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Medizin

Contractions de syncytiums Cardiomyocyte iPSC-anthropique mesurées avec un colorant Fluorescent Ca sensible dans le contrôle de la température des plaques 384 puits

Published: October 18, 2018
doi:
10.3791/58290
, ,
1Department of Pharmacology and Preclinical Development,Idorsia Pharmaceuticals Ltd

Summary

Contractant spontanément syncytiums de cardiomyocytes dérivés de pluripotentes induites par l’homme les cellules souches sont des modèles utiles de la physiologie cardiaque humaine et de la pharmacologie. Nous présentons ici un système de criblage à haut débit afin de quantifier les effets des composés exogènes sur les coups de fréquence, à l’aide d’un colorant fluorescent Ca sensible et un lecteur de plaque multipuits imagerie thermorégulées.

Abstract

Contractant spontanément syncytiums de cardiomyocytes dérivés de pluripotentes induites par l’homme des cellules souches (hiPSC CM) sont un modèle intéressant de la physiologie cardiaque humaine et de la pharmacologie. Diverses méthodes ont été proposées pour enregistrer cette activité spontanée et pour évaluer les effets des médicaments, mais beaucoup de ces méthodes souffrent d’un débit limité et/ou pertinence physiologique. Nous avons développé un système de criblage à haut débit afin de quantifier les effets des composés exogènes à la fréquence de battement de hiPSC CM, à l’aide d’un colorant fluorescent Ca sensible et un lecteur de plaque multipuits imagerie thermorégulées. Nous décrivons comment préparer les plaques de la cellule et les plaques composés et comment faire pour exécuter le test automatisé pour atteindre la reproductibilité et sensibilité élevée. Nous décrivons également comment transformer et analyser les données de fluorescence pour fournir une mesure fiable des effets de la drogue sur le rythme spontané. Ce test peut être utilisé dans les programmes de recherche pour guider optimisation chimique loin de, ou vers, composés qui affectent la fonction cardiaque humaine.

Introduction

Le présent protocole décrit une méthode pour mesurer les effets des médicaments sur la fréquence de battement spontanée de syncytiums de hiPSC CM à rythmes physiologiquement pertinents. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme peuvent se différencier en cardiomyocytes fonctionnelles qui établissent spontanément battant syncytiums in vitro1,2,3,4. Ces hiPSC-CM peut être obtenus en grand nombre par le biais de fournisseurs commerciaux ou production en laboratoire, et elles constituent une source utile de cellules pour produire des modèles de la physiologie cardiaque humaine et de la pharmacologie. En particulier, il peuvent servir à prévoir ou à caractériser les effets cardiaques qui peuvent survenir lorsqu’un médicament est administré à l’homme5.

La fréquence de battement de syncytiums hiPSC-CM peut être mesurée dans des conditions physiologiques, à l’aide de matrices de microélectrodes ou impédance détection1: ces techniques non invasives des renseignements très détaillés sur les effets des médicaments, mais ils sont plutôt bas-débit et ils ne permettent pas de grandes bibliothèques composés le test dans les temps réaliste et contraintes budgétaires. Un système plus efficace peut être élaboré à l’aide d’une fluorescence de 384 puits lecteur de plaques d’imagerie et un sensible Ca teindre6, mais lecteurs de plaques classiques sont gênées par fréquence de commande et acquisition de température sous-optimale. Ces limitations sont illustrées par des taux de battement non (~ 15 bpm, comparativement à 35 – 55 bpm dans des environnements contrôlés1) et la mauvaise résolution de signal Ca (une fréquence d’acquisition de 8 Hz est à la limite inférieure aux taux Records pouvant atteindre 120 bpm dans des conditions stimulées, et il ne peut pas extraire les informations telles que la pente ou la durée). La méthode décrite ici combine l’enregistrement de battre les patrons à rythmes physiologiques et à une résolution suffisante pour empêcher ces préoccupations.

Du côté positif, cette méthode est simple, fiable et haut débit, qui permet l’essai rapide d’un grand nombre de composés à des coûts raisonnables. Sur le plan négatif, cette méthode nécessite un lecteur de plaque rapide avec contrôle de température effective, ce qui représente un investissement coûteux, et il fournit des informations peu mécanistes sur les effets des médicaments observés, qui peuvent nécessiter d’autres essais avec plus détaillées Méthodes.

Environ 6 x 10 hiPSC6 CM sont nécessaires pour une mesure dans une plaque de 384 puits cellulaire. hiPSC-CM sont habituellement fournis dans le commerce comme des aliquotes congelés du ~ 4 x 106 cellules dans 1 mL. Par conséquent, il convient de préparer deux plaques cellulaires avec trois aliquotes congelées. Dans la plupart des cas, en raison de la faible variabilité de ce test, il suffit de réaliser des mesures en double des composés d’essai et, dans chaque plaque cellulaire, quatre mesures de contrôle positif (la forskoline, N6-cyclopentyl-adénosine et E-4031), et mesures 20-plissées de contrôle négatif (DMSO uniquement). Par conséquent, un maximum de 352 paires composé/concentration peut être évalué avec deux plaques de 384 puits cellulaires. Le protocole suivant estime qu’une telle expérience avec 352 composés d’essai, deux plaques de la cellule et 12 millions de cellules fournies comme trois aliquotes congelées ; Il peut être facilement mis à l’échelle en place si les points de données supplémentaires sont nécessaires.

Protocol

1. préparation des plaques de la cellule NOTE : Préparez les plaques de la cellule 3–4 semaines avant la mesure des effets de la drogue. Jour 0 de l’expérienceNOTE: aux fins de planification, l’application composé de test peut être effectuée sur n’importe quel jour entre jours 22–28 de l’expérience. Allumez le bain-marie à 37 ° C et chaud 40 mL de milieu de placage (tel que fourni par le fabricant).NOTE : Utiliser les cellules avec leurs médias correspondant de culture et d’entretien fournies par le fournisseur. Décongeler le hiPSC-CM en plaçant les cryotubes contenant des cellules congelées dans un bain-marie pendant 2 min. Transfert avec soin les suspensions cellulaires de 1 mL dans un tube conique de 50 mL. Lavez chaque cryotube avec 1 mL de milieu de placage chaude pour récupérer les restes cellules et ajouter le support de lavage dans le tube conique même des cellules contenant étape 1.1.3. Mélanger soigneusement un autre 8 mL de milieu chaud placage dans la suspension cellulaire. Compter les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trypan et un hematocytometer8.NOTE: l’exigence de 6 x 106 cellules pour une plaque de 384 puits cellulaire considère la possibilité de jusqu’à 20 % de cellules mortes parmi les cellules congelées, qui est un maximum dans notre expérience. Ajuster la suspension de cellules à 5 x 105 cellules/mL direct avec le milieu de placage à chaud. Distribuer la suspension cellulaire dans deux plaques de 384 puits cellulaires en ajoutant 25 µL à chaque puits (environ 12 500 cellules / puits).Remarque : Les plaques de la cellule n’avez pas besoin d’être revêtus d’une matrice (voir Discussion). Maintenir les plaques de la cellule à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Jour 1 de l’expérience Allumez le bain-marie à 37 ° C et chaud 50 mL de milieu de maintenance supplémenté avec solution de pénicilline-streptomycine 1 % v/v. Remplacer le médium placage avec 50 µL de milieu chaleureux entretien dans chaque puits de plaques des cellule. Jours 2–21 (jusqu’au jour 27) de l’expérienceNOTE: les hiPSC-CMs n’est pas nécessaire tout passage au cours de cette période, car ils sont non de Division des cellules. Renouveler la moitié de la moyenne de l’entretien tous les 2–3 jours et le renouveler entièrement sur les 7, 14 et 21 jours.Remarque : La mesure de la fluorescence peut être effectuée entre le 22 et le 28 de l’expérience. Durées plus longues n’ont pas été jugés, mais peuvent encore être fines. 2. préparation de l’Instrument, composé de planches et plaques de dosage NOTE: préparer l’instrument, les plats composés et dosage des plaques le jour de la mesure des effets des médicaments, entre 22 et 28 de l’expérience. Utilisez un lecteur de plaque fluorescente avec contrôle de température et un témoin de filtre approprié fluorescence kit et excitation source. Par exemple, utiliser un kit de filtre de fluorescence Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 (excitation : 472 nm ; émission : 520–560 nm) et une unité de source lumineuse 150 W excitation. Au moins 2 h avant la première plaque de cellule doit être placée dans le lecteur de plaque pour la mesure, allumez le lecteur et régler le système de chauffage à 37 ° C.NOTE: cela peut aussi être fait la veille au soir. Préparer les témoins positifs, la forskoline, N6-cyclopentyl-adénosine et E-4031 comme des solutions mères de 0,33 mM dans le DMSO, 10 mM dans le DMSO et 3,33 mM H2O, respectivement.NOTE: solutions mères seront diluées 333-fold au moment où ils sont ajoutés aux cellules, et le but est d’atteindre des concentrations d’essai final de 1 µM forskoline, 30 µM N6-cyclopentyl-adénosine et 10 µM E-4031, qui produisent des effets fiables et reproductibles. Préparer les 352 composés d’essai comme solutions mères de DMSO à 333-fold les concentrations d’essai prévue (par exemple, 10 mM pour un test à 30 µM).Remarque : L’objectif est d’atteindre une concentration finale de 0,3 % (v/v) de DMSO dans la plaque cellulaire après l’application de composés ; Il s’agit de la plus forte concentration de DMSO qui n’affecte pas l’activité rythmique des cardiomyocytes. Les solutions mères peuvent également être préparées la veille. Il faut un minimum de 5 µL de solution mère pour chaque mesure en double. Préparer les assiettes composées. Chauffez 40 mL de milieu d’entretien complété avec solution de pénicilline-streptomycine 1 % v/v à la température ambiante. Distribuer en deux plaques 384 puits composés en ajoutant 1,5 µL de solution mère / puits : i) des composés d’essai (deux puits), ii) les contrôles positifs (la forskoline, N6-cyclopentyl-adénosine et E-4031, quatre puits de chaque par plat composé) et iii) le négatif contrôle (DMSO, 20 puits par plat composé). Centrifuger les plaques composés à 100 x g pendant 1 min. Ajouter 37 µL de milieu de maintenance à la température ambiante dans chaque cupule (3,9 % DMSO à 38,5 µL à ce stade). Centrifuger les plaques composés à 100 x g pendant 1 min. Charger les plaques composés dans le lecteur de plaque.NOTE : Les prochaines étapes devraient être effectuées dès que possible afin de minimiser l’évaporation dans les plats composés. Préparer le colorant fluorescent. Allumez le bain-marie à 37 ° C et chaud 100 mL de milieu de maintenance supplémenté avec solution de pénicilline-streptomycine 1 % v/v. Reconstituer le colorant fluorescent Ca-sensible et extincteur 10 ml de milieu de maintenance chaud avec des antibiotiques.NOTE: ce milieu de fluorescence stock contient le colorant fluorescent Ca sensibles, généralement Fluo-4 et un extincteur, et les restes peuvent être stockés à 4 ° C pendant au moins 5 jours. 3. Acquisition de données Remarque: effectuer l’acquisition de données sur le jour de la mesure des effets de la drogue. Procédez comme 3.1–.10 entièrement pour la première plaque de cellule, puis répéter pour la seconde plaque cellulaire. Lancez le logiciel de lecteur de plaque (si nécessaire) et charger les pointes de pipette. Ajustez les réglages du logiciel pour enregistrer un segment 2 min des vagues de Calcium avec une fréquence d’acquisition au moins 10 Hertz pour définir la fréquence des battements de base pour chaque puits. Pour une plaque cellulaire, diluer 3 mL de milieu de fluorescence stock dans 12 mL de milieu de maintenance chaud avec des antibiotiques pour rendre le milieu de la fluorescence. Remplacer 20 µL de milieu dans chaque puits de la plaque cellulaire avec 30 µL de milieu de fluorescence. Pipetter, monter et descendre de 1 x à mélanger. Placer la plaque cellulaire dans le lecteur de plaque aussi rapidement que possible pour laisser le hiPSC-CM s’acclimater à la température. Attendez 60 min avant de commencer la collecte de données. Commencer la collecte de données dans le logiciel de lecteur de plaque pour enregistrer un segment de 2 min d’ondes Ca avec une fréquence d’acquisition d’au moins 10 Hz, pour définir le niveau de référence battant le taux pour chaque puits.Remarque: pour chaque séquence de l’enregistrement, assurez-vous que la plaque cellulaire ne sont pas transférée automatiquement hors de l’appareil après l’acquisition de données. Cela empêche la plaque de la cellule de refroidissement à la température ambiante. Avec certaines versions du logiciel de lecteur de plaque, il peut être nécessaire d’arrêter chaque enregistrement avant la fin complètement pour y parvenir. Ajouter les composés d’essai et de référence avec le robot de lecteur de plaque en pipettant également, puits à puits 5 µL dans le plat composé dans la plaque cellulaire (après l’addition, la concentration de DMSO est 0,3 % [v/v]). Commencer la collecte de données dans le logiciel de lecteur de plaque à segments record 2 min des vagues de Ca à partir de 5, 15, 30, 45 et 60 min après l’addition de composé (Assurez-vous que chaque fois que la plaque cellulaire reste dans l’appareil). 4. analyse des données NOTE: l’analyse des données peut être effectuée à tout moment après la mesure. Exporter les données brutes pour chaque période d’enregistrement par le logiciel de lecteur de plaque comme des fichiers texte ASCII. Importer les données brutes dans le logiciel d’analyse de données. Pour chaque puits et tous les points dans le temps, extraire la fréquence de battement principal.Remarque : Avec le logiciel d’analyse de données énuméré dans la Table des matières, battant des fréquences peut être calculée avec une routine d’analyse personnalisée en utilisant la fonction LombPeriodogram, basée sur la méthode Lomb – Scargle d’analyse spectrale des moindres carrés7 . Le périodogramme doit être calculé pour une gamme de fréquences comprises entre 0,01 et 5 Hz. Les primaires de fréquence peuvent être extraites le périodogramme utilisant les routines de PeakAutoFind. Cette méthode d’analyse fournit des mesures plus précises de battre les fréquences que la méthode fourni en option avec le logiciel de lecteur de plaque. Toutefois, ce dernier toujours utilisable si la personnalisation du logiciel n’est pas une option. Exporter les fréquences de battement principal pour chaque période d’enregistrement du logiciel d’analyse de données comme presse-papiers copies ou des fichiers texte ASCII. Importer les fréquences de battement primaire dans un logiciel de tableur par collage de presse-papiers ou importation de fichiers texte.NOTE: étapes 4,5–4,9 peuvent être effectuées dans n’importe quel tableur moderne. Pour chaque puits, normaliser au niveau de référence la fréquence de battement à chaque point dans le temps après la demande de drogues (5, 15, 30, 45 et 60 min) en divisant la fréquence de battement principal à ce moment-là point par la fréquence de battement principal au départ. Calculer l’effet moyen de DMSO à chaque point dans le temps après la demande de drogue (5, 15, 30, 45 et 60 min) en faisant la moyenne des valeurs normalisées pour les 20 puits où le DMSO a été appliquée. Pour chaque bien et chaque fois que le point après la demande de drogue (5, 15, 30, 45 et 60 min), soustraire l’effet moyen de DMSO (apparié dans le temps) pour la même plaque. Moyenne des mesures en double.Remarque: si un composé change de fréquence ou le logiciel ne peut pas trouver une fréquence primaire après l’addition de composé, un examen visuel du modèle battant peut évaluer si le composé produit des arythmies.

Representative Results

La figure 1 montre un enregistrement représentant des ondes de Ca au départ à travers une plaque 384 puits. Dans la plupart des cas, tous les puits révèlent un taux de battement régulier avec peu de variabilité dans l’ensemble de la plaque (moyenne ± écart-type = 40,1 ± 3,5 bpm ; fourchette = 34 – 54 bpm). Très rarement (moins de 1 sur 10 expériences), quelques puits (inférieur à 5) ont arythmie ou l’absence de rythme. En trois plaques 384 puits, nous avons aussi essayé d’un autre fournisseur, les cardiomyocytes (voir Table des matières) et a obtenu des valeurs de base très similaire pour avoir battu spontanée. Bloqueurs des canaux ioniques cardiaques, le rythme des cardiomyocytes dans une manière reproductible5perturbé. Amlodipine, un bloqueur de la lente Ca canaux9, accélère le rythme de plus de 100 % d’une manière dépendante de la concentration jusqu’à 1 µM (Figure 2 a). L’effet est bien développé au cours des 5 premières minutes, mais il augmente encore environ 50 % dans les prochaine 30 min avant de se stabiliser. Au-dessus de 1 µM, amlodipine arrête le battement (en pointillés), comme peut s’y attendre du fait que Ca cyclisme est essentiel aux contractions spontanées. Autres bloqueurs de canaux Ca dihydropyridine sélectives produisent des effets très similaires. E-4031, un bloqueur des canaux redresseur retardé rapide K10, ralentit le rythme environ 65–70 % d’une manière dépendante de la concentration jusqu’à 10 µM (Figure 2 b). L’effet se développe dans les 5 premières minutes et elle ne varie pas au cours des 60 prochaines minutes. Autres bloqueurs sélectifs des IKr produisent des effets similaires, bien que la réduction maximale des taux peut varier (par exemple, 35–40 % pour le cisapride, 70 % pour les E-4031 et 90-95 % pour dofétilide). On ne connaît pas le fondement de cette disparité. La tétrodotoxine, un bloqueur de la rapide Na canaux11, ralentit le rythme d’environ 15 % de manière dose-dépendante, jusqu’à 1–30 µM (Figure 2). L’effet est bien développé au cours des 5 premières minutes et elle ne varie pas beaucoup dans le prochaine 60 min. Cependant, au-dessus de 30 µM, la tétrodotoxine arrête le passage à tabac au cours des 5 premières minutes, alors qu’après 30 min, il arrête il au-dessus de 1 µM. Autres bloqueurs de canaux Na, comme la lidocaïne ou la mexilétine, produisent des effets similaires de type tout ou rien. Bépridil, un bloqueur mixte de cardiaque Na, Ca et K canaux9, produit également un effet tout ou rien (Figure 2D). Ceci suggère que, dans cette préparation, un bloc de canaux Na est l’action principale de bépridil. Une accélération due à la bloc canal Ca ne se voit pas, et le plus progressif ralentit en raison du bloc IKr apparaît masqué par l’effet du canal Na. Figure 1 : base représentative Ca vagues à travers une plaque 384 puits. (A) tous les puits à travers la plaque démontrent un taux de battement régulier avec peu de variabilité. Cette image est capturée directement depuis le logiciel de lecteur de plaque. Chaque trace est de 10 s dans la durée. L’intensité de la fluorescence est arbitraires (relatives légères unités provenant de l’échelle de gris de caméra vidéo). (B) ce Blow-Up de 10 s trace indique le faible bruit du signal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : effets représentatifs d’ioniques cardiaques des canaux calciques. Ces panneaux montrent les courbes concentration-réponse avec (A), le Ca sélective channel blocker amlodipine, (B) la IKr sélectif blocker E-4031, (C) le bloqueur sélectif des canaux Na TTX et (D), le canal non sélectifs bloqueur bépridil. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Deux aspects sont plus critiques pour l’enregistrement réussi d’avoir battu des fréquences. La première consiste à faire preuve de prudence avec l’électrodéposition de cellule et de la culture. En particulier, il est important d’essayer de ne pas rayer la couche de cellules au fond des puits lors de l’échange du milieu. Il est acceptable de toucher le fond du puits avec les pipettes, mais le même angle doit être utilisé à chaque fois, ce qui produit seulement une petite égratignure dans la couche de cellules et sans incidence sur les performances du test. Le deuxième aspect critique d’obtention reproductibles rythmes homogènes est de fournir le bon contrôle de température à 37 ° C dans l’ensemble de la plaque cellulaire pendant la durée de la mesure. Nous ne pourrions pas obtenir cette homogénéité à l’aide de dispositifs autres que le lecteur utilisé ici, mais il peut être possible avec des modifications de la régulation de la température : il rendrait le protocole présenté ici plus largement utilisable au-delà d’une seule marque de plaque lecteur. Pour atteindre une stabilité de température pendant la durée de l’expérience avec le dispositif utilisé ici, il fallait arrêter chaque enregistrement avant que ça s’est terminé ; dans le cas contraire, le robot serait éjecter la plaque cellulaire mesurée. Ce problème technique peut disparaître avec la prochaine version du logiciel lecteur plaque, mais il demeure critique pour l’instant. Si une plaque de cellules est transférée par erreur en dehors du lecteur de plaque, il doit être chargé à l’intérieur aussi vite que possible. Néanmoins, la qualité de l’expérience se détériorera, parce que les changements de température affectent la fréquence des battements très rapidement.

D’autres aspects, qui n’ont pas été testés à fond, peut-être moins importants. Par exemple, hiPSC-CM fabricants recommandent de plaques de culture cellulaire enduit avant d’ensemencer les cellules, mais dans ce test spécifique, revêtement non utilisée, parce que les cellules adhèrent facilement sur diverses surfaces, et il est très difficile pour bien enrober 384 puits plaques. Pourtant, revêtement plaque cellulaire peut toujours être admissible, ou il peut même améliorer la qualité de l’analyse. Nous avons vérifié également jamais si des solvants autres que le DMSO serait acceptables, mais de l’expérience avec d’autres technologies d’enregistrement, il est prévu que des concentrations similaires de EtOH ou MeOH serait aussi tolérables. Nous utilisons généralement hiPSC-CMs provenant du même fabricant, et les cellules d’un seul fournisseur supplémentaire ont été testés, qui semblait fonctionner d’une manière similaire. De même, nous avons utilisé seulement un petit nombre de lots différents de hiPSC-CMs qui ont été choisis par eux vérifie pour vérifier qu’ils se sont comportés de la même façon pour le premier lot. Un ou deux lots ont été jugées inappropriées parce que leurs syncytiums eu faible stabilité ou reproductibilité dans les conditions de culture utilisées ici. Dans le cas contraire, la pharmacologie apparaît très semblable à travers des lots lors du test d’un groupe limité de composés « typiques » (la forskoline, N6-cyclopentyl-adénosine et E-4031, ainsi que l’endothéline, isoprotérénol, amlodipine et ponesimod). Nous avons utilisé seulement hiPSC-CM provenant de donneurs sains. Il peut être utile d’évaluer si hiPSC-CM provenant de patients atteints de cardiopathie donnerait des résultats différents, bien qu’aucune différence entre donneurs sains et des patients a été observée lors de l’évaluation de la cardiotoxicité des inhibiteurs de tyrosine kinase 12. Enfin, nous avons normalement attendre 22 – 28 jours de culture avant de mesurer les effets des médicaments : dans notre expérience avec des enregistrements d’impédance des mêmes cellules, un état d’équilibre pour ralentir impédance (un indicateur de stabilité de couche de cellules) et l’impédance rapide (un indicateur de battre la fréquence) est atteint après 12–15 jours de culture. Cependant, nous avons décidé d’attendre 22–28 jours, parce que c’est le moment où le profil d’expression des canaux cardiaque et marqueurs maturation s’est stabilisée à13. Il n’a pas examiné si des résultats comparables seraient obtenus si les cellules ont été utilisés plus tôt ou plus tard.

Le protocole décrit ici utilise une mesure très simple de la fréquence des battements spontanée de hiPSC CM pour évaluer les éventuels effets des médicaments sur l’électrophysiologie cardiaque humaine. Ses principaux avantages par rapport aux autres méthodologies sont que i) elle se prête à un environnement de criblage à haut débit, ii) il enregistre l’activité des cardiomyocytes et les effets des médicaments à température physiologique, et iii) il ne nécessite pas expertise électrophysiologique pour l’exécution ou pour une évaluation des résultats.

Dans une étude de validation réalisée avec beaucoup de médicaments approuvés pour usage humain, nous avons montré que le test réagit aux médicaments utilisés en médecine humaine tel que prédit par les données cliniques5. Parce que cette méthode tient compte de tous les effets potentiels sur le rythme cardiaque, il complète le complète en vitro proarythmiques assay (CiPA) initiative14 qui évalue spécifiquement potentiel pro-arythmique.

À l’avenir, cette méthode pourrait fournir un mieux comprendre le mode d’action des médicaments montré d’influer sur la fréquence des battements spontanée. Il est probable qu’adicionais mécanistes sont présents dans les enregistrements de la fluorescence des transitoires de Ca (p. ex., dans leur forme ou leur amplitude). Si les enregistrements de fluorescence sont effectuées au taux d’acquisition plus élevés (p. ex., 30 Hz), ces paramètres sont facilement extraits en plus de battre des taux, et il peut être intéressant de corréler les variations de ces paramètres avec les effets connus du sur le plan clinique consommé de la drogue.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs n’ont aucuns accusés de réception.

Materials

FDSS7000 fluorescent plate reader Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 not a catalog item
FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 installed initially
in the device
FDSS7000 temperature control Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 A10118-09
FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 C11653-11
FDSS7000 pipet tips for 384-well plates Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 A8687-62
Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes Hamamatsu Photonics
(Massy, France)		 U8524-12 optional alternative to the Igor Pro software
Igor Pro data analysis software Wavemetrics
(Portland, Oregon, USA)		 Latest version
iCell-Cardiomyocytes Kit Cellular Dynamics International (Madison, WI) R1106 includes cells, plating and maintenance media
Cor.4U Cardiomyocyte Kit Ncardia Germany
(Cologne, Germany)		 Ax-B-HC02-4M includes cells, plating and maintenance media
alternative to the iCell-Cardiomyocytes
384-well cell culture plates Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) 781091
384-well compound plates Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) 781280
FLIPR Calcium 4 Assay Kit Molecular Devices
(Sunnyvale, California)		 R8142
Forskolin Sigma-Aldrich
(Buchs, Switzerland)		 F6886
N6-cyclopentyl-adenosine Sigma-Aldrich
(Buchs, Switzerland)		 C8031
E-4031 Enzo Life Sciences
(Lausen, Switzerland)		 BML-KC158
Penicillin-Streptomycin solution Gibco/ThermoFisher
(Reinach, Switzerland)		 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco/ThermoFisher
(Reinach, Switzerland)		 15250061
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Referenzen

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Human-iPSC-derived CardiomyocyteCardiac Safety PharmacologyTemperature-controlled 384-well PlatesCa-sensitive Fluorescent DyeSyncytia ContractionsCell CultureMaintenance MediumCompound Plates

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Forny, C., Sube, R., Ertel, E. A. Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates. J. Vis. Exp. (140), e58290, doi:10.3791/58290 (2018).
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