Neurogenese met behulp van P19 embryonale carcinoom cellen
Summary
De P19 Mouse embryonale carcinoom cellijn (P19 cellijn) wordt veel gebruikt voor het bestuderen van het moleculaire mechanisme van neurogenese met grote vereenvoudiging in vergelijking met in vivo analyse. Hier presenteren we een protocol voor retinoïnezuur-geïnduceerde neurogenese in de P19 cellijn.
Abstract
De P19 cellijn afgeleid van een muis embryo-afgeleid teratocarcinoom heeft de mogelijkheid om onderscheid te maken in de drie kiem lagen. In aanwezigheid van retinoïnezuur (RA), de suspensie gekweekte P19 cellijn wordt geïnduceerd om te differentiëren in neuronen. Dit fenomeen wordt uitgebreid onderzocht als een neurogenese-model in vitro. Daarom, de P19 cellijn is zeer nuttig voor moleculaire en cellulaire studies in verband met neurogenese. Echter, protocollen voor Neuronale Differentiatie van P19 cellijn beschreven in de literatuur zijn zeer complex. De methode die in deze studie is ontwikkeld, is eenvoudig en zal een rol spelen in het verhelderend zijn van de moleculaire mechanismen in neuroontwikkelingsafwijkingen en neurodegeneratieve ziekten.
Introduction
Tijdens de embryonale ontwikkeling wordt een enkele cellaag omgezet in drie afzonderlijke kiem lagen1,2,3. Om de onderzoeksinspanningen van verschijnselen die zich in vivo voordoen te vergroten, is het genereren van driedimensionale aggregaten (embryonale lichamen) ontwikkeld als een handig model. Cellulaire aggregaten die op deze manier worden gevormd, kunnen worden blootgesteld aan verschillende aandoeningen die celdifferentiatie veroorzaken, die de ontwikkeling van het embryo4,5weerspiegelen. De P19 Murine embryonale carcinoom cellijn (P19 cellijn) wordt vaak gebruikt als een cellulaire model voor neurogenese studies in vitro6,7,8. De P19 cellijn vertoont typische pluripotente stamcel functies en kan zich onderscheiden in neuronen in de aanwezigheid van retinoïnezuur (RA) tijdens celaggregatie gevolgd door neuriet uitgroei onder aanhangers van voorwaarden. Bovendien is de ongedifferentieerde P19 cellijn ook in staat om spier-en cardiomyocyt-achtige cellen te vormen onder invloed van dimethylsulfoxide (DMSO)9,10,11,12.
Veel methoden13,14,15,16 zijn gemeld voor neuronale differentiatie, maar de methodologie is soms ingewikkeld en niet gemakkelijk te begrijpen door alleen het lezen van de beschrijvingen. Bijvoorbeeld, protocollen vereisen soms een combinatie van Dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium (DMEM) medium aangevuld met een mengsel van kalf serum (CS) en foetaal runderserum (FBS)13. Bovendien, media die worden gebruikt voor neuronale ontwikkeling zijn vaak samengesteld uit neurobasal en B27 supplementen13,14,15,16. Als zodanig, bestaande methoden bevatten complexiteit in hun voorbereiding en ons doel hier is om de protocollen te vereenvoudigen. In deze studie, we hebben aangetoond dat DMEM met FBS kan worden gebruikt voor het handhaven van de P19 cellijn (DMEM + 10% FBS) evenals voor neuronale ontwikkeling (DMEM + 5% FBS + RA). Deze vereenvoudigde methode voor neurogenese met behulp van de P19 cellijn stelt ons in staat om het moleculaire mechanisme van hoe neuronen worden ontwikkeld bestuderen. Bovendien, onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer wordt ook uitgevoerd met behulp van P19 cellijn17,18, en wij geloven dat de in deze studie ontwikkelde methode een rol zal spelen in het verhelderend moleculaire mechanismen in neuroontwikkelingsafwijkingen en neurodegeneratieve ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor neurogenese met behulp van de P19 cellijn. Hoewel veel rapporten zijn gepubliceerd in dit verband, een gedetailleerde methodologie voor neurogenese inductie met behulp van P19 cellijn blijft onduidelijk. Bovendien gebruikten we een eenvoudige hoge glucose (4.500 mg/L) DMEM medium met 10% FBS voor het hele experiment. Dit liet ons toe om het neurogene experiment op een gebruiksvriendelijke manier uit te voeren en het gebruik van deze methode voor de toekomst uit te breiden.<…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd financieel gesteund door het National Science Centre, Polen (Grant No. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) en KNOW (leidend nationaal onderzoekscentrum) wetenschappelijk consortium “gezonde dieren veilig voedsel”, besluit van het ministerie van Wetenschappen en hoger onderwijs No. 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
Referenzen
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488 (2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).
- Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Entwicklungsbiologie. 371 (2), 170-179 (2012).
- ten Berge, D., et al. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway. Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).
- Lin, Y. T., et al. YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway. Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).
- Neo, W. H., et al. MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression. Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).
- Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
- McBurney, M. W., Rogers, B. J. Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns. Entwicklungsbiologie. 89 (2), 503-508 (1982).
- Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).
- Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells. Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).
- Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity. Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).
- Babuska, V., et al. Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation. Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).
- Monzo, H. J., et al. A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells. Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).
- Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity. BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).
- Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells. Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).
- Tsukane, M., Yamauchi, T. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).
- Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation. Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).
- Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
- Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).
- Hamada-Kanazawa, M., et al. Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid. FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).
- Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons. Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).
- Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters. Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).
- MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neurowissenschaften. 80 (2), 487-499 (1997).
- Hong, S., et al. Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).
- Wenzel, M., et al. Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells. FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).
- Harada, Y., et al. Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).
- Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum. Neurowissenschaften. 58 (4), 753-763 (1994).
- Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line. Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).
