Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü
Summary
Burada biz verimliliği Fluorometrik ve görüntüleme analizleri canlı hücreler aracılığıyla yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer yüksek üretilen iş floresans tabanlı bir tahlil tanımlamak. Bu tahlil uyuşturucu ya da plazma zarı memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden düzenleyen hedef genlerin eleme için kullanılabilir.
Abstract
Fizyolojik çalışma ortamlarında memeli hücreleri kez plazma zarı zarar görmesine neden mekanik ve biyokimyasal gerilmeler tabi. Bu zarardan karşılık olarak, karmaşık moleküler makineleri hızla bariyer fonksiyonu geri yüklemek ve hücre yaşam sürdürmek için plazma zarı yeniden mühürleyin. Bu alanda araştırma, 60 yaşında olmasına rağmen hala makine yeniden mühürlemeden hücre kapsamlı bir anlayış eksikliği. Hücresel bileşenleri belirlenmesi amacı ile bu denetim plazma zarı yeniden mühürleme veya yeniden mühürleme, artırabilir uyuşturucu biz verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer floresans tabanlı yüksek üretilen iş tahlil geliştirdik Mikroplaka içinde kültürlü. Plazma zarı zarar için bir model sistem olarak bakteriyel gözenek oluşturan toksin listeriolysin O (LLO), büyük 30-50 nm çapında proteinaceous gözenekleri kolesterol içeren formlar hücreleri maruz membranlar. Isı kontrollü çok modlu Mikroplaka Okuyucu kullanımı hızlı ve hassas spectrofluorometric ölçümleri, aydınlık alan ve floresan mikroskopi görüntüleme yaşayan hücrelerin birlikte sağlar. Bir membran impermeant nükleik asit bağlama fluorochrome tarafından yayılan floresan yoğunluğu kinetik Analizi yaralama ve verimliliği yeniden mühürlemeden hücre hesaplama için izin hücre nüfus düzeyinde yeniden mühürlemeden membran kapsamını yansıtır . Yapısal nükleer protein histon 2B, mikroplaka hesap numarasına olası değişimler için her şey bir floresan chimera hızlı ve için nihai sağlayan hücreleri numaralandırma için floresans mikroskobu görüntüleme sağlar farklı hücre popülasyonlarının tanımlaması. Bu yüksek üretilen iş tahlil ana bilgisayar genler için tarama yoluyla membran tamir mekanizmaları anlayışımızı genişletmek için beklenen veya exogenously eklendi güçlü bir araç bu denetim plazma zarı yeniden mühürleme bileşikleri olduğunu.
Introduction
Memeli hücre mekanik, ozmotik ve biyokimyasal stres plazma membran bütünlüğü kaybı sonuçlanan, tabidir. Hızlı ve verimli yeniden mühürlemeden olmadan, hasarlı hücreleri hızlı bir şekilde programlanmış veya nekrotik ölüme yenik. 1960’lardan beri çabaları işlem yeniden mühürlemeden plazma zarı anlamak için onun işlev bozuklukları ile ilişkili yıkıcı sonuçları tarafından motive edilmiş. Nitekim, bacak-korse kas distrofisi, diyabet ve Chediak-Higashi sendromu gibi hastalıkların mutasyonlar gen kodlama dysferlin, gelişmiş glikasyondan son ürünleri imalatı ve kusurları nedeniyle eksik plazma zarı onarım için bağlantılı olmuştur lizozomal ticareti düzenleyici CHS1, sırasıyla1,2,3,4,5,6. Ancak, bugüne kadar membran anlayışımızı yeniden mühürlemeden hala sınırlı7var. İlk çalışmalar membran yeniden mühürlemeden ekstraselüler Ca2 + ile hasarlı plazma zarı8,9,10akını tarafından başlatılır gösterdi. O zamandan beri birkaç ayrı ayrı Ca2 +-hücreleri yeniden mühürlemek için önerilen bağımlı mekanizmaları. Yama hipotez yara yakınlık içinde birbirleriyle ve bir yama11,12,13,14davranmaya hasarlı plazma zarı ile hücre içi veziküller sigorta öneriyor. İkinci bir model o kalsiyum-bağımlı ekzositozu öneriyor organellerin yara adlı bir site sphingomyelin plazma zarı dış kitapcıktaki ceramide dönüştürür lizozomal enzim asit sphingomyelinase bültenleri. Bu ani değişiklik lipid bileşiminde hasarlı bölge15,16,17endositoz ceramide tahrik sonuçlanır. Son olarak, üçüncü önerilen mekanizma endosomal kapalı18plazma zarı bud dışa dönük vezikül oluşumu tanıtmak taşıma (ESCRT) için gerekli karmaşık sıralama için bir rol içerir. Proteinler, sadece sınırlı sayıda bu modelleri tespit edildi ve onların makine daha fazla aydınlatılmamıştır gerekir.
Burada biz verimliliği yapisan memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden plazma zarı zarar tabi önlemler rekombinant listeriolysin O (LLO)19aracılı bir yüksek-den geçerek tahlil tanımlamak. LLO fakültatif intraselüler patojen Listeria Monositogenez20,21,22 tarafından salgılanan gözenek oluşturan bir toksin (SFT) ve MACPF/CDC aittir (membran atak kompleksi, perforin, ve kolesterol bağımlı cytolysin) süper. MACPF çoğu memeli gözenek oluşturan proteinleri ise KGK özellikle bakteriyel toksinler bağışıklık savunma dahil kendi patojenik yaşam23tanıtmak için ana bilgisayar hücrelerine de zarar gram-pozitif patojenler tarafından üretilen. KGK suda çözünen monomer sentez veya kolesterol için bağlama dimer plazma zarı sunmak ve en fazla 50 alt birimleri prepore bir kompleks oligomerize. Karmaşık prepore sonra 30-50 nm çapı24,25,26,27‘ deki yayılan bir β-varil gözenek oluşturan lipid bilayer genelinde β-iplikçikleri eklemek için yeniden düzenler. Bu iri gözenekli hücre içinde ve dışında Cerayanlar iyonları ve küçük hücresel bileşenleri izin; Yine de, bazı çalışmalar daha küçük boyutları gözeneklerin de kurulan28,29,30olduğunu önerdi. KGK arasında LLO yüksek üretilen iş analizleri31,32için elverişli geri dönüşü olmayan pH ve sıcaklık bağımlı toplama dahil benzersiz özelliklerini görüntüler. LLO 4 ˚C, onun bağlayıcı hücreleri, ancak karmaşık gözenek oluşumu için izin veren bir sıcaklık hücre kültür orta eklenebilir. Gözenek oluşumu inisiyasyon sonra toksin moleküllerin membran için formu reaksiyonlar, düzlemde verimli difüzyon ve konformasyon remodeling gözenek üretimi dahil izin 37 ˚C sıcaklığa yükselterek eşitlenebilir. Bu nedenle, sıcaklık, hücre hasarı kinetik anahtarı izleyen plazma zarı bağlı toksin miktarına bağlıdır. Önemlisi, çözünür LLO (plazma zarı bağlı değildir) sıcaklık ilişkisiz toksin molekülleri silsin gereğini azaltır ve zaman içinde membran hasar ölçüde sınırlar 37 ˚C ulaştığında hızla ve geri dönüşümsüz toplar. LLO kolesterol için bağlar ve gözenekleri kolesterol açısından zengin membranlar oluşturur, son olarak, bu tahlil memeli hücreleri geniş bir mükellef olduğundan. LLO esas olarak gözenek oluşumu ile sinyal konak hücre etkiler akılda tutmak önemlidir birkaç istisna dışında hangi gözenek bağımsız hücre sinyallemesi33,34,35,36 oluşabilir ,37,38,39. Bu nedenle, olamaz faaliyetleri membran onarım sürecini etkileyebilir sinyal o LLO hariç.
Bu tahlil doğrudan hücre pasif yaralı hücreleri girer ve nükleik asitler ile ilişkilendiren bir kez son derece floresan olur bir hücre impermeant fluorochrome (Örneğin, propidium iyodür) birleşme ölçerek yaralama ölçüde değerlendiriyor . Bu nedenle, fluorochrome hücre yaralama, gerçek zamanlı analiz izin deney boyunca hücre kültür ortamında muhafaza edilebilir. Nükleik asit bağlama boya floresan yoğunluğu toksin konsantrasyon ile artacak ve toksin verilen konsantrasyona kadar tüm gözenekleri kurulur ve hücreleri tamamen tamir veya doygunluk ulaşılıncaya kadar zamanla artacaktır. Hücre dışı Ca2 + membran gözenekler yoluyla akını yeniden mühürleme için olmazsa olmaz bir olaydır. Bu nedenle, resealing verimliliği dolaylı olarak hücre kültür Ca2 + (onarım izin veren koşul) içeren bir Ca2 +‘ yaralama için orta yaralama karşılaştırarak kanıtı-ücretsiz Orta (onarım kısıtlayıcı durumu). Nükleik asit bağlama boya floresan yoğunluğu hücre konsantrasyonu her iyi doğru orantılı olduğundan, aynı toplama bütün Wells, tohum hücrelere önemlidir. Her şey hücrelerde önce ve sonra hücre dekolmanı, yüzen olarak, toplanan hücre veri yorumu karmaşık hale floresans okuma belirsiz oluşmaz emin olmak için tahlil numaralandırmak önemlidir. Hücreleri numaralandırmak için lokalize nükleer histon 2B-GFP (H2B-GFP) ifade hücreleri bu tahlil kullanılmıştır. Isı kontrollü, çok modlu, 37 ° C’de yaşam hücrelerinin mikroskopisi görüntüleme (96 veya 384-şey plaka biçimini kullanarak) hızlı, yüksek üretilen iş ölçümler floresans yoğunluklarını Mikroplaka Okuyucular birleştirmek İkinci hücre sayı saymak ve farklı hücre popülasyonlarının nihai oluşumu gözlemlemek için kullanılabilir.
Sonuçta, bu tahlil kullanıcılar tarafından tarama için ana bilgisayar molekülleri onların bilgi membran tamir mekanizmaları karmaşıklığı genişletme yeteneğini sağlar veya membran denetleyebilen exogenously eklenen bileşikler onarın. Aşağıdaki protokol için LLO maruz hücreleri resealing verimliliğini ölçmek için deneysel adımları açıklar ve verilen ilaç ya da yeniden mühürlemeden verimliliği hücresel tedavi etkilerini değerlendirmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu tahlil membran hücre nüfus düzeyinde yüksek üretilen iş kapasitesi ile yeniden mühürlemeden etkinliğini ölçer. O-ebilmek var kullanılmış için hücresel bileşenleri veya membran onarım etkileyebilecek uyuşturucu kitaplıkları ekran. 96-şey plaka açıklanan tahlil kullanılan ama 384-şey plakalar için daha yüksek üretilen iş için uyarlanabilir. Floresans ölçümleri yapisan canlı hücreler aşırı hücre hücre dekolmanı, fiksasyon veya sonrası fiksasyon etiketleme floresans gibi işleme …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lütfen bazı ön deneyler için onun çok modlu algılama platformu kullanmak izin verdiğiniz için Dr Jesse Kwiek (Ohio Devlet Üniversitesi) anıyoruz. Bu makalesinde bildirilen araştırma Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları Ulusal Sağlık Enstitüleri Stephanie Seveau için ödül numarası RO1AI107250 altında tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | i3x | |
| MiniMax 300 Imaging cytometer | Molecular Devices | 5024062 | |
| TO-PRO-3 | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| HeLa | ATCC | CCL2 | |
| HeLa H2B-GFP | Millipore | SCC117 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| 96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate | Corning | 3603 | |
| Hanks' balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| EGTA | ISC BioExpress | 0732-100G | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-(+)-Glucose, HybriMax | Sigma-Aldrich | G5146-1KG |
Referenzen
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
- Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
- Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
- Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
- Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
- Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
- Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
- Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
- De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
- Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
- Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
- McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
- Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
- Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
- Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
- Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
- Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
- Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
- Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
- Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
- Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
- Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
- Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
- Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
- Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
- Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
- Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
- Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
- Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
- Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
- Cassidy, S. K., O’Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
- Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
- Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
- Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
- Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
- Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
- Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
- Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
- Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
- Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
- Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
- Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
- Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
- Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
- Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
- Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
- Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
- Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
- Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).
