물고기 Pituitaries에서 높은-품질 기본 세포 배양의 준비
Summary
여기 우리가 준비 하 고 유지 하는 메 다카 (Oryzias latipes)에서 기본 뇌 세포 배양 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에 최적화 된 조건을 고려 온도, osmolality, pH 등의 중요 한 매개 변수 흉내 낸 함으로써 생리 적으로 더 의미 있는 결과 물고기의 생리 적 조건에 의해.
Abstract
1 차 세포 배양 세포 속성 및 제어 된 환경에서 격리 된 셀의 메커니즘 연구 과학자 들에 의해 일반적으로 사용 되는 강력한 도구입니다. 포유류와 물고기 사이 생리에 광대 한 차이도 불구 하 고 물고기에서 기본 세포 문화 프로토콜 종종 기반으로 포유류 문화 조건, 자주만 약간 수정 합니다. 환경 차이는 체온 뿐만 아니라 혈 매개 osmolality, pH, 그리고 pH 버퍼 용량에 영향을. 셀 문화 미디어와 유사한 작업 솔루션 extracellular 액체 또는 혈액 혈 청에는 셀이 적응의 특성을 모방 의미는, 그것은 중요 이러한 매개 변수에 동물을 특별히 조정 됩니다.
현재 프로토콜 메 다카 (Oryzias latipes)에 대 한 최적화 된 기본 문화 조건을 설명합니다. 프로토콜과 격리 하 고 건강 한 유지 하는 방법에 자세한 내용은 1 주일 이상에 대 한 뇌 세포를 해리 하 여 제공 하는 다음 단계가 포함 됩니다: 1. 값 osmolality 조정 메 다카 혈액 플라스마, 2에서에서 발견.의 조정에 부 화 온도 정상 메 다카 온도를 (여기 수족관 시설에서), 3. 비슷한 온도에서 사는 다른 어 종에 비해 값을 pH와 중 탄산염 버퍼의 조정. 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 결과 메 다카에 대 한 생리 적으로 의미 있는 결과 홍보 하 고 다른 비 포유류 종에서 1 차 셀 문화를 만드는 과학자 참조 가이드로 사용할 수 있습니다.
Introduction
세포 배양 정상적인 세포질 생리학에서 마약 검사 및 발암1에 이르기까지 생물학 질문에 응답 하기 위한 우수한 모델 시스템을 제공 하는 분자 생물학 연구에 사용 되는 주요 도구 중 하나입니다. 1 차 셀, 효소 및 기계적인 방법을 사용 하 여 동물 조직에서 직접 분리는 종종 세포 보다 더 생물학적으로 관련 생물학 응답 vivo에서 상황에 가까이 있을 수 있습니다 간주 됩니다. 1 차 셀 문화를 준비 하기 위한 프로토콜 관심 있는 셀은 적응 하는 특성을 모방 하 고 생리 적으로 의미 있는 결과 얻을 각 종 및 세포 유형에 최적화 되어야 합니다.
물고기 세포에 대 한 기본 문화권 조건을 설명 하는 유사한 프로토콜에 비해 다소 부족 한 반면 수많은 프로토콜 포유류 세포 시스템에 대 한 문화 조건을 설명 합니다. 셀 온도, pH, 그리고 osmolality, 빠른 변화에 취약 하며 분리 절차 중 특히 취약 합니다. 상업적인 소금 솔루션 포유류 세포 배양에 사용 되는 문화 미디어 pH 버퍼 시스템 조건과 osmolality 특히 teleost 생선에 적합 하지 않습니다. 그것은, 그러므로, 측정 솔루션 관심의 종에서 이러한 매개 변수의 순수 관련 레벨을 조정 하는 것이 중요.
일반적인 잉어를 포함 하 여 여러 teleost 물고기 종에서 한 주 하 문화 (Cyprinus 카 르 피 오)2,3, 잔디 잉어 (Ctenopharyngodon idella)4, 금붕어 (auratus 떡 )5, 무지개 송어 (Oncorhynchus mykiss)6, 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라)7, 틸 라 피아 (Oreochromis mossambicus)8, zebrafish (Danio rerio)9, 그리고 대서양 대구 (Gadus morhua)10. 관심의 종 부 화 온도 조정 외에도 이러한 프로토콜의 몇 가지가지고 인 큐베이 팅 관심, 습도 분위기에서 7.5 7.2에서 ph의 종 차선 수 있는 포유류-같은 조건에서 셀 포함 하는 3-5% CO2. 또한, 그것은 이러한 기본 세포 배양의 여러 준비에 사용 되는 솔루션의 osmolality 조정 된 경우에 불분명 하 고 다른 솔루션 사이의 안정적인.
현재 프로토콜 대서양 대구10 주 문화 이전 작업에 따라 고을 부 화 온도, osmolality, pH, 그리고 이산화탄소 (pCO2)의 부분 압력을 포함 하 여 pH 버퍼 시스템의 구성 메 다카 (O. latipes)의 생리학. 메 다카는 작은 (3-4 cm) 민물고기 이다, 동쪽 아시아. 이 요즘, 그것 사용 된다 세계의 많은 연구소에서 모델 종으로 그것은 상대적으로 쉽게 번 식 하 고 많은 일반적인 물고기 질병11저항력. 여러 이점이 있다 모델로, 4-40 ° C11, 짧은 생성 시간, 투명 한 태아, 성 결정 유전자12, 그리고 시퀀스 게놈13, 뿐만 아니라에서 많은 온도 허용 오차를 포함 하 여 메 다카를 사용 하 여 다른 사용 가능한 유전 자원입니다.
이 프로토콜의 기본 문화 조건 medakas 물고기 시설에서에 보관 되는 26 ° C의 온도 맞게 최적화 됩니다. 또한,는 osmolality 290 mOsm/kg 담 수에 살고 있는 메 다카를 소금물에 살고 있는 대서양 대구에서 320 mOsm/kg에서 감소 되 고 메 다카 플라즈마14의 정상적인 osmolality은. 비교에서는, 포유류 플라즈마의 전형적인 osmolality 275-295 mOsm15의 범위입니다. 다양 한 온도에서 살고 물고기 고 물고기 포유류에서 다른 혈액과 세포 외 액의 pH와 버퍼 용량을 만드는 물과 직접 접촉에 있는 아가미. 포유류 문화 미디어는 pH 약 7.4의 미디어는 37 ° c.에 습도 공기에 5% CO2 의 표준 분위기 equilibrated 때 발생 하는 버퍼 시스템에 일반적으로 포함 됩니다. PH는 온도 의존 및 감소 온도16(물)에 중립 pH 증가 대 한 값입니다. 전형적인 teleost 물고기 플라스마 pH 7.9177.7에서 배열 한다. 이 프로토콜의 최적화는 pH 7.85 pH 7.75 메 다카는 CO2 0.5%에서 1%로 증가 하 여 26 ° C에서 보관에 12 ° C에서 보관 하는 대구에서에서 감소를 포함.
또한, 중 탄산염 버퍼 용량 물고기와 포유류에서 매우 다르다. CO2 물고기에서 아가미를 통해 쉽게 교환 이며 물에 pCO2 폐18에서 pCO2 의 극히 일부에. 온도 또는 pCO2 변경 하는 것은 pH와 매체의 버퍼 변경 됩니다. 따라서, pH도 포유류 세포 배양에 대 한 권장 pCO2 물고기 셀에 최적 이며 따라서, 문화 미디어는 물고기에 대 한 순수 관련 값을 포함 하는 버퍼 시스템으로 최적화 되어야 합니다 그리고 특정 관심의 종입니다. 이 프로토콜 메 다카 pituitaries에서 1 차 셀 문화를 준비 하 고 조정 부 화 온도, osmolality, pH, 그리고 pH 버퍼 시스템의 1 차 셀을 준비할 때 고려해 야 할 다른 중요 한 매개 변수 외에 포함 하는 방법을 설명 합니다. 문화 비 포유류 종에서.
Protocol
Representative Results
Discussion
체 외에서 세포 배양 시스템 연구자 올바른 방법1에서 사용 하는 경우 다른 생물학 질문의 과다 한 답변에 대 한 강력한 도구를 제공 합니다. 그것은 그 해리 셀 인접 셀에 그들의 연결을 잃 었 수 있습니다 얻은 다른 기능 속성 보다 그들은 원래 에 비보를 기억 하는 것이 중요. 위험에 생체 외에서 실험에서 얻은 결과 잘못 해석 되 고 피하기 위해, 그것은 고?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 생명과학과 연구 노르웨이 위원회, 부여 번호 243811 및 244461 (양식 프로그램)의 노르웨이 대학에 의해 투자 되었다. 우리는 물고기 시설을 유지 하기 위한 생명 공학의 노르웨이 대학에서 루르 드 Carreon 탄을 감사입니다.
Materials
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 µg/ml Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straigt tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles / insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
Referenzen
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2010).
- Ribeiro, L. P., Ahne, W. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro. In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).
- Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release. In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).
- Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).
- Chang, J. P., et al. Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies. General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).
- Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout – Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone. General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).
- Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release. General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).
- Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
- Lin, S. W., Ge, W. Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach. General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH. General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka – a model organism from the far East. Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Letters. 2 (12), (2016).
- Waymouth, C. Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells. In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).
- Cameron, J. N. Acid-base homeostasis – past and present perspectives. Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).
- Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms. Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).
- Perry, S. F., Tufts, B. L. . Fish respiration. , (1998).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone β-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Strandabø, R. A. U., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Verbalis, J. G. Brain volume regulation in response to changes in osmolality. Neurowissenschaften. 168 (4), 862-870 (2010).
