Engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas
Summary
Nós descrevemos um método para engenheiro um retina tecido composto de células epiteliais de pigmento retinal derivadas de células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em cima de membrana amniótica humana e sua preparação para enxertia em modelos animais.
Abstract
Diversas condições patológicas do olho afetam a funcionalidade e/ou a sobrevivência do epithelium retinal do pigment (RPE). Estes incluem algumas formas de retinite pigmentosa (RP) e degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Terapia celular é uma das estratégias mais promissoras terapêuticas propostas para curar estas doenças, com já incentivando os resultados preliminares em seres humanos. No entanto, o método de preparação do enxerto tem um impacto significativo em seus resultados funcionais em vivo. Com efeito, as células RPE enxertadas como uma suspensão de células são menos funcionais do que as mesmas células transplantadas como um tecido da retina. Aqui, descrevemos um método simples e reprodutível para engenheiro RPE tecido e sua preparação para a implantação na vivo . As células RPE derivadas de células-tronco pluripotentes humanas são semeadas sobre um suporte biológico, a membrana amniótica humana (presunto). Comparado aos andaimes artificiais, este apoio tem a vantagem de ter uma membrana basal que é perto da membrana de Bruch, onde as células RPE endógenas estão conectadas. No entanto, sua manipulação não é fácil, e desenvolvemos várias estratégias para seu cultivo adequado e preparação para enxertia em vivo.
Introduction
RPE é crucial para a sobrevivência e a homeostase dos FOTORRECEPTORES com o qual é fortemente associado1. Diversas condições patológicas alteram a sua funcionalidade e/ou sobrevivência, incluindo RP e AMD.
RP é um grupo de mutações herdadas de monogénicas que afetam as funções de fotorreceptores, células RPE ou ambos os2,3. Estima-se que as mutações que afetam especificamente o RPE células conta para 5% da RP2. AMD é outra condição onde a camada RPE é alterada, perda de visão, em última análise, a central principal. AMD é causada pelas complexas interações de fatores genéticos e ambientais e afeta os idosos4,5,6. De acordo com projeções, a AMD vai ser uma preocupação para os pacientes 196 milhões em todo o mundo por 20207. Para estes distúrbios, não existe nenhuma cura eficaz e uma das estratégias propostas é o transplante de células RPE novos para compensar mortos/não-funcionais preexistente RPE células8.
O modo de formulação do produto final a ser enxertado é essencial para garantir os melhores resultados funcionais. As células RPE injetadas como uma suspensão de células, apesar de ser um método fácil e simples de entrega, aumentar as preocupações em relação a sua sobrevivência, integração e funcionalidade9,10,11,12 , 13. cientistas desenvolvem-se mais complexas formulações para entregar engenharia tecido retinal9,13,14,15,16. Neste contexto, desenvolvemos um método original para gerar em vitro tecido RPE que poderia ser usado para transplante9.
Os bancos de células RPE derivados de células-tronco embrionárias humanas (ES) são usados no presente protocolo. No entanto, a alternativa RPE celular bancos de fontes diferentes células (células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, as células RPE primárias, etc.) e diferenciados com um método diferente também são adequados para este protocolo. Diferenciação dirigida inclui protocolos usando citocinas e/ou pequenas moléculas17,18,19,20,21,22.
Para ser transplantado, o tecido projetado deve ser preparado em um andaime. Nos últimos anos, andaimes diferentes foram desenvolvidos com base em um polímero ou em uma matriz de origem biológica13,23,24. Aqui, o substrato biológico utilizado é o presunto, mas outros substratos, como membranas de Bruch desnudas, poderiam ser implementados. O método aqui descrito tem a vantagem de usar um andaime biológico que é mais relevante para o ambiente nativo de RPE.
ES derivado de células RPE as células humanas são cultivadas pelo menos 4 semanas para ser totalmente organizado como uma monocamada de paralelepípedos. Nessa fase, o epitélio obtido é funcional e polarizada9. Finalmente, como este tecido enruga facilmente, ele é incorporado em uma camada fina de uma operadora de hidrogel para dar mais rigidez e elasticidade e para protegê-lo durante o procedimento de injeção. Este produto é então armazenado em 4 ° C até enxertia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um método para a cultura de células RPE sobre um andaime biológico e sua preparação para implantação em modelos animais. Uma das etapas críticas do protocolo é a manutenção da orientação do presunto por todo o procedimento até sua inclusão em gelatina. Com efeito, é removido o epitélio nativo da membrana e sua membrana basal torna-se exposto9. As células RPE possuem ser semeado em cima desta membrana basal. Após a preparação para a incorporação de gelatina, …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer Jérôme Larghero e Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, França) para a sua entrada durante a instauração do método descrito aqui.
Este trabalho foi apoiado por concessões do ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], o Fondation pour la Recherche Médicale [programa de Bio-Engenharia – DBS20140930777] e do LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau e Christelle Monville. Era apoiado por NeurATRIS, uma infra-estrutura de pesquisa translacional (Investissements d’Avenir) para biotherapies em Neurociências [ANR-11-INBS-0011] e INGESTEM, a infra-estrutura nacional (Investissements d’Avenir) engenharia para pluripotentes e células-tronco diferenciadas [ANR-11-INBS-000] para Christelle Monville. Karim Ben M’Barek foi apoiado por bolsas de Stempole DIM e LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73]. -Tronco faz parte do Instituto de doenças raras, apoiada pela Association Française contre les miopatias (AFM) Biotherapies-Téléton.
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
Referenzen
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration–emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M’Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M’Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet’s membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
