Summary

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

Published: November 21, 2018
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.

Abstract

רוב קוטלי חרקים זמין כעת המטרה על מערכת העצבים, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית הגעה תשואות לעיתים קרובות תוצאות מזיקות, אך השיטות להקלטת פעילות מערכת העצבים של הפרט חיה הוא יקר, מייגעת. שאיבה זו אלקטרודה הכנת השלישי-לחלל זחל מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה melanogaster, היא מערכת צייתן בוחן את ההשפעות הפיזיולוגיות של סוכנים neuroactive, הקובע את התפקיד פיזיולוגיות שונות עצבית מסלולים פעילות מערכת העצבים המרכזית, כמו גם את ההשפעה של מוטציות גנטיות לתפקוד העצבי. הכנת ex-vivo דורשת בינוני רק לנתח מיומנות ומומחיות אלקטרופיזיולוגיות ליצירת הקלטות לשחזור של חרקים פעילות. עצבית. מגוון רחב של מאפננים כימי, כולל פפטידים, ואז ניתן להחיל ישירות למערכת העצבים בתמיסה עם תמיסת מלח פיזיולוגית למדוד את ההשפעה על פעילות מערכת העצבים המרכזית. ניתן ליישם טכנולוגיות נוספות, גנטי, כגון מערכת GAL4/UAS, בנפרד או במשולב עם סוכנים תרופתי כדי לקבוע את התפקיד של תעלות יונים וברצפטורים ספציפיים, שנאים או קולטני arthropod תפקוד מערכת העצבים המרכזית. בהקשר זה, מבחני המתוארים במסמך זה הם עניין משמעותי toxicologists בקוטלי חרקים, חרקים פיזיולוגים של ביולוגים התפתחותיים אשר melanogaster ד הינו אורגניזם מודל הוקמה. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את שיטת אלקטרופיזיולוגיות כדי לאפשר את המדידה של electrogenesis של מערכת העצבים המרכזית בדגם החרק, דרוזופילה melanogaster, אשר הוא שימושי לבדיקת מגוון של מדעי השערות.

Introduction

המטרה הכוללת של גישה זו היא לאפשר לחוקרים למדוד במהירות את electrogenesis של מערכת העצבים המרכזית (CNS) בדגם החרק, melanogaster דרוזופילה. בשיטה זו הוא אמין, מהיר ו וחסכוניים כדי לבצע ניסויים פיזיולוגיים, רעילות. מערכת העצבים היא חיוני עבור החיים ולכן, המסלולים פיזיולוגיים קריטי לתפקוד תקין עצבית נחקרו בהרחבה במאמץ להבין או לשנות פונקציות עצביות. אפיון איתות המסלולים בתוך מערכת העצבים arthropod אפשרה הגילוי בכמה דרגות כימיים קוטלי חרקים זה לשבש את תפקוד עצבי הגעה כדי לגרום לתמותה תוך הגבלת חופש-יעד השלכות. לכן, היכולת למדוד את הפעילות העצבית של חרקים הוא עניין משמעותי בתחום של הרעלים חרקים ופיזיולוגיה מאז מערכת העצבים הוא רקמת המטרה של רוב קוטלי חרקים פרוס1. ובכל זאת, המשיך צמיחת הידע בסיסי ויישומי בנושא מערכת העצבים חרקים דורשת טכניקות מתקדמות neurophysiological מוגבלות כדאיות, מאז הנוכחי הם עבודה אינטנסיבית וטכניקות דורשים עם הוצאות גבוהות, חרק שורות תאים עצביים מוגבלות, ו/או גישה מוגבלת הסינפסות המרכזי של רוב פרוקי רגליים. כיום, ואפיון של חלבונים עצבית חרקים ברוב דורש את המטרה להיות גילוי משובטים, heterologously ביטוי עבור תרופות עוקבות והקלטות אלקטרופיזיולוגיות, כפי שתואר עבור יישור פנימה חרקים אשלגן ערוצי2 , ryanodine חרקים קולטן3, יתוש מתח רגיש K+ ערוצים4ואחרים. כדי להמתיק את הדרישה לביטוי heterologous ואת הפוטנציאל ביטוי תפקודית נמוכה, Bloomquist ועמיתיו שמטרתה לגרום הפנוטיפ עצביים ב תרבותי זחל כנימה frugiperda (Sf21) תאים כשיטה חדשניים עבור קוטל חרקים גילוי5,6. שיטות אלה מספקים גישה חוקית של התפתחות הכימיה החדשה, ובכל זאת הם לעתים קרובות יוצרים של צוואר בקבוק בלתי עביר עבור אפיון סוכנים תרופתי, זיהוי מנגנוני עמידות חרקים, ואפיון עקרונות פיזיולוגיים בסיסיים. כאן, אנו מתארים שמחוץ שיטה המאפשרת ההקלטה של הפעילות החשמלית של חרק דגם בעל גנטיקה חמרן-7,8,9 ודפוסי הביטוי הידוע של עצבי מתחמי10,11,12 כדי לאפשר אפיון מנגנוני ההתנגדות ברמה של העצב, את מצב הפעולה של תרופות פיתח, מחקרים רעילות אחרים.

זבוב הפירות, ד melanogaster, היא אורגניזם מודל משותפת עבור הגדרת חרקים מערכות עצביות או חרקים מנגנון הפעולה, הקימה כאורגניזם מודל מותאם היטב עבור חקר רעילות13, פרמקולוגית14 ,15, neurophysiological16ותהליכים הקשורים pathophysiological17,18,19,20 של חולייתנים. D.melanogaster הוא חרק holometabolous שמבצע הגלגול השלם, לרבות שלב הזחל, הגולמי לפני שהגיע השלב למבוגרים הרבייה. לאורך כל התהליך ההתפתחותי, מערכת העצבים עובר שיפוץ משמעותי בשלבי חיים שונים, אבל מערכת העצבים זחל תהיה המוקד של מתודולוגיה זו. מערכת העצבים זחל מפותחת פשוטה מבחינה אנטומית עם חלקי בית החזה והבטן הם התמזגו ויוצרים גנגליון הגחון, אשר מייצג את מערך של neuromeric חוזרות ונשנות, כמעט זהה יחידות21,22. העצבים המוטוריים יורד שמקורם בסוף הגרעינים subesophageal סימטרית, לרדת innervate שרירי קיר הגוף ואיברים הקרביים של הזחלים. איור 1 מתאר את האנטומיה של הזחל דרוזופילה CNS.

דרוזופילה מחסום הדם – מוח (BBB) מפתחת בסוף מופרה, נוצר על ידי תאי גליה (SPG) subperineurial21. התאים SPG בצורת רבים כמו filopodia שתהליכים התפרסו להקים רציפים, שטוח מאוד אנדותל דמוי גיליון מכסה את כולו דרוזופילה CNS23. דרוזופילה BBB יש דמיון BBB חוליות, כולל שמירה על הומאוסטזיס של microenvironment עצבית על ידי שליטה על כניסת חומרים מזינים, ואינטראקציות לתוך ה CNS21. זהו תנאי הכרחי אמין התמסורת העצבית ותפקוד, ההגנה על מערכת העצבים על ידי BBB מגבילה את הסתננות של תרופות סינתטיות, פפטידים רוב אחרים ואינטראקציות24,25, אשר מציג את הפוטנציאל בעיות בעת אפיון הלוחמים של מולקולה קטנה מאפננים. השיטה משתמשת של חיתוך פשוט לשבש את מחסום זה ולספק גישה פרמקולוגית מוכן הסינפסות המרכזית.
הכוח הגדול ביותר של המתודולוגיה המתוארת היא פשטות, הפארמצבטית, וקיבולת תפוקה גבוהה יחסית הטמון במערכת זו. הפרוטוקול הוא יחסית קלה, ההגדרה דורש שטח קטן, רק קלט פיננסי ראשוני הוא הכרחי אשר תקטן ריאקטיבים וחומרים מתכלים. עוד יותר, השיטה המתוארת היא לחלוטין amendable להקליט את פעילות העצבים יורד המרכזי של הזבוב הבית, זבוב דומסטיקה26.

Protocol

1. ציוד וחומרים הכינו את הרכיבים הנדרשים (המופיעים בטבלה של חומרים) של המתקן אלקטרופיזיולוגיה לביצוע הקלטות אלקטרודה היניקה של דרוזופילה CNS.הערה: לפני ניסויים, זה הכרחי כדי לבנות חדרי ניתוח דרוזופילה CNS וכדי לשמש לרחצה את הגרעינים בתוך תמיסת מלח במהלך הקלטות. קו מ?…

Representative Results

פעילות ספונטנית של העצבים ההיקפיים יורד הנובעים ממערכת העצבים המרכזית דרוזופילה ניתן לצרוב בעזרת אלקטרודות היניקה חוץ-תאית הפארמצבטית עקבית. פעילות ספונטנית נכרת, transected דרוזופילה CNS מייצר תבנית מחזורית השפרצה עם s 1-2 של ירי עם 1 s של יד פעילות השבתה הדרגתית. לדוג…

Discussion

הפרטים באתר וידאו משויך, טקסט סיפקו השלבים החשובים על מנת להקליט את פעילותן ואת ספייק פריקה תדר של דרוזופילה CNS ex-vivo. יעילות ניתוח הוא ההיבט הקריטי ביותר של השיטה כי קצר או מספר הנוירונים יורד תפחית את הבסיס ירי שתמורתו יביא סטיות גדולות בין משכפל. אולם, ברגע הטכניקה לנתיחה שולט, ה?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות גב’ Rui חן דיסקציה של תמונות של דרוזופילה CNS שמוצג הדמויות.

Materials

Drosophila melanogaster (strain OR) Bloomington Drosophila Stock Center 2376
Vibration isolation table Kinetic Systems 9200 series
Faraday Cage Kinetic Systems N/A
Dissecting Microscope on a Boom Nikon SMZ800N Multiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifier ADInstruments AM3000H The model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitor ADInstruments AM3300
Hum Bug Noise Eliminator A-M Systems 726300
Data Acquisition System (PowerLab) ADInstruments PL3504 Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro Software ADInstruments N/A – Online Download
Fiber Optic Lights Edmund Optics 89-740 Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
Micromanipulator World Precision Instruments M325
Microelectrode Holder World Precision Instruments MEH715 Different models are acceptable
BNC cables World Precision Instruments multiple based on size
Glass Capillaries World Precision Instruments PG52151-4
Microelectrode Puller Sutter Instruments P-1000 Also can use Narashige PC-100
Black Wax Carolina Biological Supply 974228
Non-coated insect pins, size #2 Bioquip 1208S2
Fince Forceps Fine Science Tools 11254-20
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03

Referenzen

  1. Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
  2. Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954 (2016).
  3. Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680 (2015).
  4. Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, 71-81 (2014).
  5. Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).
  6. Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
  7. Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).
  8. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  9. St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
  10. Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).
  11. Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).
  12. Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).
  13. Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).
  14. Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).
  15. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
  16. Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).
  17. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).
  18. Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).
  19. Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).
  20. Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).
  21. Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
  22. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).
  23. Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
  24. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).
  26. Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).
  27. Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).
  28. Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).
  29. Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).
  30. Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).
  31. Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).
  32. Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8 (1), 2 (2016).
  33. Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).
  34. Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47 (2009).
check_url/de/58375?article_type=t

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Swale, D. R., Gross, A. D., Coquerel, Q. R. R., Bloomquist, J. R. Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster . J. Vis. Exp. (141), e58375, doi:10.3791/58375 (2018).

View Video