פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.
רוב קוטלי חרקים זמין כעת המטרה על מערכת העצבים, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית הגעה תשואות לעיתים קרובות תוצאות מזיקות, אך השיטות להקלטת פעילות מערכת העצבים של הפרט חיה הוא יקר, מייגעת. שאיבה זו אלקטרודה הכנת השלישי-לחלל זחל מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה melanogaster, היא מערכת צייתן בוחן את ההשפעות הפיזיולוגיות של סוכנים neuroactive, הקובע את התפקיד פיזיולוגיות שונות עצבית מסלולים פעילות מערכת העצבים המרכזית, כמו גם את ההשפעה של מוטציות גנטיות לתפקוד העצבי. הכנת ex-vivo דורשת בינוני רק לנתח מיומנות ומומחיות אלקטרופיזיולוגיות ליצירת הקלטות לשחזור של חרקים פעילות. עצבית. מגוון רחב של מאפננים כימי, כולל פפטידים, ואז ניתן להחיל ישירות למערכת העצבים בתמיסה עם תמיסת מלח פיזיולוגית למדוד את ההשפעה על פעילות מערכת העצבים המרכזית. ניתן ליישם טכנולוגיות נוספות, גנטי, כגון מערכת GAL4/UAS, בנפרד או במשולב עם סוכנים תרופתי כדי לקבוע את התפקיד של תעלות יונים וברצפטורים ספציפיים, שנאים או קולטני arthropod תפקוד מערכת העצבים המרכזית. בהקשר זה, מבחני המתוארים במסמך זה הם עניין משמעותי toxicologists בקוטלי חרקים, חרקים פיזיולוגים של ביולוגים התפתחותיים אשר melanogaster ד הינו אורגניזם מודל הוקמה. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את שיטת אלקטרופיזיולוגיות כדי לאפשר את המדידה של electrogenesis של מערכת העצבים המרכזית בדגם החרק, דרוזופילה melanogaster, אשר הוא שימושי לבדיקת מגוון של מדעי השערות.
המטרה הכוללת של גישה זו היא לאפשר לחוקרים למדוד במהירות את electrogenesis של מערכת העצבים המרכזית (CNS) בדגם החרק, melanogaster דרוזופילה. בשיטה זו הוא אמין, מהיר ו וחסכוניים כדי לבצע ניסויים פיזיולוגיים, רעילות. מערכת העצבים היא חיוני עבור החיים ולכן, המסלולים פיזיולוגיים קריטי לתפקוד תקין עצבית נחקרו בהרחבה במאמץ להבין או לשנות פונקציות עצביות. אפיון איתות המסלולים בתוך מערכת העצבים arthropod אפשרה הגילוי בכמה דרגות כימיים קוטלי חרקים זה לשבש את תפקוד עצבי הגעה כדי לגרום לתמותה תוך הגבלת חופש-יעד השלכות. לכן, היכולת למדוד את הפעילות העצבית של חרקים הוא עניין משמעותי בתחום של הרעלים חרקים ופיזיולוגיה מאז מערכת העצבים הוא רקמת המטרה של רוב קוטלי חרקים פרוס1. ובכל זאת, המשיך צמיחת הידע בסיסי ויישומי בנושא מערכת העצבים חרקים דורשת טכניקות מתקדמות neurophysiological מוגבלות כדאיות, מאז הנוכחי הם עבודה אינטנסיבית וטכניקות דורשים עם הוצאות גבוהות, חרק שורות תאים עצביים מוגבלות, ו/או גישה מוגבלת הסינפסות המרכזי של רוב פרוקי רגליים. כיום, ואפיון של חלבונים עצבית חרקים ברוב דורש את המטרה להיות גילוי משובטים, heterologously ביטוי עבור תרופות עוקבות והקלטות אלקטרופיזיולוגיות, כפי שתואר עבור יישור פנימה חרקים אשלגן ערוצי2 , ryanodine חרקים קולטן3, יתוש מתח רגיש K+ ערוצים4ואחרים. כדי להמתיק את הדרישה לביטוי heterologous ואת הפוטנציאל ביטוי תפקודית נמוכה, Bloomquist ועמיתיו שמטרתה לגרום הפנוטיפ עצביים ב תרבותי זחל כנימה frugiperda (Sf21) תאים כשיטה חדשניים עבור קוטל חרקים גילוי5,6. שיטות אלה מספקים גישה חוקית של התפתחות הכימיה החדשה, ובכל זאת הם לעתים קרובות יוצרים של צוואר בקבוק בלתי עביר עבור אפיון סוכנים תרופתי, זיהוי מנגנוני עמידות חרקים, ואפיון עקרונות פיזיולוגיים בסיסיים. כאן, אנו מתארים שמחוץ שיטה המאפשרת ההקלטה של הפעילות החשמלית של חרק דגם בעל גנטיקה חמרן-7,–8,–9 ודפוסי הביטוי הידוע של עצבי מתחמי10,11,12 כדי לאפשר אפיון מנגנוני ההתנגדות ברמה של העצב, את מצב הפעולה של תרופות פיתח, מחקרים רעילות אחרים.
זבוב הפירות, ד melanogaster, היא אורגניזם מודל משותפת עבור הגדרת חרקים מערכות עצביות או חרקים מנגנון הפעולה, הקימה כאורגניזם מודל מותאם היטב עבור חקר רעילות13, פרמקולוגית14 ,15, neurophysiological16ותהליכים הקשורים pathophysiological17,18,19,20 של חולייתנים. D.melanogaster הוא חרק holometabolous שמבצע הגלגול השלם, לרבות שלב הזחל, הגולמי לפני שהגיע השלב למבוגרים הרבייה. לאורך כל התהליך ההתפתחותי, מערכת העצבים עובר שיפוץ משמעותי בשלבי חיים שונים, אבל מערכת העצבים זחל תהיה המוקד של מתודולוגיה זו. מערכת העצבים זחל מפותחת פשוטה מבחינה אנטומית עם חלקי בית החזה והבטן הם התמזגו ויוצרים גנגליון הגחון, אשר מייצג את מערך של neuromeric חוזרות ונשנות, כמעט זהה יחידות21,22. העצבים המוטוריים יורד שמקורם בסוף הגרעינים subesophageal סימטרית, לרדת innervate שרירי קיר הגוף ואיברים הקרביים של הזחלים. איור 1 מתאר את האנטומיה של הזחל דרוזופילה CNS.
דרוזופילה מחסום הדם – מוח (BBB) מפתחת בסוף מופרה, נוצר על ידי תאי גליה (SPG) subperineurial21. התאים SPG בצורת רבים כמו filopodia שתהליכים התפרסו להקים רציפים, שטוח מאוד אנדותל דמוי גיליון מכסה את כולו דרוזופילה CNS23. דרוזופילה BBB יש דמיון BBB חוליות, כולל שמירה על הומאוסטזיס של microenvironment עצבית על ידי שליטה על כניסת חומרים מזינים, ואינטראקציות לתוך ה CNS21. זהו תנאי הכרחי אמין התמסורת העצבית ותפקוד, ההגנה על מערכת העצבים על ידי BBB מגבילה את הסתננות של תרופות סינתטיות, פפטידים רוב אחרים ואינטראקציות24,25, אשר מציג את הפוטנציאל בעיות בעת אפיון הלוחמים של מולקולה קטנה מאפננים. השיטה משתמשת של חיתוך פשוט לשבש את מחסום זה ולספק גישה פרמקולוגית מוכן הסינפסות המרכזית.
הכוח הגדול ביותר של המתודולוגיה המתוארת היא פשטות, הפארמצבטית, וקיבולת תפוקה גבוהה יחסית הטמון במערכת זו. הפרוטוקול הוא יחסית קלה, ההגדרה דורש שטח קטן, רק קלט פיננסי ראשוני הוא הכרחי אשר תקטן ריאקטיבים וחומרים מתכלים. עוד יותר, השיטה המתוארת היא לחלוטין amendable להקליט את פעילות העצבים יורד המרכזי של הזבוב הבית, זבוב דומסטיקה26.
הפרטים באתר וידאו משויך, טקסט סיפקו השלבים החשובים על מנת להקליט את פעילותן ואת ספייק פריקה תדר של דרוזופילה CNS ex-vivo. יעילות ניתוח הוא ההיבט הקריטי ביותר של השיטה כי קצר או מספר הנוירונים יורד תפחית את הבסיס ירי שתמורתו יביא סטיות גדולות בין משכפל. אולם, ברגע הטכניקה לנתיחה שולט, ה?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות גב’ Rui חן דיסקציה של תמונות של דרוזופילה CNS שמוצג הדמויות.
Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A – Online Download | |
Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |