Tigriopus Copepods 및 그들의 동료를 지키는 행동의 정량 분석의 개별 경작

1. 처녀 동물 행동 관찰에 대 한 준비 수정 된 난 자 취득 하 고 부 화 하도록 허용. 파스퇴르 피 펫 주식 문화에서 분명 오렌지 (즉, 수정 및 개발의 고급 단계) 계란 (그림 3C)을 들고 벗 여성을 수집 합니다. 부드럽게 문화에 부 화 할 수 있습니다 nauplial 애벌레를 포함 한 다른 동물의 양도 피하기 위해 깨끗 한 문화 매체에 pipetting으로 암컷을 씻어.참고:이 프로토콜에 35%의 염 분을 함께 인공 해 수 문화 매체로 사용 됩니다. 실험의 목적에 따라 다른 매체 (예: 인공 해 수는 높은 염 분 또는 추가 용액)을 사용 합니다.주: Barreto 외. 201512 실험실 문화 주식의 설립에 대 한 방법 및 페 레이 라 외. 201613 T. californicus의 자연 인구의 컬렉션 사이트의 예를 참조 하십시오. 피터슨 외. 또한 위도 및 경도 정보9 T. californicus, T. fulvus및 t. 나무 의 그들의 컬렉션 사이트를 보고. 약 30-50 mL의 용량을 가진 플라스틱 펫을 사용 하 여 Tigriopus copepods 록 풀에서 수집. 깨끗 한 문화 매체 (그림 4, 왼쪽)와 6-잘 셀 문화 접시의 우물에 개별적으로 각 여성을 배치 합니다. 어떤 다른 동물 (를 포함 하 여 nauplial 유 충) 잘 오염 되는 것을 확인 하십시오. 그들은 계란 낭을 발표할 때까지 여성 문화 12 시간 빛 어두운 주기와 20 ° C에서 설정 하는 인큐베이터에 접시를 유지 합니다. 이 단계는 일반적으로 종 및 태아의 발달 단계에 따라 1 ~ 10 일 걸립니다. 한편, 잘게 지상 (약 < 0.5 m m 직경에서) 물고기 음식의 두 곡물과 각 벗 여성 일주일에 두 번 피드 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조).참고: 다른 온도 및 실험의 목적에 따라 가벼운 주기를 사용 합니다. 높은 온도 배아의 더 급속 한 발전을 용이 하 게 수 있습니다.참고: 초과 음식 우물에서 썩 어 떠나 피하십시오. 음식 파편은 부패 하기 시작, 파스퇴르 피 펫과 우물에서 플라스틱. 계란 낭 출시 후 파스퇴르 피 펫과 문화 우물에서 여성을 제거 합니다.참고: 수정 여성 자손2,3의 여러 클러치를 산란 할 수 있다. 필요한 경우, 추가 클러치를 수집 하는 다른 우물에 암컷을 전송. Copepodids 개별 문화에 대 한 수집 합니다. 인큐베이터에 빗금된 nauplii와 플레이트를 유지 하 고 그들은 첫 번째 copepodid (CI) 단계 (그림 4, 중간)에 개발 될 때까지 nauplii 문화. 이 단계는 일반적으로 1 ~ 2 주 걸립니다. 잘게 땅의 여러 곡물과 잘 각 피드 한 번 매 2 일 CI 동물에 대 한 검색 하는 동안 음식 생선. 증류수와 증발된 양육 물 리필.참고: 경우 보기를 방해 하는 부동 파편, 종이 타월의 작은 조각으로 그것을 탈지. CI 동물 등장 하기 시작, 약 8 µ L, 10 X 40 X 확대 (그림 4, 오른쪽)에 stereomicroscope 아래에서 설정 하는 pipetting 볼륨 그들을 P-10 micropipette와 우물에서 수집 합니다. 부드럽게 깨끗 한 인공 해 수에 pipetting으로 각 CI 동물을 세척 하 고 포함 하는 인공적인 바닷물의 2-3 m m 깊이 (약 400-600 µ L) 24-잘 셀 문화 판의 우물에.참고: nauplial exuviae 또는 개별 문화에 대 한 웰 스에 다른 동물 운반 하지 마십시오. Molted exuviae를 계산 하 여 개인의 발전을 추적 합니다. 10 X 40 X 확대에 어두운 필드 조명 아래 stereomicroscopic 관찰 하 여 (필요한 경우 주파수 조정) 2 ~ 3 일 마다 molted exuviae에 대 한 각 잘 내부 검사. Exuviae copepodids의 투명 하 고 곤두 다리, 꼬리 라미 (즉, 얇은 구조는 꼬리 끝에 튀어나온), prosome 및 urosome (그림 5)의 세분화의 쌍으로 인식할 수 있습니다. 집중 하 고 잘 (그림 6A)에 다른 깊이에서 exuviae를 감지 하는 조명 변경 합니다.참고: Molted exuviae는 그들을 molted는 동물 보다 작습니다. 동물 및 비교적 최근의 exuviae 변화에 대 한 낮은 배율에서 높은 확대 이전 (즉, 더 작은) exuviae에 대 한 검사를 시작 합니다.참고: exuviae는 잘에서 손상 된 경우 발달 단계의 오판을 피하기 위해 더 발달 추적에서 잘을 제거 합니다.참고: 경우 부동 파편 방해 보기 (그림 6B), 종이 타월의 작은 조각으로 그것을 탈지. 집계 표시 접시 뚜껑 (그림 7)에 각 잘에서 copepodid exuviae의 총 수를 기록 합니다. 새로운 exuviae에는 잘 발견으로 마크 한 줄을 추가 합니다.참고: nauplial 경우 exuviae에는 잘 오염, 수에서 그들을 제거. 잘게 땅의 두 곡물과 각 개별 피드 물고기 음식. 증류수는 염 분을 유지 하기 위해 증발된 양육 물 리필.참고: 소비 및 개발 단계 (단계 1.3.4)의 추정에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 molted exuviae 손상에서 그들을 방지 하기 위해 2 ~ 3 일 마다 copepodids 피드. exuviae의 수에 따라 동물의 발달 단계를 견적 한다. 아무 exuviae 경우에, 개인은 CI 단계에서 것으로 추정 됩니다. 1-4 exuviae 경우 개인은 추정 CII에 이력서 단계에. 5 exuviae 경우 개인 성인 추정. 형태에 따라 성인의 섹스를 식별 합니다. 그들의 형태학을 검사 하 여 섹스 동물입니다. 성인 Tigriopus 남성 선단부 (그림 3A)에 걸려들 고 구형 구조와 geniculate 첫 번째 안테나를가지고 있습니다. 성인 여성은 소유 남성 보다 부드럽고 상대적으로 얇은 첫 번째 안테나 (그림 3B). 일부 여성 또한 그들의 시체 (그림 3B, 3D)에 gonadal 지질에서 진한 녹색 색깔을 전시 한다. (그림 7B) 우물의 뚜껑에 섹스를 표시 합니다. 2. 행동 테스트와 친구를 지키는 행동의 비디오 녹화 테스트 당일 원하는 무대와 행동 테스트에 대 한 섹스의 동물을 선택 합니다. 가늘게 지상 물고기 음식 문화 우물에서 선택한 개인을 피드 하 고 30 분 동안 그것을 먹을 수 있도록. 한편, 2.1.2 테스트 챔버 준비 단계를 진행 합니다. 테스트 챔버;으로 두 48-잘 플랫 바닥 세포 배양 배지 준비 1 개의 판 (이 하 “접시 A”에 게 불리는) 남성 고 대상 (예: copepodids, 성인 여성, 성인 남성)입니다 다른 (“접시 B”). 격판덮개의 우물에서 35%의 염 분을 깨끗 한 인공 해 수의 400 µ L를 추가 합니다. 가벼운 기관총 (그림 8)으로 반투명 아크릴 보드로 덮여 LED 빛 패드에 접시를 놓습니다.참고: 실험의 목적에 따라 다른 매체를 사용 합니다.참고: 과도 한 열을 방지 하려면 사용 하지 마십시오 백열 또는 형광 램프는 백라이트로. 2.1.1에 설명 된 30 분 수 유 시간 후 부드럽게 가득한 깨끗 한 인공 해 수 (그림 9) 파편과 문화 우물에서 exuviae의 수행을 방지 하기 위해 24-잘 접시의 4 개의 우물의 승계에 pipetting으로 각 동물을 씻어. A와 B 플레이트 LED 빛 패드의 우물에 씻어 서 개인을 놓습니다. 우물에 동물의 조정에 대 일 분을 허용 합니다. (그림 8) 조정 기간 플레이트 A 위의 비디오 카메라를 설정 합니다. 카메라를 삼각대 나 스탠드를 사용 합니다. 접시 안테나의 관측을 허용 하는 A 안에 남성에 카메라 초점을.참고: 영화에 백라이트의 깜박임 줄이기 위해, 프레임 속도 크거나 또는 전기 주파수의 절반을 설정 하 고 더 긴 노출 시간을 사용 하 여. 또한, LED 빛 패드 2.1.2 단계에서 설명한 대로 반투명 아크릴 보드로 덮여 유지. 2.1.4 단계에 설명 된 조정 기간 후 비디오 녹화 및 동작 테스트를 시작 합니다. 플레이트 B에서에서 파스퇴르 피 펫 플레이트 A 목표를 전송. 실험 매체에 화학 성분에 민감한 경우에, 각 테스트 쌍 펫을 변경 합니다.참고: 때 접시 B에서에서 동물 pipetting 할 하지 쫓아 그것 파스퇴르 피 펫으로 물에 물 소요 수 있습니다 동물을 자극 하 고 초과 움직임을 유도. 약간 물 표면 위에 피 펫의 끝을 잡고 고 팁 아래 서 개인 기 다. 작은 양의 인공 해 수를 부드럽게 플라스틱 그리고 접시 A.에 잘으로 추출 실험 계획에 따라 남자와 대상 전송 후 원하는 관찰 시간 (예: 10 분) 동안에 각 잘 상호 작용을 허용 합니다. 관측 시간 후 비디오 녹화를 중지 합니다. 필요한 경우 컴퓨터에 카메라에서 기록된 영화를 다운로드. 3. 수동 분석 행동 속성 각 대상에 대답 잘으로 전근 때 타이밍에 대 한 영화 검토 시작 및 종료 시기 관심 이벤트를 검토 하 고 기간, 대기 시간, 이벤트의 빈도 계산. (그림 10, 왼쪽 상단) 대상의 어떤 신체 부분으로 남자의 안테나의 접촉으로 남성에 의해 감시 시도의 시작을 정의 합니다. 더듬이 접촉 신속 앞에 종종 (< 0.5 s) 쫓 거 나 뛰 쳐. 남자의 두 안테나 (그림 10, 오른쪽 상단) 대상의 시체에서 분리 될 때 감시 시도의 종료 지점으로 정의 합니다. 시도 지키고의 주파수를 계산. 그 여성 (그림 10, 오른쪽 하단)에 대 한 urosome의 반복적인 보도 뒤 남자의 등 신체 굴곡에 의해 결합의 시작을 정의 합니다. 밀어의 주파수는 초당 여러 번입니다.참고: 감시 남성 결합 (그림 10, 왼쪽 하단) 전에 여성 신체의 꼬리 끝 아래로 크롤링합니다. 3.2.4에서 설명 하는 이벤트 후에 urosomes의 분리에 의해 결합의 종료를 정의 합니다.참고: 결합 일반적으로 일어난다 토니 californicus 과 T. 나무의 경우에 몇 분 동안. 4. 2 차원 추적 개인 및 쌍의 영화 편집 소프트웨어와 함께 2 단계에서 기록 영화를 트리밍 하 여 관심 (예: 첫 번째 3 감시 시도의 s)의 한 에피소드를 갖춘 비디오 클립을 생성 합니다. ImageJ14 에서 설치: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. 다음 다운로드 MTrackJ, ImageJ15, 모션 추적 플러그인으로 지시 뒤에: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/. ImageJ 열고 관심의 영화를 가져오기 (예를 들어, 파일 > 가져오기 >를 사용 하 여 QuickTime; 이미지 처리에 필요한 메모리를 줄이기 위해 “변환 8 비트 회색조”를 선택). 공간 및 시간 보정을 수행 합니다. ImageJ 창 공간 보정에 대 한 직선 라인 선택 도구를 선택 합니다. 영화 창에서 알려진된 길이 (예: 우물의 직경)를 가진 개체에 따라 선택 라인을 그립니다. “비율 설정” 메뉴를 열고 (분석 > 비율 설정). “알려진 거리” 상자에 “단위의 길이” 상자에서 그것의 단위 (예: mm) 알려진된 길이 입력 합니다. 다른 비디오 클립에 대 한 규모를 사용 하 여 “Global” 확인란을 클릭 합니다. “속성” 메뉴를 엽니다 (이미지 > 속성) 시간 보정에 대 한. 프레임 간격 (프레임 속도의 상호) “프레임 간격” 상자에 입력 합니다. MTrackJ를 추적을 구성 합니다. 플러그인에서 MTrackJ 플러그인을 열고 > ImageJ에 MtrackJ. 추적 열 MTrackJ 대화 창에서 “추적” 버튼을 클릭 합니다 구성 메뉴. “포인트를 추가한 후 다음 시간 인덱스 이동”을 선택 하 여 추적 간격 설정 구성 대화 창에서 “시간 스텝 크기” 상자에 숫자를 입력 하 고. 프레임별으로 추적을 수행 하려면 “시간 스텝 크기” 상자에 “1” 입력 합니다. “적용 로컬 커서 추적 중 스냅”를 확인 하 고 스냅 기능으로 “어두운 중심”을 선택 합니다. 이 옵션에는 자동 검색을 검색 평방 (“스냅 범위”) 커서 주위에서 어두운 개체 (즉, 개인 또는 한 쌍)의 중심을 수 있습니다. 광장 전체 쌍 또는 동물 영화 (예: 31 x 31 픽셀)의 크기를 선택 합니다. 선택한 옵션을 적용 하려면 “확인”을 클릭 합니다. 2 차원 추적을 수행 합니다. 추적을 시작 하려면 MTrackJ 대화 창에서 “추가” 버튼을 클릭 합니다. 한 쌍 또는 개인을 추적을 커서 (감지 광장)를 배치 합니다. 어두운 중심 광장 내에서 개체의 검색을 클릭 합니다. 원하는 프레임 수에 대 한 단계 4.6.2를 반복 합니다. 데이터 테이블을 생성 하기 위해 MTrackJ 대화 창에서 “측정” 버튼을 클릭 합니다. 데이터는 두 개의 창에 표시 됩니다: “MTrackJ:: 트랙” 창 추적된 2 차원 궤적의 요약을 표시 하 고 각 시간 지점에 대 한 자세한 데이터를 표시 하는 “MTrackJ:: 포인트”. 각 테이블을 저장 하려면 파일을 선택 > ImageJ 메뉴 다른 이름으로 저장.참고: 각 데이터 열에 대 한 개발자 (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/)에서 제공 하는 온라인 설명서를 참조 하십시오. 영화 색된 선으로 그려진 추적 궤적을 생성 하기 위해 MTrackJ 대화 창에서 “영화” 버튼을 클릭 합니다. 생성 된 동영상을 저장 하려면 파일 > ImageJ 메뉴 다른 이름으로 저장. 전체 결과 저장 합니다. (단계 4.6.4) 데이터 및 추적 된 2 차원 궤적 (4.6.2 단계와 단계 4.6.3)를 포함 하 여 결과 저장 하려면 MTrackJ 대화 창에서 “저장” 버튼을 클릭 합니다.