Summary

Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9

Published: June 14, 2018
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para modificar genéticamente las células primarias o ampliadas humano naturales del asesino (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Mediante este protocolo, hemos generado las células NK humanas deficientes para el receptor 2 del factor de crecimiento-b de transformación (TGFBR2) y la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).

Abstract

CRISPR/Cas9 tecnología está acelerando ingeniería del genoma en muchos tipos celulares, pero hasta el momento, genes y modificación genética estable han sido difíciles en primarias células de NK. Por ejemplo, entrega de transgenes mediante transducción retroviral o lentivirales dio lugar a una producción limitada de ingeniería genética de las células NK por sustancial asociada a procedimiento NK apoptosis de las células. Aquí describimos un método libre de ADN para la edición del genoma de humanos primarias y ampliadas las células NK mediante complejos de ribonucleoproteína Cas9 (Cas9/RNPs). Este método permite eficiente nocaut del TGFBR2 y HPRT1 genes en las células NK. Datos de RT-PCR demostraron una disminución significativa en el nivel de expresión del gen, y un ensayo de citotoxicidad de un producto representativo de la célula sugiere que las células NK modificado de RNP se hizo menos sensibles a TGFβ. Células genéticamente modificadas podrían ser ampliada post-electroporación por estimulación con mbIL21-expresando irradiado células de alimentador.

Introduction

Inmunoterapia de cáncer se ha avanzado en los últimos años. Las células T antígeno quimérico genéticamente del receptor (coche) son un excelente ejemplo de ingeniería células inmunes desplegado en inmunoterapia del cáncer. Estas células fueron recientemente aprobadas por la FDA para el tratamiento contra CD19 + B de células malignas, pero éxito hasta el momento se ha limitado a enfermedades teniendo unos antígenos targetable y dirigidas a tal limitado repertorio antigénico son propensa al fracaso por escape inmune. Además, las células de T del coche se han enfocado en el uso de células de T autólogas debido al riesgo de enfermedad injerto contra – host causado por células T trasplante allogeneic. En contraste, las células NK son capaces de matar a objetivos de tumor de manera independiente del antígeno y no causan Eich, que hace un buen candidato para cáncer inmunoterapia6,7,8,9.

CRISPR/Cas9 tecnología ha sido utilizada recientemente en células inmunes ingeniería y reprogramar genéticamente las células NK con los plásmidos ha sido siempre un reto. Esto ha sido debido a las dificultades en la entrega del transgen de una manera dependiente de ADN como transducción retroviral y lentivirales causando sustancial asociada a procedimiento NK apoptosis de las células y la producción limitada de ingeniería genética de las células NK4 , 9.

Muchas células inmunes innatas expresan altos niveles de receptores para patrones moleculares asociados a patógenos como gen inducible por ácido retinoico me (RIG-I), que permiten una mayor reconocimiento de ADN extraño. Supresión de estas vías ha permitido una mayor eficiencia de transducción en las células NK al utilizar métodos basados en DNA para la modificación genética10.

Aquí describimos el método para el uso de un genoma de ADN libre edición de primarias y expansión humana las células NK utilizando complejos de ribonucleoproteína Cas9 (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs se compone de tres componentes, recombinante proteína Cas9 complexed con sintético RNA solo guía conformada por un complejo crRNA y tracerRNA. Estos Cas9/RNPs son capaces de unirse genómicas objetivos con mayor eficiencia en comparación con los enfoques de ADN-dependiente extranjeras debido a su entrega como complejos funcionales. Además, separación rápida de Cas9/RNPs de las células puede reducir los efectos off-target como inducción de la apoptosis. Por lo tanto, puede utilizarse para generar knock-out o knock-ins cuando se combina con el ADN por recombinación homóloga6,7. Demostramos que la electroporación de Cas9/RNPs es un método fácil y relativamente eficiente que supera las limitaciones anteriores de modificación genética en las células NK.

TGFβ es una citocina inmunosupresora importante, que inhibe la activación y funciones de las células NK. Se ha sugerido que dirigidas a la vía TGFβ pueden aumentar las funciones inmunes celulares. Hemos dirigido la región codificación ectodominio TGBR2 que une TGFβ11. Resultados representativos muestran una disminución significativa en el nivel de expresión del mRNA de este gen y además demuestran que las células NK modificadas volverse resistentes a los TGFβ. Además, las células modificadas retienen la viabilidad y potencial proliferativo, son capaces de ser post-electroporación ampliada utilizando células de alimentador irradiados. Por lo tanto, el método siguiente es un enfoque prometedor para manipular genéticamente las células de NK para cualquiera más clínico o con fines de investigación.

Protocol

Buffy coats de donante sano se obtuvieron como material de la Central Ohio región Cruz Roja Americana. Esta investigación fue determinada para ser exento Investigación Hospital institucional Informe Junta de todo el país de los niños. 1. expansión y purificación de células NK humano Aislante PBMCs de la capa anteada12. Capa de 35 mL de muestra de la capa anteada en 15 mL de Ficoll-Paque. Centrifugar a 400 x g durante 20 minutos sin f…

Representative Results

Eficiencia de electroporación Para optimizar la electroporación de Cas9/RNPs, probamos 16 programas diferentes con transducción de siRNA dirigidas no a GFP y plásmido de ADN en las células NK. Análisis de citometría de flujo mostraron que los EN-138 tenía el mayor porcentaje de viabilidad y transducción de la eficiencia de las células (células GFP vivo positivo de 35%) para ambas partículas (<strong cla…

Discussion

Modificación de ADN-dependiente de las células NK ha sido desafiante4,9. Nosotros, por lo tanto, introduce directamente un complejo de ribonucleoproteína sintéticamente preformado (RNPs) y proteína Cas9 como purificado de la proteína primaria y ampliado de las células NK8. Este método nos permitió eliminar el recubrimiento de jales, y otros procesos transcripcionales y traduccional Iniciado por ARN polimerasa II, que puede causar …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconocemos Brian Tullius para su ayuda en editar el manuscrito.

Materials

RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15065 The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection.
Ficoll-Paque® PLUS GE Healthcare – Life Sciences 17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA Integrated DNA Technologies 1072532 TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA Integrated DNA Technologies Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest
Alt-R® Genome Editing Detection Kit Integrated DNA Technologies 1075931 Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls.
Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304-011
4D-Nucleofector™ System Lonza AAF-1002B
Human recombinant IL-2 Protein Novartis 65483-0116-07
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit Lonza V4XP-3032 Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips
Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus Dharmacon CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS Integrated DNA Technologies 1074181 Cas9 Nuclease
DNeasy® Blood & Tissue Handbook Qiagen 69504
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Calcein AM ThermoFisher C3099
TGFβ Biolegend 580706
Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human Integrated DNA Technologies 1072554 Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer.
IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) Integrated DNA Technologies 11-01-02-02
Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer Integrated DNA Technologies 1075915 Cas9 Electroporation Enhancer

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Naeimi Kararoudi, M., Dolatshad, H., Trikha, P., Hussain, S. A., Elmas, E., Foltz, J. A., Moseman, J. E., Thakkar, A., Nakkula, R. J., Lamb, M., Chakravarti, N., McLaughlin, K. J., Lee, D. A. Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins. J. Vis. Exp. (136), e58237, doi:10.3791/58237 (2018).

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