이 보고서의 목적은 강력한 immunohistochemical epigenetic 마커의 검출을 위한 프로토콜을 설명 하기 위해, 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)을 개발 하 고 postmitotic 마우스 망막.
Epigenetics 망막 개발의 다양 한 인간의 망막 퇴행 성 질병의 메커니즘에 대 한 이해의 새로운 수준을 약속 새로운 치료 접근을 정확 하 게 잘 공부 연구 분야 이다. 마우스 망막의 핵 아키텍처는 두 개의 서로 다른 패턴 구성: 전통과 반전. 기존의 패턴은 동안 활성 euchromatin 핵 내부에 있는 섬으로, 핵의 주변에 지역화는 보편적 이다.입니다. 반면, 거꾸로 핵 패턴은 섬으로 localizes 핵 센터 및 euchromatin 핵 주변에 있는 성인 봉 포토 리셉터 세포 핵에 고유 합니다. DNA 메 틸 화는 chromocenters에서 주로 관찰 된다. DNA 메 틸 화 CpG 디 많은 유전자의 발기인 지구에 풍성 하 게 하는 시 토 신 잔류물 (5-methylcytosine, 5mC)에 동적 공유 수정입니다. 3 DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A와 DNMT3B) 개발 중 DNA의 메 틸 화에 참여합니다. Immunohistochemical 기술로 검출 5mC은 매우 도전, 결과, 다양성에 기여 하는 5mC 수정 기지를 포함 하 여 모든 DNA 기초는 이중 가닥 DNA 나선 안에 숨겨져 있습니다. 그러나, 개발 하는 동안 5mC 배포의 상세한 묘사 매우 유익 하지 않습니다. 여기, 우리 5mC와 다른 후 성적인 DNA 마커 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) 개발에 “오픈”, transcriptionally 활성화 chromatin와 colocalizes는 강력한 immunohistochemical 감지에 대 한 재현 기법을 설명 하 고 postmitotic 마우스의 망막
개발의 후 성적인 규정 및 마우스 망막의 postmitotic 항상성 retinogenesis 및 세포 운명 결정 제어 생물 학적 메커니즘에 대 한 새로운 이해를가지고 어떤 약속 셀 형식 관련 연구의 흥미로운 영역입니다. 신진 대사 기능, 세포 병 리, 세포 죽음 및 중생1,2,3,,45,6,,78 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 스트레스, 대사 또는 세포 죽음 자극6,,1415, chromatin 가변 외부 신호에 대 한 응답에서 뿐만 아니라 개발, 동적 변화를 겪 습 16 , 17 , 18. 마우스 핵 chromatin 활성 euchromatin 및 비활성 섬으로6,,1920으로 분할 된다. Interphase 핵에 euchromatin 섬으로 라인 핵 주변 및 핵소체 반면 핵의 내부 영역에 상주 합니다. 이 패턴은 기존의 불리고 진핵생물에서 고도로 보존. 반면, 마우스와 쥐 같은 야행성 동물에 막대 핵 핵 섬으로 둘러싸인 euchromatin 바깥쪽 껍질6,18, 형성 하는 센터에 의해 점유 된다 패턴 거꾸로 있다 20. 출생 시, 로드 핵 기존의 핵 건축이 있다. 막대 핵의 반전 기존의 핵 건축 리 모델링 하 여 개발 하는 동안 발생 합니다. 이 과정 동안, 주변 섬으로 핵 주변에서 분리 하 고 chromocenters 융합 센터에서 단일 chromocenter 형태의 핵6,18.
게놈 DNA 메 틸 화 제어 로컬 chromatin 구조21에 참여 합니다. DNA 메 틸 화는 5′ 풍성 하 게 CpG 디의 시 토 신 잔류물의 마우스 게놈22,23,,2425,26 에 많은 유전자의 발기인 지구에 있는 위치에서 발생 뿐만 아니라 intergenic intron 지역, 규제 요소27을 수행. 근 위 발기인21,24 에 CpG 섬 및 유전자 증강27,28 CpG 시퀀스의 메 틸 화는 포함 하는 많은 chromatin의 동적 상태를 조절에 중요 한 발달 유전자/녹음 방송 요인 개발, 암 및 노화29,30,31,32,,3334 에서 중요 한 역 . 3 DNA methyltransferases (DNMTs) 마우스 개발35동안 DNA 메 틸 화에 참여합니다. 모든 3 개의 DNMTs 마우스 망막 개발36 과 Dnmt 유전자 영향 망막 개발2,7망막 특정 변화 하는 동안 표시 됩니다. Hydroxymethylcytosine (5hmC) 5-methylcytosine (5mC) demethylation의 산화 제품 이다. 3 10-11 전 (TET) 효소 5mC demethylation37,,3839에 참여. Hydroxymethyl C 수정 발기인, 유전자 몸과 유전자 부자와 적극적으로 베낀된 지역27,40intergenic 게놈 시퀀스에 농축입니다.
다양 한 방식의 설명 셀41,,4243,44,45,46에서 DNA 메 틸 화 패턴 변화를 결정 하는 데, 그들 중 일부는 사용 DNA 메 틸 화 CpG 풍부한 지역 발기인과 증강에에서 정확한 변화에 초점을 맞추고 다른 사람들의 세계적인 변화 측정 검색 및 5hmC의 정량화 방법 또한 보고 된47, immunohistochemistry13포함 했다. 5mC와 5hmC 변화에 핵 개발의 강력한 모니터링 활성화 Immunohistochemical 기법, postmitotic 세포, chromatin 역학에서 제자리에서 외부 또는 내부 변화에 대응 묘사에 대 한 매우 유익 하지 않습니다 셀4,13,,4849에 영향을. 그러나,이 접근은 DNA 메 틸 화 및 조직학 준비에서 시 토 신 수정 감지와 관련 된 기술적인 어려움 때문에 hydroxymethylation 변화를 과소 평가 하는 경향이 있다. 이 때문에 비 극성 DNA 기초, 5mC 5hmC 수정 시 토 신 등은 이중 가닥 DNA 나선50의 센터에서 숨겨지고 unmasking 필요. 이것은 가혹한 치료 적용 되 면 원래 조직의 유익한 조직을 잃을 수 있습니다 급속 하 게 냉동된 조직학 준비에서 특히 도전적 이다.
마우스 망막 신경 개발 및 postmitotic 항상성 DNA 메 틸 화에의 기여를 해 부하는 우수한 모델입니다. 뉴런의 6 종류만 있다 (막대와 콘 대뇌, amacrine, 바이 폴라, 수평 및 신경 절 세포), glial 세포 유형 (뮬러 명과) 및 한 neuroepithelial 세포 유형 (망막 안료 상피)51. 망막 세포 유형 DNA 메 틸 화18,19, 최근 단일 기본 해상도1,,59,12공부는의 명백한 본을 보고 했다. 우리는 최근 immunohistochemistry 응용 프로그램 묘사 5mC 성인 마우스 망막, 조건부 타겟팅 하 여 제거 된 모든 3 개의 DNA methyltransferases의 핵의 망막 세포 핵 내에서 분포의 패턴을 보고 7. 보고서, 망막 세포에서 DNA 메 틸 화의 존재는 긍정적 으로만 볼 수 또는 hypermethylated에서 부정적인 신호 겪고 apoptosis 세포의 수에 비해 우리의 접근 활성화 감지 특정 chromatin 우리 여러 그룹 보고 하 고 앞에서 설명한 망막 세포 핵 내 배열5,6,7,,1819,36 , 52. 여기, 우리 뿐만 아니라 우리의 원래 보고서7에서에서 재현 수 있었습니다 데이터 설명 단원의 냉동 paraformaldehyde 고정 조직학 세부 사항에 5mC 및 5hmC를 감지 immunohistochemical (IHC) 기술을 설명 .
DNA 메 틸 화와 hydroxymethylation는 역동적이 고 가역 DNA 수정, modulatethe는 개발 뿐만 아니라 postmitotic 세포에서 생물 학적 메커니즘의 다양 한 범위. 여기, 우리가 설명 하는 단원의 paraformaldehyde 고정 냉동 마우스 망막의 immunohistochemical 기술 (안티-5mC와 안티-5hmC 항 체를 사용 하 여)에 의해 5mC와 5hmC DNA 수정에서 제자리에서 탐지 하기 위한 재현 기법 제공 개선 하 고 여러 다른 견본을 비교 하는 경우에 특히, 결과 표준화 지침. 우리 이전 5mC 변경 Dnmt1, Dnmt3a 및 Dnmt3b DNA methyltransferase 유전자를 망막 특정 프로세서용으로 마우스 망막에 윤곽을 그리 다이 메서드를 사용 하 고 보고 그들의 망막7에에서 5mC 마크 (예상된) 고갈 .
5mC immunohistochemical 감지에 중요 한 단계는 HCl 조직학 섹션의 처리의 최적화: HCl와 과도 한 치료는 핵을 파괴 하는 반면 15 분 전처리 재현성 결과 생산 하지 예상 보다 적은 아키텍처입니다. 우리는 HCl과 30 분 부 화 후 최상의 결과 발견. 우리는 항상 DNA 변성 및 망막 조직 고정을 위한 갓 희석된 HCl와 갓 만든된 4 %PFA 솔루션을 사용 하는 것이 좋습니다.
결과 해결 하려면 5mC 신호를 최적화 하는 동안 3 ~ 4 생물 복제를 포함 하도록 권장 합니다. 각각의 설정 하는 동안 immunohistochemical 얼룩 생성할 수 있습니다 약간 다른 결과 (다소 밝은 heterochromatic 지구를), 개별 집합 내의 immunohistochemical 방법, 5mC 및 5hmC 핵 분포에 예상 되는 섹션의 프로토콜 다음으로 재현성에 대 한 것으로 예상 된다.
이 기술은 또한 있다 제한 우리가 일관 되 게 동일한 섹션 포토 리셉터 세포 핵에 5mC 유통에서 변화 관찰. 우리는 인접 한 세포 핵 보였다 5mC 신호 하는 동안 강한 5mC 신호를 보여 일부 핵을 발견. 이것은 냉동된 섹션에서 HCl 처리에 의해 unmasking 5mC 항 한계 때문 이다.
이 기술의 중요성 DNase 및 가수분해 K 치료 chromocenters의 더 나은 보존을 선도 하지 않고 5mC 지역화를 수 있습니다. 이 기술은 모든 척추 동물의 조직, 운반 5mC, 5hmC 마크에서 어떤 섹션에 견고 하 게 작동 하는 것으로 예상 하 고 프로토콜 다음으로 뿐만 아니라 마우스 망막, 비슷한 방식으로 처리.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 지원 SBIR 교부 금 (1R44EY027654-01A1)에 의해.
Supplies | |||
29G1/2 ULTRA-FINE | BD Biosciences | 329461 | |
Ophthalmic scissor | Fine Science tools, Inc. | 15000-03 | |
PAP pen | RPICORP.com | 195505 | |
Microslide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
Reagent | |||
Paraformaldehyde | Electron Microscope Science | 15710 | |
1x PBS | Corning | 21-031-CV | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) | VWR | 4583 | |
Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
6 N HCl | VWR analytical | BDH7204-1 | |
Tris-HCl pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
Goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
5mC | Genway Biotech | GWB-BD5190 | |
5hmC | Active Motif | 39791 | |
LaminB1 | Abcam | Ab16048 | |
Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-225-1444 | |
Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-585-166 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Prolong Gold Antifade medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | |
Equipment | |||
MICRM HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 388114 | |
Confocal microscope | Zeiss |