Algılama düşük kopya sayısı Vitro hepatit B enfeksiyonu tarafından kurulan entegre Viral DNA

1. hücre enfeksiyon ve DNA ekstraksiyon Kültürlü Huh7-NTCP hücreleri8,9 , Dulbecco’nın modifiye kartal Orta (% 10 v/v fetal Sığır serum, 1 x penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile takıma DMEM) korumak.Not: Bu daha önce ayrıntılı40rapor edildi. Tohum 2 x 105 hücre/mL Huh7-NTCP hücreleri ile DMEM 1 mL 12-şey plaka. Hücre tedavileri (Örneğin, HBV inhibitörleri) sınama olumlu sonuçlanırsa, onları kültür süpernatant 4 h (1 gün önceden HBV enfeksiyonu) tohum sonra uygulanır. Bir negatif kontrol için 200 uygulamak nM Myrcludex B (bir güçlü HBV giriş inhibitörü41). Heparin sütunlu saf42 süpernatant HepAD3843 üzerinden bir inoculum 1000 VGE/hücreye kültür ortamının (DMEM % 10 v/v fetal Sığır serum, 1 x penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin ve % 2.5 v/v ile takıma 500 µL hücreleri enfekte için kullanın DMSO), [1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x içinde çözünmüş] % 4 w/v Polietilen glikol 8000 içeren. Hücreleri (%5 CO2 ve % 90 nem ayarla) 37 ° C kuluçka kültür. 1 mL steril 1 x PBS 16-24 h sonrası enfeksiyon, iki kez hücrelerle yıkayın. Kültür ortamı her 2 günde HBV enfeksiyonu hasat kadar takip değiştirin. 3. gün sonrası enfeksiyon 5 µM Tenofovir disoproxil ve 10 µM hücrelerle tedavi lamivudin invPCR tarafından amplifiable HBV ikileştirici ara ürün imalatı sınırlamak için. 5. gün sonrası enfeksiyon, tripsin-EDTA 200 µL hücrelerle trypsinize ve onları da 5 µM Tenofovir disoproxil ve 10 µM içeren (% 10 v/v fetal Sığır serum, 1 x penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile takıma) DMEM 2 mL resuspend Lamivudin. Hücre süspansiyonlar (hangi HBV cccDNA44 ve amplifiable diğer HBV DNA ara ürün kaybı ikna etmek için invPCR tarafından bildirilmiştir) mitoz bir tur ikna etmek için 6-şey plaka aktarın. 7. gün sonrası enfeksiyon, tripsin-EDTA 400 µL genişletilmiş hücrelerde trypsinize ve karışımı 1 mL DMEM resuspend. Süspansiyon bir 1,5 mL tüp içinde yer, hücreleri tarafından Santrifüjü 500 x g 5 min için de cips ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. (İsteğe bağlı) Kadar DNA ekstraksiyon için hazır hücre granül-20 ° C’de depolayın. DNA üreticinin talimatlarına göre bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak hücre Pelet ayıklayın. Optik Dansitometresi kullanarak son DNA toplama tahmin ediyoruz.Not: DNA 100 μL elüsyon birimindeki genellikle ~ 250-400 verimidir ng/μL. 2. DNA’ın ters çevirme Aliquot ~1.5–2.5 μg toplam DNA’ın özü adım 1 200 μL PCR tüp içine. Restriksiyon enzimi master-mix 1 x Özet tepki arabellek içeren 40 μL tepki birimini neden uygun miktarda ekleyin (Örn., CutSmart arabellek) ve 10 U Ncoben-HF. Tepkiler iyice karıştırın ve bir küçük tüp santrifüje spin aşağı. Restriksiyon enzimi tepki olarak 37 ° C’de bir PCR makinesi en iyi sindirim verimlilik için 1 h için kuluçkaya. Restriksiyon enzimi 20 dk 80 ° C’de kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz. 1.5 mL tüp için tüm Restriksiyon enzimi tepki aktarın. 1 x T4 DNA ligaz arabellek ve 500 U T4 DNA ligaz 400 μL ekleyip iyice karıştırın. Büyük tepki birim sindirilir DNA parçalarının içi (aksine arası moleküler) moleküler ligasyonu teşvik eder. Tüp ligasyonu tepki tam birleştirmesini sağlamak 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya. T4 DNA ligaz 70 ° c 20 dk için devre dışı bırakabilirsiniz. % 10 w/v Sodyum Lauryl Sülfat T4 ligaz tam inactivation emin olmak için 10 μL ekleyin. Tüpler nabız vortexing tarafından mix ve kısa bir süre tepki karışımı spin. NaCl 100 mM ve dextran (35-45 kDa) son bir konsantrasyon 90 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Tüpler nabız vortexing tarafından mix ve kısa bir süre tepki karışımı spin. INVERSION tarafından 900 μL % 100 etanol ve karışımı ekleyin. -20 ° C’de DNA gecede çökelti. Pelet zarlarını DNA tarafından Santrifüjü 14.000 x g 15 dakika süreyle de kaldırmak süpernatant aspirasyon P200 pipet ile tarafından. 14.000 x g 15dk için de % 70 v/v etanol ve Santrifüjü 500 μL ile Pelet yıkayın. Etanol aspirasyon P200 pipet ile çıkarın. DNA Pelet, oda sıcaklığında 20 dakika kuruması. H2O. Ekle 20 μL bir Restriksiyon enzimi master için Özet tepki arabellek x 1, 5 BSIHKAI U ve 5 Sph-HF. Incubate U içeren bir 40 μL tepki hacmindeki neden mix-20 μL Pelet Restriksiyon enzimi tepki olarak dağıtılması bir ısı-blok 37 ° c ( Sphben-HF için en uygun sıcaklık) 1 h için. Kısa bir süre tepki karışımı spin. Restriksiyon enzimi tepki 65 ° c ( BSIHKAI için en uygun sıcaklık) 1 h için bir ısı bloğundaki kuluçkaya. Kısa bir süre tepki karışımı spin. -20 ° C’de ters DNA sonraki adım kadar saklayın. 3. iç içe PCR Potansiyel amplicons bir yeniden kullanılabilir silikon mat mühür bir DNA bozulması çözümünü kullanarak kaldırmak, mat DNA ücretsiz su ile iyice durulayın ve oda sıcaklığında PCR karışımı hazırlarken kuruması. 1 mL 1 x PCR Mix dış ileri içeren hazırlamak (5′-TTC GCT TCA SKK CTG CAC G-3′) ve ters (5′-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3′) 0.5 µM bir konsantrasyon, astar. 1 x PCR Mix 170 μL wells A1 ve E1 bir 96-şey PCR plaka ekleyin. 1 x PCR karışımı 120 μL wells B1 H1 için ekleyin. Ters DNA’ın 10 μL–dan adım 2 A1 ve E1 wells için Ekle (2 farklı ters örnekleri analiz aynı PCR plaka üzerinde). Hamuru hafifçe her biri hakkında 10 kez pipetting tarafından her şey tepki için 100 μL ayarla P1000 kullanılarak. Seri olarak seyreltik örnekleri oranı 1:3 her adımda 60 μL aktararak A1 D1 için Kuyu yapımı. Her adımda wells yavaşça onları 10 kat için 100 μL ayarla P1000 kullanma hakkında pipetting tarafından karıştırın. Kabarcıklar oluşturan kaçının. Aşağı iyi H1 sulandrarak 3.6 iyi E1 için adımları yineleyin. Aliquot 10 μL bir çok kanallı pipet içine kuyu A2-H2, A3-H3, A1-H1 kuyulardan wells A12-H12 96-şey plaka erişene dek filtreler tepki karışımı. PCR plaka ile sıkıca basarak adım 3.1, Kuru silikon mat kapak. Plaka PCR makinesinde yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştır: 10 min 95 ° c; 15 35 döngüleri s 95 ° c, 15 s 54 ° C ve 3 dak 72 ° c; 7 dk. 72 ° c; ardından, plaka oda sıcaklığında tutun. 96-pin Çoğalıcı eliydi Bunsen burner ile için iğne ısı ve oda sıcaklığında en az 5 min için serin. İkinci PCR plaka kuyu ile 1 x PCR mix (jel yük hazır arabellek içeren) ve iç ileri 10 μL doldurun (5′-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3′) ve ters (5′-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3′), 0,5 µM. Dikkatle ilk turda PCR 96-şey plaka PCR tabak silikon mat kaldırmak ve çapraz bulaşma kuyular arasında kaçının. Soğutmalı Çoğalıcı 96-şey plaka PCR ürünlerinin ilk turda PCR yeni bölünmemeli 96-şey plakasına aktarmak için kullanın. İlk denatürasyon adım 95 ° C’de 10 dakika için 2 dk değiştirme dışında adım 3,8, olduğu gibi aynı koşullar kullanarak iç içe geçmiş PCR yerine getirir. 4. PCR ürünü yalıtım ve jel çıkarma PCR ürünlerinin % 1.3 w/v özel jel ile 96-iyi kullanarak jel elektroforez tarafından analiz. 100 mL özel jel için 200 V 10-15 dk için çalıştırın. Tek kullanımlık içme kamış kullanarak özel jelleri DNA grup tüketim. Her PCR ürününün saman yerleştirin ve özel jel 1,5 mL tüp içine takın ve boyuta saman makasla kesme.Not: Sadece tek PCR ürünleri çözülebilir dilutions grup izole etmek yeterlidir. (İsteğe bağlı) Tüpler daha sonra çıkarılması için-20 ° C’de depolayın. Özel prizler her tüpün içine saman parçası ucunda sıkarak dışarı atmak. 300 μL jel ayıklama arabelleği ve jel ayıklama cam boncuk Bulamaç 5 μL her tüp için ekleyin. PCR ürünleri (hariç yarım-birimleri adımları yıkama için kullanma) jel ekstraksiyon kiti için üreticinin yönergelerine göre ayıklamak ve boncuk ile su 30 μL DNA’dan elute. Saf DNA Sanger için gönderin (üreticinin yönergeleri göre) sıralama ikinci turda kullanılan ileri astar ile iç içe PCR. 5. dizi analizi Virüs-hücre DNA kavşak (tüm nükleotid koleksiyonuna hizalama varsayılan ayarları kullanarak) nükleotit patlama analizi gerçekleştirerek onaylayın.Not: Temsilcisi sonuçları Şekil 3 ‘ te aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Dizinin kısmi hizalama gözlenen yalnızca, trim 5’ HBV DNA dizisi bir patlama analiz yeniden çalıştırmadan önce. Belirli bir sıra gerçek entegrasyon kavşak aşağıdaki gibi ifade ediyorsa belirlemek için sıkı seçim ölçütleri uygulayın: Sadece içeren dizileri içerir > 20 bp emin eşlemek için hücresel genom hücresel dizisi. Kısıtlama siteleri 10 sözde virüs-hücre tümleştirme Kavşağı, onlar büyük olasılıkla temsil vitro ligasyonu olaylar olarak bp yerine içinde gerçek entegrasyon kavşak kullanılan herhangi bir enzim içerir herhangi bir sıraları dikkate almayın. Bu büyük olasılıkla eserler sıralama reaksiyonu sırasında çapraz bulaşma tarafından üretilen olarak herhangi bir sıralarıyla bariz birbirine benzemeyen en yüksek floresans seviyeleri sözde tümleştirme Kavşağı’nda sıralama Kromatograflar, her iki tarafında göz ardı veya kapiller Kromatografi. Bu tam HBV ve virüs hücreli kavşağında hücresel dizileri ile benzersiz tümleştirme olayları tanımlamak.Not: Benzersiz tümleştirme olaylar tekrarı (ki negatif kontrol reaksiyonlar, daha fazla temsilcisi sonuçlarında detaylı kullanarak test PCR sırasında bu entegrasyonlar ve çapraz bulaşma içeren hücre klonal genişlemesi neden olabilir aşağıda). Homolog olmayan yollar son katılma kullanılan15olarak tekrarlanan entegrasyonlar belirli hücresel dizileri içine her tümleştirme olay için farklı HBV terminal siteleri görüntülemek için bekleniyor. Entegrasyon frekans seyreltme faktörü ters DNA şablonları virüs hücreli kavşaklar, normalleştirme tarafından toplam DNA giriş miktarı ters tepki izleyen bu seyreltme algılanan sayısıyla çarparak hesaplar. Genel olarak, entegrasyon sıklığıdır 1:10 sırasına4 hücreleri.