Antigênicos lipossomas para a geração de anticorpos específicos de doença
Summary
Descrito, é a preparação de nanopartículas lipossomas antigênicas e seu uso em estimulando células B ativação in vitro e em vivo. Respostas consistentes e robustas anticorpo levaram ao desenvolvimento de um novo modelo de alergia ao amendoim. O protocolo para a geração de lipossomas antigênicos pode ser estendido para antígenos diferentes e modelos de imunização.
Abstract
Respostas de anticorpos fornecer imunidade protetora crítica para uma grande variedade de agentes patogénicos. Ainda há um grande interesse na geração de anticorpos robustos para a vacinação, bem como entender como patogênico anticorpo respostas desenvolvem alergias e doenças auto-imunes. Gerar respostas robusto anticorpos antígeno-específicos não é sempre trivial. Em modelos do rato, muitas vezes requer várias rodadas de vacinas com adjuvante que leva a uma grande variabilidade nos níveis de anticorpos induzidos. Um exemplo é em modelos do rato de alergias do amendoim onde modelos mais robustos e reprodutíveis que minimizam o rato números e o uso de adjuvantes seria benéficos. Apresentado aqui é um modelo de mouse altamente reprodutível de anafilaxia alergia ao amendoim. Esse novo modelo baseia-se em dois fatores principais: (1) antígeno-específicas splenocytes enviaram são transferidos de um rato de amendoim-sensibilizados para um rato de destinatário ingênuo, normalizando o número de memória antígeno-específicas e T-células B através de um grande número de ratos; e (2) destinatários ratos são posteriormente impulsionou com um forte immunogen multivalentes na forma de nanopartículas lipossomas exibindo o alérgeno amendoim principal (Ara h 2). A grande vantagem deste modelo é sua reprodutibilidade, que em última análise, reduz o número de animais utilizados em cada estudo, minimizando o número de animais recebendo injeções múltiplas de adjuvante. A montagem modular destes lipossomas imunogênicas fornece adaptabilidade facile relativamente a outros modelos alérgicas ou auto-imune que envolvem anticorpos patogênicos.
Introduction
Alergia alimentar afeta 8% das crianças nos Estados Unidos e tem aumentado em prevalência nos últimos década1. Alergia a amendoim afeta 1% das crianças e não é tipicamente Superdimensonada2. Embora vários ensaios clínicos promissores estão em andamento para o tratamento de alergias alimentares, incluindo imunoterapia oral (OIT), imunoterapia sublingual (fenda) e imunoterapia epicutâneos (EPIT), existem actualmente sem estratégias de tratamento aprovado pela FDA para a dessensibilização alérgica a amendoim indivíduos3,4,5,6,7,8. Portanto, indivíduos alérgicos estritamente devem evitar alérgenos para evitar a anafilaxia. Muitas questões permanecem sobre rotas de sensibilização e subjacente mecanismos de desenvolvimento de alergia alimentar.
Modelos de mouse são uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos da alergia, bem como desenvolver novo tolerogenic e dessensibilização terapias9,10,11,12. Isto é especialmente verdadeiro porque o principal alérgeno de amendoim (Ara h 2; Ah2) em humanos é também o alérgeno dominante em vários descrito rato modelos13,14. Enquanto modelos de rato de alergia são inestimáveis no estudo de mecanismos de sensibilização e tolerância, uma desvantagem é que pode ser variável e requerem o uso de adjuvantes. Imunogenos mais potentes seria uma maneira de minimizar a variabilidade intrínseca de tais modelos. Uma vez que as células B são fortemente ativadas por antígenos multivalentes, lipossomas antigênicos exibindo o alérgeno são uma boa opção, devido à sua capacidade de potencialmente ativar as células B através do receptor de células B (BCR), enquanto também ter a propriedade de forma eficiente escorva do compartimento de células T através de ser usada por não-especificamente apresentadoras células.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para antígenos da proteína de nanopartículas lipossomas usando uma estratégia fácil e modular de conjugação. Usando um antígeno substituto, fragmento Fab anti-IgM, demonstramos como potente tais lipossomas antigênicos podem ser na ativação de células B estimulante. Antigênicos lipossomas exibindo Ah2 antígeno foram usados para desenvolver um novo modelo de rato de sensibilidade conferida. Neste modelo, splenocytes de verificadas amendoim ratos alérgicos, contendo memória de amendoim específicas células B e T, são transferidos para o ingênuo congenic ratos. Respostas de anticorpos de memória são induzidas pela injeção de lipossomas conjugados com Ah2 em ratos os destinatários, a fim de induzir anticorpos contra Ah2. Seguido por apenas um impulso com Ah2 solúvel, anticorpos específicos Ah2 dão origem a uma forte reação anafilática quando estes ratos posteriormente são desafiados com Ah2. Como ratos submetidos a reação alérgica respondem de uma forma altamente uniforme e não tem recebido um adjuvante, esta abordagem é um modelo desejável de alergia e os resultados sugerem que pode ter utilidade em outros modelos de rato conduzidos por antígenos dirigidos a alérgenos e possivelmente auto-antigénios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos descritos aqui são um protocolo geral para a conjugação de uma proteína para um lipídio que permite a exibição da proteína sobre nanopartículas lipossomas. Para grandes subunidade várias proteínas, este protocolo pode ter limitado utilitário. O método ideal seria a introdução de uma marca específica do site que permite que uma estratégia de ligação química biorthogonal ser usado. Se expressar as proteínas recombinantes, isto pode ser possível usando estratégias específicas disponíveis…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do departamento de defesa (W81XWH-16-1-0302 e W81XWH-16-1-0303).
Materials
| Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
| Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
| SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
| DSPC | Avanti | 850365 | |
| DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
| DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
| Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
| Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
| Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
| 10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
| Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
| Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
| Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
| Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
| Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
| Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
| Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
| Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
| CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
| B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
| F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
| Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
| Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
| Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
| Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
| TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
| SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
| 96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
| Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
| HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
| Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
| Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
| Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
| NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
| Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
| HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
| Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
| NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
| NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
| GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |
Referenzen
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