Tigriopus桡足的个体培养及其交配行为的定量分析

1. 为行为观察准备的原始动物 获得受精卵, 让他们孵化。 收集妊娠女性携带透明橙 (即受精和在发展的先进阶段) 鸡蛋 (图 3C) 从股票文化与巴斯德吸管。在清洁培养基中轻轻吹打, 以避免其他动物的转移, 包括可能在文化中孵化的 nauplial 幼虫, 以此冲洗雌性。注: 在本协议中, 以盐度为35% 的人工海水作为培养基。根据实验的目的, 使用不同的介质 (如具有较高盐度或附加溶质的人工海水)。注: 见巴雷托et . 201512为建立实验室文化储备和californicus的方法 2016 13为自然人口的汇集站点的例子。彼得森等人还报告了他们的收集地点californicus, fulvus, 和日本的纬度和经度信息9。使用具有约30-50 毫升的塑料吸管从岩石池收集Tigriopus桡足。 将每个雌性单独放置在一个6井细胞培养板的井中, 用干净的培养基 (图 4, 左)。确保没有其他动物 (包括 nauplial 幼虫) 污染油井。 保持在20摄氏度的孵化器设置的板块, 12 小时的光黑暗周期, 以培养雌性, 直到他们释放卵囊。这一步骤通常需要十天, 取决于胚胎的种类和发育阶段。同时, 每个妊娠女性每周两次, 两粒细磨 (约 < 0.5 毫米直径) 鱼食品 (见资料表详细)。注: 根据实验的目的使用不同的温度和光循环。更高的温度可以促进胚胎的快速发育。注意: 避免过量的食物在水井中腐烂。如果食物碎片开始腐烂, 用巴斯德吸管将其从水井中取出。 卵囊释放后, 用巴斯德吸管将雌性从培养井中取出。注: 受精雌性能产卵2,3后代的多个离合器。如果需要, 将雌性转移到其他井中以收集进一步的离合器。 收集 copepodids 的个人文化。 保持板块与孵化幼体在孵化器和文化的幼体, 直到他们发展到第一 copepodid (CI) 阶段 (图 4, 中间)。这一步通常需要一到两个星期。每两天搜索 CI 动物一次, 用几粒细磨鱼的食物喂饱每个井。再用蒸馏水蒸发水。注: 如果漂浮的碎片阻碍了视线, 用一小块纸巾略读。 一旦 CI 动物开始出现, 收集他们从水井与 P-10 微其吹打卷设置约8µL, 在显微镜10X 到40X 放大 (图 4, 右)。在清洁人工海水中轻轻吹打, 将其洗净, 并将其放入24井细胞培养板中, 含2-3 毫米深度 (约400-600 µL) 人工海水。注意: 避免将 nauplial 蜕皮或其他动物带入水井中, 用于个体文化。 通过计数蜕皮蜕皮来跟踪个人的发展。 蜕皮蜕皮每三天 (如果需要调整频率) 在每个井内部检查, stereomicroscopic 在暗场照明下, 10X 到40X 放大。蜕皮的 copepodids 是透明的和可辨认的毛腿, 一对尾拉米 (即,在尾端薄凸出结构) 和/或分割 prosome 和 urosome (图 5)。更改焦点和光照以检测井中不同深度的蜕皮 (图 6A)。注意: 蜕皮蜕皮比蜕皮它们的动物小。开始检查从更低的放大倍数为动物和它相对地最近蜕皮并且转移到更高的放大率为更旧的 (即,更小的) 蜕皮。注: 如果井中蜕皮损坏, 从进一步的发展跟踪中消除井, 避免发育阶段的误判。注: 如果漂浮的碎片阻碍了视图 (图 6B), 用一小块纸巾略读。 在每个井中记录 copepodid 蜕皮的总数量, 并在板盖上加上一个计数标记 (图 7)。在井中找到新的蜕皮, 将线条添加到标记中。注: 如果有 nauplial 蜕皮污染的井, 消除他们从计数。 用两粒细磨的鱼粮喂养每一个人。再用蒸馏水将水蒸发, 以维持盐度。注: 饲料 copepodids 每三天, 以防止他们消费和损害蜕皮蜕皮, 这可能会影响发展阶段的估计 (步骤 1.3.4)。 根据蜕皮的数量估计动物的发育阶段。如果没有蜕皮, 个人估计是在 CI 阶段。如果有一个到四蜕皮, 个人估计是在 CII 到 CV 阶段。如果有五蜕皮, 个人估计是成人。 根据形态学识别成人性别。 性动物通过检查他们的形态学。成人Tigriopus男性拥有膝上的第一触角与钩状和球状结构在远端 (图 3A)。成年女性的第一触角比雄性更平滑, 相对较薄 (图 3B)。一些女性也表现出深绿色的性腺脂在他们的身体 (图 3B, 3D)。 在井盖上标明性别 (图 7B)。 2. 护身行为的行为测试和录像记录 在测试日, 选择需要阶段和性别的动物进行行为测试。 用精致的地面鱼食品喂饱养殖井中选定的个体, 让他们吃30分钟。同时, 进行步骤2.1.2 准备测试室。 准备两个48井平底细胞培养板作为试验室;一个盘子 (以下称 “板材 A”) 是为男性和另一个 (“板材 B”) 是为目标 (例如copepodids, 成年女性, 成年男性)。添加400µL 的清洁人工海水, 盐度为35% 的板材井。将盘子放在一个 LED 灯垫上, 盖上半透明的丙烯酸板作为光扩散器 (图 8)。注: 根据实验目的使用不同的介质。注: 为避免过热, 请勿使用白炽灯或荧光灯作背光。 在2.1.1 中描述的30分钟喂养时间后, 将每只动物轻轻地吹打成连续的24井板, 装满了干净的人工海水 (图 9), 以防止从养殖井中搬运碎片和蜕皮。 把冲洗过的人放在盘子 A 和 B 的井里, 放在 LED 灯垫上。允许30分钟调整动物的水井。 在调整期间, 在 a 板上设置一个摄像机 (图 8)。用三脚架或支架来握住相机。 将相机对准平板 A 内的雄性, 以便观察触角。注意: 为了减少电影中背光的闪烁, 请设置一个相当于或一半的电子频率的帧速率, 并使用较长的曝光时间。此外, 保持 LED 灯垫覆盖一个半透明的丙烯酸板, 如步骤2.1.2 所述。 在步骤2.1.4 中描述的调整周期后, 开始视频录制和行为测试。 将目标从板块 B 转移到板块 a 与巴斯德吸管。如果实验对介质中的化学成分敏感, 则对每一个测试对进行更改吸管。注: 当吹打的动物从 B 板块, 不要追逐它在水中与巴斯德吸管, 水干扰可以刺激动物和引发其过剩的运动。将吸管的尖端稍放在水面上方, 等待个人进入尖端。用少量人工海水轻轻地将其吸干, 然后将其喷射到 a 板上的井中。 根据一项实验计划, 允许男性和目标在每个井中相互作用, 达到预期的观察时间 (例如10 分钟) 转移后。 在观察时间结束后停止视频录制。如有必要, 将录制的电影从照相机下载到计算机。 3. 行为特性的人工分析 检查影片的时间, 当每个目标被转移到 A 板块井。 检查感兴趣事件的启动和终止时间, 并计算事件的持续时间、滞后时间和频率。 定义启动的保护尝试由男性作为一个接触的男性的天线与任何身体部分的目标 (图 10, 左上)。触角的接触通常在前面有一个 swift (< 0.5 s) 追逐或突袭。 当两个雄性的触角从目标体中分离出来时, 将守护尝试的终止定义为一个点 (图 10, 右上角)。计算守卫尝试的频率, 如: 定义交配的开始, 由一个男性的背部身体弯曲, 后面是一个 urosome 的重复按下的女性 (图 10, 右下)。推的频率每秒数次。注意: 在交配前, 一个守卫的雄性爬行到雌性身体的尾端 (图 10, 左下)。 在3.2.4 中描述的事件后, 定义 urosomes 的终止交配。注意: 在californicus和日本的情况下, 交配通常发生数分钟。 4. 对个人和对的二维跟踪 通过修剪在步骤2中录制的影片, 并使用电影编辑软件, 生成一个带有兴趣集 (例如, 前3秒的守护尝试) 的视频剪辑。 安装 ImageJ14从: https://imagej.nih.gov/ij/download.html。然后下载 MTrackJ, 一个运动跟踪插件为 ImageJ15, 通过以下说明: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/。 打开 ImageJ 并导入感兴趣的电影 (例如,文件 > 导入 > 使用 QuickTime; 选择 “转换8位灰度” 以减少图像处理所需的内存)。 执行空间和时间校准。 在 ImageJ 窗口中选择直线选择工具以进行空间校准。 在影片窗口中, 沿已知长度 (如井径) 的对象绘制选区线。 打开 “设置比例” 菜单 (分析 > 设置比例)。在 “长度单位” 框中输入 “已知距离” 框及其单位 (例如mm) 中已知的长度。单击 “全局” 复选框可使用其他视频剪辑的刻度。 打开 “属性” 菜单 (图像 > 属性) 进行时间校准。在 “帧间隔” 框中输入帧间隔 (帧速率的倒数)。 使用 MTrackJ 配置跟踪。 在 ImageJ 上打开插件 > MTrackJ 的 MTrackJ 插件。单击 “MTrackJ” 对话框窗口中的 “跟踪” 按钮, 打开 “跟踪配置” 菜单。 通过检查 “添加点后移到下一次索引”, 然后在 “配置” 对话框窗口中输入 “时间步长” 方框中的数字, 设置跟踪间隔。要执行帧间跟踪, 请在 “时间步长” 框中输入 “1”。 选中 “在跟踪过程中应用本地游标捕捉”, 然后选择 “暗质心” 作为快照功能。此选项允许在游标周围的检测方块 (“捕捉范围”) 内自动检测暗物体 (即单个或一对) 的质心。选择正方形的大小以覆盖影片中的整对或动物 (例如31 x 31 像素)。 单击 “确定” 以应用所选选项。 执行二维跟踪。 单击 “MTrackJ” 对话框窗口中的 “添加” 按钮开始跟踪。 放置游标 (检测方) 以覆盖一对或要跟踪的个人。单击以检测正方形内对象的暗质心。 对所需的帧数重复步骤4.6.2。 要生成数据表, 请在 “MTrackJ” 对话框窗口中单击 “度量” 按钮。数据显示在两个窗口中: “MTrackJ: 曲目” 窗口显示跟踪的二维轨迹的摘要和 “MTrackJ: 点” 显示每个时间点的详细数据。要保存每个表, 请在 ImageJ 上选择 “文件” > “另存为…” 菜单。注: 请参阅开发人员 (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) 提供的联机手册, 以说明每个数据列的描述。 要生成以彩色线条绘制的跟踪轨迹的影片, 请单击 “MTrackJ” 对话框窗口中的 “影片” 按钮。要保存生成的影片, 请在 ImageJ 上选择 “文件” > “另存为…” 菜单。 保存整个结果。单击 “MTrackJ” 对话框窗口中的 “保存” 按钮以保存结果, 包括数据 (步骤 4.6.4) 和跟踪的二维轨迹 (步骤4.6.2 和 4.6.3)。