ラット腎臓からそのまま糸球体を分離する効率的なふるい分け法

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ピッツバーグ大学のによって承認されています。 1. ラット糸球体の分離 滅菌 1% 分離バッファーを準備するには、600 mL のビーカーにウシ血清アルブミン (BSA) の 5 g を追加します。 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 500 mL をビーカーに追加、すべての BSA は解散まで磁気攪拌棒でかき混ぜます。 滅菌フィルター携帯文化フードで 1 %bsa/PBS バッファー。注: 滅菌 1 %bsa/PBS バッファーは、4 ° c で最大 1 週間保存できます。 150 に 200 g の重量を量る 2 に 4 Sprague-dawley ラットを取得します。 1 分あたり試験室の容積の 10-30% の割合で 100% の二酸化炭素は導入されたチャンバーを用いた炭酸ガス吸入を介してラットを安楽死させます。呼吸の停止のための動物を観察し、二酸化炭素から除去する前に目の色が色あせた。 70% エタノールで前方の腹部の上に皮膚を準備し、必要な場合に、髪を削除するバリカンを利用します。外科はさみやメスを用いて皮膚で正中切開を行います。内臓を公開する筋層を介して別の正中切開を行います。安楽死の副次的な方法として横隔膜と胸骨や肋骨を上方に切開を拡張します。 分離し両方の腎臓を摘出し、ハンクス バッファー塩溶液 (HBSS) 氷の上の 30 mL と 50 mL の滅菌プラスチック円錐管に配置します。注: いくつかのラットは同じ部屋で安楽死できるし、同じ円錐管に腎臓のすべてを配置できます。 無菌細胞文化フードに氷とトランスポートの腎臓を維持します。氷の上も HBSS、5 mL を含む滅菌シャーレに腎臓を転送し削除しハサミで腎周囲脂肪を破棄し、鉗子を鋭い。まだ存在する場合削除も、小さな表面的な切開することによって、腎臓を取り巻くカプセルを破棄し、シャープな鉗子を使用して優しく器官から引き抜きます。注: は常に全体氷と実践の無菌に腎臓分離を離さない。滅菌ガーゼのワンピースは、操作中に場所で腎臓を保持する織り目加工の表面としてペトリ皿に配置できます。 腎臓を半分に切って縦 (正中矢状セクション) を削除し、破棄 HBSS 5 mL で 2 番目のペトリ皿のメスと髄質 (暗い色である)。 サード HBSS 5 mL をシャーレに腎皮質は主に、残りの部分を転送し、部分が 1 mm 未満のサイズになるまで、またはペーストを形成するまで滅菌かみそりの刃でミンチします。 1% の 180 μ m ふるいの上下をウェット廃棄物 500 mL ビーカーに BSA/PBS。この手順は重要なタンパク質のふるいのコートし、収量を改善する糸球体の付着を軽減です。 ふるいの小さい端にみじん切りにした皮質を配置し、氷の上に座って鍋底にふるいを通して組織をドロドロに 10 mL の注射器の質感プランジャー フランジ (ゴム製シールの反対側) を使用します。HBSS で定期的に洗い、サンプル希釈を避けるために可能な限り少し使用します。注: よりここでは使用することができます 25 mL のみバッファー数 30 mL を超えないようにします。ふるいの 1 つだけ端にみじん切りにした組織を置くための理由は、全体のふるいの表面積ではなく、ふるいの一部への露出を制限することで糸球体の付着を減らすことです。 そのためには、ふるいを洗うとき下のパンに収集流体を再利用します。ふるい分けが完了する、慎重に緩く付着が糸球体をキャプチャする鍋の底から 1 %bsa/PBS バッファーをもう一度ふるいの下を洗います。 20 G 針装備いくつかの 10 mL の注射器に下のパンに流体のすべてを収集し、少なくとも 2 追加回針を通してそれを渡します。最後のコレクション 90 μ m ふるいを通過する準備ができるまで注射器で糸球体を含んでいる液を維持します。 流体は、注射器で格納されている、1 %bsa/PBS 廃棄物ビーカーにウェット トップと 1% の 90 μ m ふるいの下にフラッシュして鍋底を洗う BSA/PBS。氷の下のパンの上にふるいを置きます。 上記の説明と別の注射器フランジのふるいを通してふるいとドロドロの 1 つの端に注射器のサンプルを適用されます。ふるいの 1 つの端にすべてを収集するために鍋底からソリューションで洗ってください。 慎重にステップ 1.5.1 のようにふるいの下を洗い、一度ふるいが完了します。50 mL のプラスチックの円錐管の下のパンにすべての流体を収集します。 1 %bsa/PBS 廃棄物ビーカーとウェット上部に上下 1% の 75 μ m ふるいの鍋底を洗う BSA/PBS。氷の下のパンの上にふるいを置きます。 サンプルを篩の 1 つの端に適用されます。液体を簡単に通過する必要があります。少なくとも 20 mL の 1% でトップをすすぎ廃棄物ビーカーに BSA/PBS。同様にふるいの下に慎重に洗います。糸球体は、この 75 μ m のふるいの上に残ります。 HBSS を使用して、逆さまのふるいを通して洗浄によってペトリ皿で糸球体を収集します。必要に応じてできるだけ多く HBSS をここで使用します。1 つ以上 50 mL プラスチック円錐形の尿管に氷の上を収集します。 4 ° C で 5 分間 1800 × g で遠心分離、ピペットと慎重に上清を除去、冷たい HBSS の 10 mL にペレットを再懸濁します。複数の円錐管は 1.7.2 で収集された場合は、サンプルを組み合わせます。遠心分離のステップを繰り返します。 次のステップに進む準備ができるまでを 5 mL HBSS の糸球体を再懸濁します。 必要な場合は、総腎糸球体のカウントを取る。このため、ピペットで 10 μ L のサンプルを取る、スライド ガラスにドロップ。顕微鏡下で表示、カウント フィールドにおける腎糸球体および総収率を取得する 500 を掛けます。注: フィールドに見られる尿細管の数をカウントすることによって決定される純度、糸球体と尿細管の合計数で除算して構造。視覚的なフィールドに > 95% の糸球体があります。 重要な管状の汚染がある場合手順 1.6.1 以降を繰り返し、1.7.1 とき手順を完了を徹底的に洗浄することを確認します。これは、ステップ管状の汚染が最も発生しやすい。 2. 糸球体の損傷 ウェルあたり約 9,000 糸球体があるので合計収量に基づく HBSS の適切な量で再懸濁します 200 x g にダウン 15 mL プラスチック円錐管とスピンの球体を収集します。24 ウェル プレートの各ウェルに 450 μ L のサンプルをピペットまたは下流の試金に合った版のフォーマットが必要な。注: バッファーにおける腎糸球体をミックスする上下ピペッティング均一溶液を保証します。糸球体が非常に粘着性がある、重いと、お互いに固執し同様迅速かつチューブの側面にソリューションの下部に解決。 6 mg/mL のプロタミン硫酸塩 (PS) ソリューションをするためには、まず PS dH2O 徹底的に 15 mL プラスチック円錐管と渦で 40 ° C に加熱の 10 mL に 1 g を溶解します。ソリューションの 30 μ L を取るし、dH2O の 470 μ L を加えます。注: これは 6 mg/mL の溶液を生成、井戸の中に 50 μ L を追加すると下記のとおり、最終濃度が 0.6 mg/mL。 、重複してプロタミン硫酸 50 μ L を追加 (これは、1:10 希釈) HBSS (マイナス コントロール) の別のグループ 50 μ L を供給しながら、1 つのグループのそれぞれの井戸。 37 ° C で 4 時間プレートを孵化させなさい スピン ・ ダウン遠心チューブ (4000 x g、4 ° C、10-15 秒) で各ウェルの内容と PBS 各 1 mL で 2 回洗浄します。 最終的な洗浄を離れて吸い出しなさいし、300 μ L の PBS に再懸濁します。蛋白質の隔離、透過型電子顕微鏡 (TEM) の可視化、および蛍光抗体法 (IF) を汚すために準備する 3 つの因数に分割します。 3. 解析の糸球体を準備 スピン ・ ダウン 3 つの因数 (4000 g、4 ° C、10-15 秒 x) とバッファーの残りのオフ吸引の内容と TEM によるサンプル分析に進む場合、または蛋白質の隔離。 透過電子顕微鏡用処理 0.01 M PBS で冷たい 2.5% グルタルアルデヒドの 150 μ L の糸球体のペレットを修正します。ペレット、ペレットを破壊することを確かめて、パスツール ピペットを使用して、PBS で洗浄から、定着剤を慎重に削除し、フェリシアン化カリウム 1% で 1% オスミウム四酸化の修正後。 エタノールの傾斜シリーズを通して試料を脱水 (30、50、70、90、100、100、100%)、酸化プロピレン、エポキシ材を埋め込むことに埋め込みます。 厚切カット (300 nm)、ウルトラミクロトームにセクション。0.5% 1% ホウ酸ナトリウムのトルイジン ブルー染色および光学顕微鏡の下でそれらを調べる。 超薄切片をカット (65 nm)、酢酸ウランとレイノルドの鉛のクエン酸、それらを染色、電子顕微鏡で調べる。 場合の処理 PBS 溶液 12% のゼラチンの 150 μ L を追加、すぐにドライアイス ペレットを形成します。ペレットに漬 500 μ L 2% パラホルムアルデヒド/1 の 4 ° C で一晩微量遠心チューブに PBS x 基本型のペレットを置き、ドライアイスの上最適な切削温度 (OCT) 媒体を追加することによって埋め込みます。Cryotome に 5-10 μ m のセクションをカットし、蛍光抗体/免疫組織化学または標準組織学的汚れを続行します。 蛋白質の隔離の プロテアーゼ阻害剤の 1.5 μ L で遠心糸球体ペレットと組織のホモジナイザーと dounce に RIPA バッファーの 150 μ L を追加します。 プロテインの定量とイムノブロットや他のタンパク質の分析に進みます。