一种从成年大鼠肾脏中分离完整型肾小球的有效筛分方法

这里描述的所有方法都得到了匹兹堡大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。 1. 大鼠肾小球的分离 要制备无菌1% 隔离缓冲液, 请在600毫升烧杯中加入5克牛血清白蛋白 (bsa)。 在烧杯上加入500毫升的1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 用磁搅拌棒搅拌, 直到所有 bsa 溶解。 无菌过滤 1% bsa/pbs 缓冲区在细胞培养罩中。注: 无菌 1% bsa/pbs 缓冲液可在4°c 下保存长达一周。 获得2到 4只 sprague-dawley 大鼠, 每只重150至200克。 利用以每分钟 10-30 的速度引入100% 二氧化碳的腔来通过吸入二氧化碳对大鼠进行安乐死。观察动物停止呼吸和褪色的眼睛颜色, 然后再从二氧化碳中去除。 准备皮肤在前腹部与70% 的乙醇, 并利用剪发剂, 以消除头发, 如果需要。用手术剪刀或手术刀在皮肤上做一个中线切口。通过肌肉层做另一个中线切口, 露出内脏。将切口通过隔膜、胸骨或肋骨笼上延伸, 作为安乐死的次要方法。 分离和取出两个肾脏, 并放置在一个不育的50毫升塑料锥形管与30毫升的汉克斯的缓冲盐溶液 (hbss) 在冰上。注: 有几只老鼠可以在同一个腔内安乐死, 所有的肾脏都可以放在同一个锥形管中。 保持肾脏在冰上和运输到一个无菌细胞培养罩。将肾脏转移到含有5毫升 hbss 的无菌培养皿中, 也在冰上, 用剪刀和锋利的钳子切除和丢弃肾周脂肪。如果仍然存在, 也删除和丢弃周围的肾脏的胶囊, 做一个小的浅表切口, 然后使用尖锐的钳子轻轻地把它从器官。注: 始终保持肾脏隔离在冰上, 并在整个过程中练习无菌技术。一块无菌纱布可以放在培养皿中, 作为纹理表面, 在操作过程中将肾脏固定在适当的位置。 将肾脏切成半纵向 (中矢状部分), 并在带有5毫升 hbss 的第二个培养皿中用手术刀切除和丢弃髓质 (颜色较深)。 将剩余的碎片, 主要是肾皮质, 转移到第三个培养皿与5毫升的 hbss 和薄荷与无菌剃须刀刀片, 直到件小于1毫米的大小, 或直到浆糊形成。 用 1 0 0 微米的 bsa/pbs 将180微米筛的顶部和底部弄湿, 超过500毫升的废烧杯。这一步是至关重要的, 因为它覆盖在筛子与蛋白质, 并减少粘附肾小球, 这将提高产量。 将碎皮层放在筛子的小边缘, 并使用10毫升注射器的纹理柱塞法兰 (橡胶密封的一侧) 将组织通过筛子弄脏, 放入坐在冰上的底平底锅中。定期用 hbss 冲洗, 但尽量减少使用, 以避免样品稀释。注: 不要超过缓冲区总数的30毫升, 因此这里只能使用25毫升。将碎组织放置在筛子的一个边缘的原因是通过限制接触部分筛子而不是整个筛子表面面积来减少肾小球的粘附。 为了方便这一点, 请重复使用在底锅中收集的液体来冲洗筛子。筛分完成后, 用 1% bsa/pbs 缓冲液从平底锅底部再次仔细清洗筛子底部, 以捕获任何可能松散粘附的肾小球。 将底部平底锅中的所有液体收集到几个装有 20 g 针的10毫升注射器中, 并将其通过针头至少增加2次。在最后一次采集时, 将含有肾小球的液体保存在注射器中, 直到准备好通过90μm 筛子。 当液体储存在注射器中时, 用 1% bsaepbs 冲洗底部平底锅, 放入废烧杯中, 用 1% bsa/pbs 将90μm 筛子的顶部和底部弄湿。将筛子放在底部平底锅的顶部。 将注射器中的样品涂在筛子的一个边缘上, 并通过筛网用上面描述的另一个注射器法兰进行。用溶液从底部平底锅中清洗, 收集筛子一侧的所有东西。 筛分完成后, 按照步骤1.5.1 小心清洗筛子底部。收集所有的液体在底部平底锅在一个50毫升的塑料锥形管。 用 1% bsa/pbs 将底锅洗成废烧杯, 并用 1% bsa/pbs 将75μm 筛子的顶部和底部弄湿。将筛子放在底部平底锅的顶部。 将样品应用于筛子的一个边缘。液体应该很容易通过。用至少20% 的 bsa/pbs 冲洗到顶部的废物烧杯。也要小心地清洗筛子的底部。肾小球将保持在这个75μm 筛子的顶部。 使用 hbss 通过倒置筛子来收集 petri 培养皿中的肾小球。在此处根据需要使用尽可能多的 hbss。收集到一个或多个50毫升塑料锥形管 (s) 在冰上。 在4°c 条件下, 以 1800 x 克离心 5分钟, 用移液器小心去除上清液, 并在10毫升的冷 hbss 中重新悬浮颗粒。如果在1.7.2 中采集了多个锥形管, 则将样品结合起来。重复离心步骤。 在 hbss 5 毫升中重新利用肾小球, 直到准备好进入下一步。 如果需要, 取一个总肾小球的计数。为此, 取一个10μl 样品和移液器, 并将滴放在玻璃滑梯上。在显微镜下观察, 计算野外的肾小球, 乘以 500, 得到总产量。注: 纯度可以通过计算在野外看到的小管数量并除以肾小球和小管结构的总数来确定。在视野中应该有 & gt; 95% 的肾小球。 如果有明显的管状污染, 重复步骤1.6.1 前进, 并确保在完成步骤1.7.1 时彻底清洗。这是最有可能发生管状污染的步骤。 2. 肾小球损伤 在一个15毫升的塑料锥形管中收集肾小球, 并在 200 x x g. 的情况下旋转, 根据总产量以适当的 hbss 量旋转, 使每口井大约有 9, 000个肾小球。将样品450μl 放入24孔板的每口井中, 或符合所需下游检测的任何板材格式。注: 上下移液混合在缓冲中的肾小球, 确保了均匀的溶液。肾小球非常粘稠和沉重, 会粘在一起, 同时迅速在溶液底部和管的两侧安顿下来。 为了使 6 mg/ml 硫酸丙胺 (ps) 溶液, 首先将1克 ps 溶解成 10 ml 的 dh2o 加热到40°c 的15毫升塑料锥形管中, 并彻底产生涡旋。取30μl 的溶液, 加入470μl 的 dh2o。注: 这将产生一个 6 mg/ml 溶液, 当在井中添加 50μl, 如下所述, 最终浓度为 0.6 mg/ml。 一式两份, 在一组的每口井中添加50μl 的硫酸丙胺 (这是1:10 稀释), 同时为另一组提供50μl 的 hbss (负对照)。 在37°c 下将板材孵化4小时。 将每口井的含量在微离心管 (4000 x 克、4°c、10-15 s) 中向下旋转, 并用每个 pbs 1 毫升清洗两次。 在 pbs 的300μl 中吸气, 并重新暂停最后的洗涤。分成三个等价物, 用于蛋白质分离、透射电子显微镜 (tem) 可视化和免疫荧光染色 (if)。 3. 准备肾小球进行分析 向下旋转三个等价物的含量 (4000 x 克、4°c、10-15秒), 抽走剩余的缓冲液, 然后通过透射电镜、if 或蛋白质分离进行样品分析。 tem 的加工 将肾小球固定在150μl 的冷2.5% 的戊二醛 0.01 m pbs 中。使用巴斯德移液器小心地从颗粒中取出固定剂, 确保不破坏颗粒, 然后用 pbs 冲洗, 并将其固定在1% 的四氧化铬中, 用1% 的铁氰化钾进行修复。 通过分级系列乙醇 (30、50、70、90、100、100、100%) 和环氧丙烷使样品脱水, 然后嵌入环氧嵌入材料中。 在超微体上切割半薄 (300 nm) 部分。在1% 硼酸钠中摄入0.5% 的甲苯蓝, 并在光镜下进行检查。 切割超薄切片 (65 纳米), 用醋酸铀和雷诺尔德的铅柠檬酸酯染色, 并在透射电子显微镜下进行检查。 中频处理 在 pbs 溶液中加入150μl 的12% 明胶, 并立即放置在干冰上形成颗粒。在4°c 的微离心管中隔夜将颗粒浸泡在500μl 的2% 对甲醛 pbs 中。 将颗粒放入基模中, 并通过在干冰上添加最佳切割温度 (oct) 介质进行嵌入。在低温体上切割5-10μm 切片, 并进行免疫荧光/免疫组织化学或标准组织学染色。 用于蛋白质分离 在离心肾小球颗粒中加入150μl 的 ripa 缓冲液, 加入1.5μl 蛋白酶抑制剂, 并加入组织均质机。 进行蛋白质定量和免疫印迹或其他蛋白质分析。