende filter bolig før den blev udgivet tilbage ind i stuen. Det kan være gavnligt for udsugning til ydersiden af bygningen gennem et stinkskab. Fans på begge filterhuse køres med lige flow. Både fans har en kontinuerlig lysdæmper og er kalibreret til forskellige vindhastigheder ved hjælp af et flowmeter. Luft hastighed er afhængig af de arter, der er testet. 30 cm s^-1 er ofte et godt udgangspunkt. For små insekter, den ideelle luft hastighed kan reduceres, og for stærk flyers, flyvehastighed kan være højere for at øge relative flyvning afstanden.

Vindtunnel værelse letter kontrol af temperatur, luftfugtighed og lysintensitet. LED strips er placeret bag en 3 mm uigennemsigtig poly(methyl methacrylate) rude til at oprette en diffus lyskilde ovenfor og bag arenaen flyvning. Begge lyskilder kan kontrolleres uafhængigt.

Lugt ansøgning kan opnås med flere midler. Generelt, lugte frigives til luftstrømmen i midten af vindretningen slutningen af flyvningen arena. Afhængigt af forskningsspørgsmål ved hånden, kan frigivelsen punkt udsat eller dækket. Et glas cylinder (10 cm diameter, 12,5 cm lang) med et metalnet (2 × 2 mm maskestørrelse) i vindretningen side kan visuelt blokere lugt kilde og samtidig fungere som en landing platform for insekter. I mange eksperimenter, kan en vandret glas platform bruges til at præsentere lugt kilder eller visuelle signaler tæt på frigivelsen punkt. Der er også mulighed for at frigive to lugte samtidig side om side, at lette valg assays. Release punkter er så placeret 20 cm fra hinanden og lugt plumes overlapper fra halvvejs ned i tunnelen. Valget kan derefter identificeres af hvilke plume insekt følger vindretningen.

Vindtunnel-design letter talrige flygtige release metoder. For eksempel kan en bestemt lugt frigives foran en baggrund lugt som udsendes af en afgrøde Vegetabilske^11,12. Desuden kan være forskellige visuelle stimuli testet^13,14. Opsætningen af eksperimenterende skal tilpasses til hver art og forskning spørgsmål.

Naturlige lugt kilder, såsom plantedele og syntetiske lugte fra dispensere kan indføres direkte i arenaen flyvning. For at isolere lugt medieret adfærd fra visuel, lugt kilde kan dækkes, eller de flygtige stoffer transporteres ind i arenaen fly via en trækul filtrerede laboratorium lufttilførsel udefra. Lugt kilden er så begrænset til en glaskrukke og luften er skubbet gennem krukken i vindtunnelen via Teflon rør og glas rør. Flyvehastighed ved frigivelsen punkt bør matche vindhastigheden i arenaen.

For at frigive lugte på særlige blanding nøgletal, kan en sprøjte anvendes. Sprøjten er en ultralyd dyse med en kegleformet spids og en indsatte microbore til at lette en flydende flow på 10 µL min^-1. Dysen er forbundet til en bredbånds ultralyd generator og opererer på 120 kHz. En sprøjten pumpe skubber lugt prøven i sprøjte dyse. Fluorholdige ethylen propylen (FEP) slanger med 0,12 mm indre diameter er tilslutning 1 mL er gastætte sprøjten og dysen. Slangen adaptere, som svulme i ethanol og skrumpe i luft, fremme tætsiddende med ingen indvendige volumen. Aerosol Dråbestørrelse genereret fra vibrationer i dysen er frekvens afhængige og afhænger af den specifikke opløsningsmidlet anvendes. De små dråber fordamper og bringes ned i vindtunnel som flygtige stoffer. Andre sprøjten designs findes også og en billigere version udnytter en piezo drevet glas kapillær giver en lignende løsning¹⁵.

Syntetiske blandinger eller headspace samlinger kan bruges med sprøjten. Prøverne fortyndes med ren ethanol til den ønskede koncentration. Med flygtige samlinger, kan prøven fortyndes for at svare til afhentningstidspunkt. Det betyder, at en flygtig samling stikprøven over 3 h skal fortyndes til 1800 µL, som på en frigivelse sats fra sprøjten på 10 µL min^-1 svarer til 3 h.

Identifikation af flyvningen opførsel kan gøres direkte ved manuel observation eller ved post hoc videoanalyse. Orienteret flyvningen bør skelnes fra tilfældige flyvning. Lugt medieret adfærd kan blive genkendt af følgende karakteristika: zig-zag flyvning på tværs af lugt plume, lige vindretningen flyvning når inde røgfanen, og springer tilbage hvis kontakt med røgfanen er tabt. Efter tabet af en attraktiv plume, kan insekter også begynde at zig-zag med stigende buer til at genoprette forbindelsen til tabt plume^3,4. Denne adfærd er grundlæggende i feltet omgivelser hvor insekter efter en attraktiv lugt skal håndtere turbulens og skiftende vindretninger. Flight mønster er ikke ensartet og varierer på tværs af de insekt ordrer. Som et eksempel, stærk flyers som blowflies har en hurtigere vindretningen orientering med bredere støbning mønster end møl og vindhastigheden skal øges for at fremme et længere relative flyvevej.

Rækken af et insekt kan også blive filmet. Med et enkelt kamera, kan enkle flyvning karakteristika betegnes ved plotte x y koordinaterne¹⁶. Ved hjælp af to kameraer med synkroniserede ramme fange, kan den 3D flyvning rekonstrueres ved hjælp af en ekstern programmel¹⁷. Flight spor kan derefter analyseres for at give oplysninger om flyvning hastighed og distance, flight vinkler med hensyn til vindretningen og detaljer om flyvning karakteristika i forhold til lugt plume. Der er både brugerdefineret og kommercielle udstyr og software til rådighed, som aktiverer automatisk ramme ved ramme sporing. Kalibrering rammer bør anvendes til at henvise til virkelige verden rum, og retlinede vidvinkelobjektiver bør anvendes til at minimere linseforvrængning. Bør udvises forsigtighed, at reducere visuelle baggrundsstøj, såsom kanter og hjørner i arenaen vindtunnel og maksimere insekt baggrund diskrimination. Ved hjælp af en infrarød lyskilde, refleksion (fx., fra nocturnal myg) kan blive filmet med monokrom CCD kameraer¹⁷.