그대로 Glomeruli 성인 쥐 신장에서 분리 하는 효율적인 체질 하 방법

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 피츠버그의 대학에 의해 승인 되었습니다. 1입니다. 쥐 Glomeruli의 격리 살 균 1% 절연 버퍼를 준비 하려면 600 mL 비 커에 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 5 g을 추가 합니다. 비 커를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 500 mL를 추가 하 고 모든 BSA 해산 때까지 자석 교 반 봉으로 저 어. 살 균 필터 셀 문화 후드에서 1 %BSA / PBS 버퍼.참고: 살 균 1 %BSA / PBS 버퍼 1 주까지 4 ° C에서 보관할 수 있습니다. 2 ~ 4 Sprague-Dawley 쥐 150 ~ 200 g 무게를 얻을. 쥐를 통해 이산화탄소 흡입 챔버 볼륨 분당의 10-30%의 비율로 100% 이산화탄소 도입 챔버를 사용 하 여 안락사 호흡의 정지에 대 한 동물을 관찰 하 고 이산화 탄소에서에서 제거 하기 전에 눈 색깔을 버렸다. 70% 에탄올과 전방 복 부 위에 피부 준비를 발기, 머리 제거를 원하는 경우. 수술가 위 또는 메스를 사용 하 여 피부에 절 개를 중간 선을 확인 합니다. 내부 장기를 노출 하려면 근육 레이어를 통해 다른 중간 절 개를 확인 합니다. 안락사의 보조 방법으로 횡 경 막과 흉 골 또는 흉 곽을 통해 위에 절을 확장 합니다. 분리 하 고 두 신장 제거 살 균 50 mL 30 mL 행 크 스 버퍼링된 소금물 (HBSS) 얼음에의 플라스틱 원뿔 튜브에 배치.참고: 여러 쥐 같은 챔버에 안락사 수와 모든 신장 같은 원뿔 튜브에 놓일 수 있습니다. 살 균 세포 문화 후드 얼음과 전송에 신장 유지 하십시오. 무 균 배양 접시 얼음, 동안 또한 HBSS의 5 mL를 포함 하는 신장 전송 하 고 제거 하 고가 위 perirenal 지방 질을 삭제 날카로운 집게. 여전히 존재 하는 경우 또한 제거 하 고 작은 표면 절 개를 하 여 신장 주변 캡슐을 버리고 날카로운 집게를 사용 하 여 부드럽게 잡아당겨 기관에서.참고: 항상 얼음과 연습 내내 살 균 기술에 신장 분리를 유지. 멸 균 거 즈의 조각 장소에서 조작 하는 동안 신장을 질감된 표면으로 페 트리 접시에 놓일 수 있다. 신장 반으로 잘라 세로로 (midsagittal 섹션) 제거 하 고 삭제 HBSS의 5 mL와 함께 두 번째 페 트리 접시에 메스와 모 수 (이) 색상에 어두운. 신장 피 질은 주로, 나머지 조각 3 HBSS의 5 mL를 페 트리 접시에 전송 하 고 조각 크기, 1 m m 미만 또는 붙여넣기 구성 될 때까지 무 균 면도날으로 말하다. 위쪽 및 아래쪽 1 0 µ m 체의 젖은 BSA/500 mL 폐기물 비 커 위에 PBS. 이 단계는 중요 한 단백질으로 체 코트 고 수율 향상 됩니다 glomeruli의 부착을 감소 시킨다. 체의 작은 가장자리에 다진된 피를 놓고 얼음에 앉아 바닥 냄비에 체를 통해 조직 개썰매를 10 mL 주사기의 질감된 플런저 플랜지 (고무 인감 반대 측)를 사용 합니다. HBSS로 정기적으로 씻어 하지만 샘플 희석을 피하기 위해 가능한 한 조금 사용.참고: 버퍼 총, 더 여기에서 사용 될 수 있습니다만 25 mL의 30 mL을 초과 하지 마십시오. 체의 한 가장자리에 다진된 조직 배치에 대 한 이유는 전체 체 표면적 보다는 체의 일부에 대 한 노출을 제한 하 여 glomeruli의 준수를 줄이는 것입니다. 이것을 촉진 하기 위하여 체 린스를 바닥 냄비에 수집 하는 액체를 다시 사용 합니다. 체질 완료 되 면, 신중 하 게 느슨하게 붙어 있을 수 있습니다 어떤 glomeruli 잡으려고 팬의 바닥에서 1 %BSA / PBS 버퍼와 한 번 더 체의 바닥 세척. 20 G 바늘을 갖춘 여러 10 mL 주사기로 바닥 냄비에 액체의 모든를 수집 하 고 적어도 2 추가 번 바늘을 통해 전달. 마지막 컬렉션에 유지 glomeruli 포함 된 액체 주사기 90 µ m 체를 통과 하는 준비까지. 액체를 주사기에 저장 하는 동안 1 %BSA / PBS 폐기물 비 커와 젖은 상단와 하단 1 µ m 체의 홍 조에 의해 바닥 냄비를 씻어 BSA/PBS. 얼음 바닥 냄비 위에 체를 놓습니다. 위에 설명으로 다른 주사기 플랜지와 체 통해 주사기에 샘플 체와 개썰매의 한 가장자리에 적용 됩니다. 씻어 체에의 한 가장자리에 모든 것을 수집 하 하단 팬에서 솔루션. 체질 한 번 완료, 신중 하 게 단계 1.5.1로 체의 바닥을 씻어. 50 mL 플라스틱 원뿔 튜브에서 바닥 냄비에 모든 액체를 수집 합니다. 1 폐기물 비 커와 젖은 상단에 BSA/PBS %와 1 μ m 체의 하단 바닥 냄비를 씻어 BSA/PBS. 얼음 바닥 냄비 위에 체를 놓습니다. 체의 한쪽 가장자리에 샘플을 적용 됩니다. 액체는 쉽게 통해 흐름 해야 합니다. 1%의 최소한 20 mL와 상단을 통해 린스 폐기물 비 커에 BSA/PBS. 조심 스럽게 씻어도 체의 하단. glomeruli이 75 μ m 체 위에 유지 됩니다. HBSS를 사용 하 여 거꾸로 체 통해 rinsing 하 여 배양 접시에서 glomeruli 수집. 사용 하 여 필요에 따라 많은 HBSS 여기. 얼음에 하나 이상의 50 mL 플라스틱 원뿔 tube(s)로 수집 합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 1800 x g에서 centrifuge, 상쾌한 피 펫,으로 신중 하 게 제거 하 고 차가운 HBSS 10 mL에 펠 릿을 resuspend. 여러 개의 원뿔 관 1.7.2에서 수집 된 샘플을 결합 한다. 원심 분리 단계를 반복 합니다. 다음 단계를 진행할 준비가 될 때까지 HBSS의 5 ml에서는 glomeruli를 resuspend. 원하는 경우, 총 glomeruli 수 가져가 라. 이 피 펫과 10 µ L 샘플 고 유리 슬라이드에 드롭 장소. 와 확인 현미경, 계산 필드에서 glomeruli 및 500 총 수익률을 얻을 수를 곱하십시오.참고: 순도 tubules는 필드에서의 수를 계산 하 여 결정 될 수 있습니다 구조 glomeruli 및 관의 총 수를 나누어. 시야에 > 95 %glomeruli 있어야 한다. 중요 한 관 오염 있는 경우에, 단계 1.6.1 이후, 반복 하 고 씻어 때 1.7.1 단계 완료 있는지 확인 하십시오. 이것은 단계에 있는 관 오염 발생 하는. 2입니다. Glomeruli 부상 200 x g. HBSS 잘 당 약 9000 glomeruli는 총 수익률에 따라의 적절 한 금액에 Resuspend에서 내려 15 mL 플라스틱 원뿔 튜브에 스핀 glomeruli를 수집 합니다. 샘플의 450 µ L 24-잘 접시의 각 음에 플라스틱 또는 다운스트림 분석 실험에 맞는 모든 플레이트 포맷 필요 합니다.참고: 혼합 glomeruli 버퍼에 위쪽 및 아래쪽 Pipetting 균질 솔루션을 보장 합니다. glomeruli 매우 끈 적 하 고 무거운 및 것 이다 서로 게 충실 뿐 아니라 신속 하 고 튜브의 측면에는 솔루션의 하단에 정착. 황산 (PS) 솔루션 6 mg/mL protamine을 하려면 먼저 철저 하 게 15 mL 플라스틱 원뿔 튜브와 소용돌이에 40 ° C에가 열 하는 dH2O의 10 mL에 1 g PS의 분해. 솔루션의 30 µ L 고 dH2O의 470 µ L에 추가.참고:이 6 mg/mL 해결책을 생산할 예정 이다 그리고 아래에 설명 된 50 µ L 우물에 추가 됩니다, 최종 농도 0.6 mg/mL. 중복, protamine 황산의 50 µ L을 추가 (이것은 1시 10분 희석) HBSS (부정적인 제어)의 또 다른 그룹 50 µ L를 제공 하면서 한 그룹의 각 잘. 4 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어 Microcentrifuge 튜브 (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) 각의 내용을 아래로 회전 시키십시오 고 각 PBS의 1 mL로 두 번 씻어. 최종 세척에서 aspirate 하 고 PBS의 300 µ L에서 resuspend. 3 aliquots 단백질 격리, 전송 전자 현미경 (TEM) 시각화, 그리고 면역 형광 얼룩 (경우)에 대 한 준비를 분할 한다. 3. 분석을 위한 Glomeruli 준비 3 aliquots (g, 4 ° C, 10-15 s x 4000)와 나머지 버퍼에서 aspirate의 내용을 아래로 회전 하 고 가장, 샘플 분석을 진행 하면, 또는 단백질 격리. 가장에 대 한 처리 사 알 약 0.01 M PBS에 차가운 2.5%도 150 µ L를 수정 했다. 펠 릿, 펠 렛을 방해 하지 않도록 하는 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 다음 PBS로 그것을 씻어 서에서 신중 하 게는 정착 액을 제거 하 고 1% 칼륨 ferricyanide와 1% 오스뮴 tetroxide에서 포스트 수정. 에탄올의 등급된 시리즈를 통해 샘플을 탈수 (30, 50, 70, 90, 100, 100, 100%)와 다음 자료를 포함 하는 에폭시에 포함 하는 프로필 렌 산화물. 잘라 얇은 반 (300 nm)는 ultramicrotome에 섹션. 0.5%와 1% 나트륨 붕 산 염에 톨루이 블루 stain 고 가벼운 현미경 검사. 잘라 ultrathin 섹션 (65 nm), uranyl 아세테이트와 Reynold의 리드 시트르산, 얼룩 및 전송 전자 현미경에서 검사. IF에 대 한 처리 PBS 솔루션에서 12% 젤라틴의 150 µ L을 추가 하 고 즉시 드라이 아이스 펠 릿을 형성 하기에 놓습니다. 2 %paraformaldehyde / 1 500 µ L에 펠 릿을 담가 하룻밤 4 ° c.에 microcentrifuge 관에서 PBS x 기본 몰드에 펠 릿을 놓고 드라이 아이스에 최적의 절삭 온도 (10 월) 매체를 추가 하 여 포함 합니다. cryotome에 5-10 µ m 섹션을 잘라 고 면역 형광/immunohistochemistry 또는 표준 조직학 얼룩. 단백질 분리에 대 한 프로 테아 제 억제제의 1.5 µ L 함께 centrifuged 사 펠 릿 및 조직 균질과 dounce RIPA 버퍼의 150 µ L를 추가 합니다. 단백질 정량화 및 immunoblotting 또는 다른 단백질 분석을 진행 합니다.