Dieses Protokoll beschreibt die kovalente Immobilisierung von Proteinen mit einer Heterobifunctional Silan Haftvermittler auf Siliziumoxid Oberflächen für die atomic Force Mikroskopie basierend Einzelmolekül Kraft Spektroskopie entwickelt die am Beispiel der Interaktion von RrgA (Pilus-1 Tipp adhäsin des Streptococcus Pneumoniae) mit Fibronektin.
In den letzten Jahren basierte Rasterkraftmikroskopie (AFM) Einzelmolekül-Kraft-Spektroskopie (SMF) erweitert das Verständnis der molekularen Eigenschaften und Funktionen. Es gab uns die Möglichkeit, eine Vielzahl von biophysikalischen Mechanismen, z. B., wie bakterielle Adhesins binden an Host Oberfläche Rezeptoren genauer zu erkunden. Neben anderen Faktoren hängt der Erfolg SMFS Experimente auf die funktionale und native Immobilisierung von Biomolekülen auf festen Oberflächen und AFM-Tipps. Hier beschreiben wir eine einfache Protokoll für die kovalente Kopplung von Proteinen zu Silizium-Oberflächen mit Silan-PEG-Carboxyls und die etablierten N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) Chemie in Ordnung Das Zusammenspiel von Pilus-1 adhäsin RrgA aus dem gram-positiven Bakterium Streptococcus Pneumoniae (Streptococcus Pneumoniae) mit der extrazellulären Matrix Protein Fibronektin (Fn) zu erkunden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Oberfläche Funktionalisierung zu einer homogenen Verteilung der Fn auf der Glasoberfläche und eine entsprechende Konzentration von RrgA auf der AFM Cantilever Spitze, offensichtlich durch den Zielwert von bis zu 20 % der Interaktion Ereignissedes SMFS führt Messungen und ergab, dass RrgA mit einer mittleren Kraft von 52 pN an Fn bindet. Das Protokoll kann Paar über bestimmte freie Thiol Websitegruppen eingestellt werden. Dies führt zu einer vordefinierten Protein oder Molekül Ausrichtung und eignet sich für andere biophysikalischen Anwendungen neben dem SMF.
Neben optischen und magnetischen Pinzette der Rasterkraft-Mikroskop (AFM)1,2 entstanden als ein nützliches Tool zum Analysieren und Bearbeiten von Molekülen und Sonde, ihren Eigenschaften und Funktionen, einschließlich ihrer Reaktion auf externe Kraft3 ,4. Im Gegensatz zu Methoden wie das Enzym verknüpften Immunosorbentprobe Assay (ELISA), Oberfläche Plasmon-Resonanz (SPR) oder Quarz Kristall Mikrowaage (QCM) Setups, AFM ermöglicht zu Interaktionen auf die einzelnen Moleküls (SMF)5 und Einzelzelle (SKSF)6 Messen . Diese Technologien ergab wertvolle Einblicke in die Bindung Mechanismen wie die Fang-Anleihen für die Interaktion von E. Coli Pilus Protein FimH mit Mannose7oder Tandem β-Reißverschluss wiederholt durch Fn-bindende Proteine aus S. Aureus gebildet gefunden bei der Bindung an Fn8. Wir waren vor kurzem in der Lage zu zeigen, dass der Pilus-1 adhäsin RrgA9,10 aus dem gram-positiven Bakterium Streptococcus Pneumoniae (Streptococcus Pneumoniae)11 ist in der Lage, an Fibronektin12 binden mit seinen zwei terminal-Domains. Dies ergab einen neuen zwei-Domain Bindungsmechanismus unterscheidet sich von der Tandem-β-Reißverschluss und Piliated Pneumokokken zu bilden und zu pflegen eine vorübergehende Kontakt zum Fibronektin-haltigen Host Oberflächen13ermöglichen kann.
Der Erfolg des SMFS Experimente hängt entscheidend von der funktionalen und native Immobilisierung von Biomolekülen auf festen Oberflächen und AFM-Tipps. Wie hohe Kräfte bei SMFS Messungen auftreten können, sollte die Proteine bevorzugt kovalent an die Oberfläche gekoppelt. Es gibt eine große Anzahl von verschiedenen Kupplung Methoden für die Immobilisierung von Proteine und andere Biomoleküle als auch ganze Zellen auf (anorganisch) festen Oberflächen, Nano-Partikeln und anderen Geräten beschrieben in der Literatur14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Diese Protokolle machen oft gefährlicher Stoffe zu verwenden, sind schwer zu führen und/oder erfordern spezielle Ausrüstung (z.B. Plasma Reiniger). Eine einfache Möglichkeit, paar Moleküle auf Glas ist Befestigung eine dickere Polymerschicht Heterobifunctional Vernetzer mit einem Silan-reaktive Gruppe auf der einen Seite und einem Amin-reaktive Gruppe auf ihrer anderen Seite. Abhängig von der Anwendung der Haftvermittler können umfassen flexible Hydro-Kohlenstoffketten mit variabler Länge, z. B.., Polyäthylenglycol (PEG). Sie unterdrücken unspezifische Wechselwirkungen der modifizierten Oberflächen (z.B., hydrophobe, elektrostatische und van-der-Waals-Wechselwirkungen) und der gekoppelten Molekül Rotationsfreiheit vorsehen.
Hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll für die kovalente Kopplung von Proteinen enthält einen oder mehrere freie Aminogruppen (-NH2) Glas Oberflächen und Siliziumnitrid AFM Tipps über eine Heterobifunctional Ethoxy Silan-PEG-Carboxylgruppen (-COOH). Dieses Protokoll kann in SMFS Experimente, die beispielhaft ist basierend auf dem Zusammenspiel von RrgA und das extrazelluläre Matrix Protein Fn verwendet werden (siehe Abbildung 1 für eine Übersicht).
Der erste Schritt ist der Silanisierung der Oberfläche28,29,30,31. Es geht um die Hydrolyse der Ethoxy-Gruppen von der Haftvermittler um hochreaktive SiOH-Gruppen bilden. Diese können mit SiOH-Gruppen auf dem Substrat reagieren. In einem primären Kondensation Schritt, diese Silanolen Form Wasserstoffbindungen und ausgebreitet auf dem Substrat. In einer sekundären Kondensationsreaktion (das erfordert in der Regel Hitze oder Vakuum, um Wasser zu entfernen), Siloxan Anleihen gebildet werden. Daraus resultiert eine kovalent verbunden Organo-Silan-Schicht.
Der zweite Schritt ist die Kopplung von Proteinen zum funktionalen (-COOH) Gruppen, die aus dem Polymer-32erweitern. Erstens wird in eine reaktive N-Hydroxysuccinimid (NHS) Ester Mittelstufe, die durch die etablierten NHS/EDC gewonnen wird die Säure umgewandelt (1-Ethyl – 3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimid Chemie33 und erfährt Nucleophilen Substitution endlich eine Amid-Bindung mit primären Aminen der Proteine zu bilden.
Auf diese Weise RrgA mit Silizium-Nitrid-AFM-Tipps und menschlichen Fn auf Glassubstraten in einer wirrlage gekoppelt war und ihre Interaktion Kräfte wurden auf der Einzelmolekül-Ebene analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Oberflächenchemie zu einer homogenen Verteilung der Fn auf der Glasoberfläche und eine entsprechende Konzentration von RrgA an der Spitze, offensichtlich durch den Zielwert von bis zu 20 % der Interaktion Ereignissedes SMFS Messungen führt. Diese Chemie reduziert die unspezifischen Hintergrund Interaktionen, wenig Veränderung während der Datenerfassung unterliegt und eignet sich daher hervorragend für präzise SMFS Experimente.
Seit die Einführung des AFM SMFS basierend, entwickelte es sich zu eine weit verbreitete Technik, Intra- und intermolekularen Kräfte der einzelnen Proteine, Nukleinsäuren und andere Biomoleküle3,4,5direkt zu erforschen. Für erfolgreiche SMFS Experimente ist eine geeignete Oberfläche Kupplung Strategie eine Voraussetzung. Um die Intramolekulare Kräfte in natürlichen und synthetischen Polymeren Sonde, können die Polymere direkt auf die Substratoberfläche und AFM Tipp36,38,39,40,41gekoppelt sein. Für die Untersuchung von Inter molekulare Interaktionen, wie Molekulare Bindungen, aber es ist ratsam, flexible Linker Moleküle wie Hetero-bifunktionelle PEG linker oder Polypeptidketten, mithilfe der Interaktionspartner an die AFM-Spitze befestigen und die Substratoberfläche, um die korrekte Ausrichtung der Bindungspartner, Short-Range Oberfläche Kräfte zu überwinden und zur Vermeidung von Denaturierung und Entfaltung der Proteine21,22,23zu ermöglichen, 24,25,26,27,42. Wir beschrieben daher einfach und geradlinig Protokoll für die kovalente Immobilisierung der Proteine über ihre zugänglich primäre Amine mit Hetero-bifunktionelle PEG Abstandhalter.
Wir zeigten ihre Anwendbarkeit bei der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen adhäsin RrgA von S. Pneumoniae und das extrazelluläre Matrix Protein Fn, erst ausführlich beschrieben an anderer Stelle13.
Die Oberflächenchemie ist gut etabliert und analysiert und ähnliche Ansätze erfolgreich in mehreren SMFS Experimente19,42,43,44,45verwendet wurden. Die Silylether zur Kopplung des Silan Polymers an der Oberfläche ist abhängig von Hydrolyse. Der Grad der Hydrolyse hängt die Menge des gebildeten Siloxan-Anleihen, die während des Prozesses der Silanisierung gesteuert werden kann. Wenn hohe Wechselwirkungskräfte (≥ 1000 pN) während SMFS Messungen zu erwarten sind, sollte der Silanisierung durchgeführt über Dampf-Phase Deposition30 führt zu der Bildung von eine ununterbrochene Schicht der Siloxane. Wie bei vielen Experimenten (z.B. viele Protein-Protein-Wechselwirkungen) sind die Wechselwirkungskräfte im Bereich von wenigen hundert pN und das beschriebene Verfahren, in denen, das Siloxan Bildung erfolgt durch Ablagerung von einer wässrigen Phase und ungebunden Organo-Silane werden sorgfältig mit Ethanol (Schritt 1.1.7) gefolgt von Härtung mit Wärme (Schritt 1.1.8) abgewaschen, ist ausreichend.
Ein weiterer wichtiger Schritt ist, die restlichen EDC waschen und NHS-Moleküle aus der Oberfläche (Schritt 1.2.3), wie Reste der Aktivierung von Carboxylgruppen der Proteine führen werden. Dies kann entweder Ergebnis in Vernetzung von Proteinen auf der gleichen Fläche, die ihre Funktionalität verändern können oder kovalent paar aktiviert Proteine an andere Proteine auf der gegenüberliegenden Fläche. Dies kann zu spannen der Proteine zwischen der Oberfläche und der AFM-Spitze, führt zu hohen Bruch Kräfte, eventuell begleitet von Domäne Entfaltung führen (siehe Abb. 3 b, Spur 1, 4 und 5, Entfaltung des Fn-Domänen)46. Das gleiche Problem kann auftreten, wenn die aktive NHS Ester der PEG Abstandhalter ungesättigten übrig sind. Daher ist die Inkubation mit Tris gepufferte Kochsalzlösung (Schritt 1.2.6) empfohlen, da das primäre Amin Tris die restlichen reaktive Aminogruppen stillt.
Nach dem Protokoll schrittweise führt zu einer homogenen Verteilung der Fn auf dem silanisiert Glas Oberfläche (siehe Abbildung 2), so dass eine dimeres Form des Proteins. Dies ähnelt Fn´s Struktur in Lösung und steht im Einklang mit früheren AFM-Daten auf andere Probe Oberflächen37. Darüber hinaus wird eine entsprechende Konzentration des RrgA auf die AFM-Spitze erreicht, die erzeugt eines Zielwert von ~ 20 % der klar definierten Interaktion Ereignisse während des SMFS Messungen (Abbildung 3 und Abbildung 4). Eine andere elegante Möglichkeit, Steuern Sie die Anzahl der Moleküle gekoppelt mit der Probe Substrat und Cantilever Spitze neben unterschiedlichen Protein Konzentration und/oder Inkubation Zeit, ist die Kombination von Silan-Agenten mit unterschiedlichen sekundären Funktionsgruppen. Durch die Änderung des Verhältnis von Protein reaktivgruppen erstreckt sich von der PEG-Polymer, kann die Zahl der immobilisierten Proteine gesteuerte15,16,17,18.
Das hier beschriebene Protokoll einsetzbar auch anderen -NH2 enthaltenden Molekülen zu immobilisieren oder paar Proteine auf andere Siliziumoxid Fläche neben Glas und Siliziumnitrid angepasst werden. Abhängig von der Protein-Design der Amine reaktive Carboxylgruppe kann geändert werden zu einer Sulfhydryl reaktive Gruppe (z.B., Maleimide oder ortho-Pyridyl Disulfid) Protein über koppeln sein freies – SH-Gruppen. Für Fn führt dies zu einer vordefinierten Orientierung13,17,20.
Zusammenfassend lässt sich sagen dieses Protokoll kann angepasst werden, um verschiedenen Anforderungen zu bedienen und eignet sich für andere biophysikalischen Anwendungen neben Einzelmolekül-Kraft-Spektroskopie-Experimenten.
The authors have nothing to disclose.
TB und HG anerkennen, finanziellen Unterstützung durch den Europäischen Forschungsrat “Cellufuel, Advanced Grant Nr. 294438”. HCS erkennt finanziellen Unterstützung des Bundesministeriums für Bildung und Forschung durch die Innovationsallianz Technofunktionale Anthocyane (TeFuProt), SS erkennt finanzielle Unterstützung durch das Bayerische Staatsministerium für Wissenschaft und Bildung durch den Forschungsschwerpunkt “Zugespitzt Und Biophysikalische Charakterisierung Dreidimensionaler Gewebe – Galopp”. Wir danken Conny Hasselberg-Christoph und Martina Hörig für technischen support
Material | |||
2-Propanol | Carl Roth | 6752 | |
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | 03450 | EDC |
Acetic acid | Carl Roth | 3738 | 100 %; analytical purity |
Doubly distilled water | |||
Ethanol | Carl Roth | 9065 | ≥ 99.8 %; analytical purity |
Ethoxy silane polyethylene glycol acid | Nanocs | PG2-CASL-5k | 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3 |
Hydrochloric acid | Carl Roth | X896 | 32 % |
N-Hydroxysuccinimid | Merck | 804518 | NHS; for synthesis |
Phosphate Buffered Saline – Dulbecco | Biochrom | L1825 | PBS |
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma | Sigma-Aldrich | F1056 | |
Probe molecule e.g. RrgA | Produced in laboratory | ||
Sodiumchlorid | Carl Roth | 9265 | NaCl |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Carl Roth | AE15 | ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Beakers | |||
Glass cutter | |||
Glass slides | Carl Roth | 0656 | |
Inert gas desiccator | Sicco | ||
Inverted Microscope – Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | ||
JPK NanoWizard 1 | JPK Instruments | ||
JPK NanoWizard SPM and DP software | JPK Instruments | ||
Laboratory oven | Binder | ||
Magnetic stirrer | IKA | ||
Micro spatula | |||
Microcentrifuge tubes | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
Parafilm M | Brand | 701606 | |
Petri dishes | |||
pH-meter | Knick | ||
Pipettes | Starlab | 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl | |
Precision balance | Acculab | ||
Silicon nitride cantilever – MLCT | Bruker AXS S.A.S | Spring constant ≤ 100 pN/nm | |
Sonication bath | Bandelin | ||
Staining jar | |||
Stereo microscope – Zeiss Stemi | Zeiss | ||
Stir bar | |||
Kimtech science precision wipes | Kimberly-Clark | ||
Twezzers | |||
UV PenRay | UVP, LLC | 90-0012-01 | Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm |
Vacuum desiccator | |||
Vacuum pump | |||
Vortex mixer | VWR | ||
Weighing paper | Carl Roth | TP64 |