Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Rachel Santarella-Mellwig; Uta Haselmann; Nicole L. Schieber; Paul Walther; Yannick Schwab; Claude Antony; Ralf Bartenschlager; In&#233;s Romero-Brey

doi:10.3791/58154

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Biotechnik

Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) für die Verfolgung und Imaging virales Protein verbundenen Strukturen in den Cryo-immobilisierten Zellen

Published: September 07, 2018

doi:

10.3791/58154

Rachel Santarella-Mellwig¹, Uta Haselmann², Nicole L. Schieber¹, Paul Walther³, Yannick Schwab¹, Claude Antony¹, Ralf Bartenschlager^2,4, Inés Romero-Brey²

¹European Molecular Biology Laboratory, ²Department of Infectious Diseases, Molecular Virology,Heidelberg University, ³Central Facility for Electron Microscopy,Ulm University, ⁴Heidelberg Partner Site,German Center for Infection Research

Summary

Eine Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) Methode gilt für virusbedingte intrazellulären Bildstrukturen über Elektronenmikroskopie (EM) in Zellen, die zuvor durch Lichtmikroskopie (LM) ausgewählt werden. LM und EM sind kombiniert als bildgebende Hybridansatz, eine integrierte Ansicht der Virus-Wirt Interaktionen zu erreichen.

Abstract

Aufgrund der hohen Auflösung ist Elektronenmikroskopie (EM) ein unverzichtbares Werkzeug für Virologen. Eine der Hauptschwierigkeiten bei der Analyse von Virus-infizierten oder transfizierten Zellen über EM sind jedoch die niedrigen Wirkungsgrade von Infektion oder Transfektion, behindern die Prüfung dieser Zellen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, kann Lichtmikroskopie (LM) zuerst ausgeführt werden, um die Subpopulation von infizierten oder transfizierten Zellen zuzuordnen. So nutzen die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen (FPs), virale Proteine verschmolzen, LM wird hier verwendet, um die Positionen der “positiv-transfizierten” Zellen aufnehmen, mit dem Ausdruck ein FP und wächst auf einem Träger mit einem alphanumerischen Muster. Anschließend Zellen weiterverarbeitet werden für EM über Hochdruck (HPF) Einfrieren, Einfrieren, Substitution (FS) und Harz einbetten. Der Ultra-schnelle einfrierende Schritt sorgt für ausgezeichnete Membran Erhaltung der ausgewählten Zellen, die dann auf der Ultrastrukturforschung Ebene mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) analysiert werden kann. Hier ist ein Schritt für Schritt Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) Workflow vorgesehen, Probenvorbereitung, Bildgebung und Korrelation im Detail zu beschreiben. Das experimentelle Design kann auch angewendet werden, um viele Zelle Biologie Fragen beantworten.

Introduction

Die Idee der Kombination von zwei Mikroskopie Modalitäten, ein besseres Bild von einem bestimmten biologischen Prozess zu erhalten ist ziemlich alt. So erschien die erste Studie über Viren, die mit “Korrelative Mikroskopie” im Jahr 1960 als zwei separate Publikationen¹^,². In dieser Studie analysiert die Autoren die Änderungen in der Morphologie des Kerns durch Adenoviren mittels zwei mikroskopiertechniken induziert. In der ersten Publikation wurden Elektronenmikroskopie (EM) Beobachtungen beschreiben die morphologischen Einzelheiten im Zusammenhang mit Adenovirus-Infektion gemeldeten¹. In einer zweiten Publikation wurden die verschiedenen Strukturen von EM beobachtet korreliert mit Lichtmikroskopie (LM) Bilder von histochemische Färbung Mustern, die Natur der zuvor beobachtet von EM²Strukturen zu definieren.

In diesen frühen Studien wurden jedoch ihre Beobachtungen mit verschiedenen infizierten Zellen, die als unabhängige Experimente durchgeführt. Die “Korrelation”, in der Tat sollte als die Kombination von Informationen aus zwei bildgebender Verfahren zu verstehen, ein bestimmtes Phänomen, vergleicht man die Ergebnisse, die mit verschiedenen Assays gewonnen worden sein, um zu verstehen, ein bestimmtes biologisches Prozesses.

Heutzutage wird der Begriff Korrelative Mikroskopie, auch bekannt als Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM), auf eine wachsende Zahl von Methoden (rezensiert in Referenzen³^,⁴^,⁵), mit der Gemeinsamkeit angewendet. dass beide bildgebenden Verfahren (LM und EM) auf der selben Probe durchgeführt werden. Die Kombination beider Methoden ergibt sich dabei in einer multi-modale, Multi-Skalen und Multi-dimensionale Analyse von diesem Beispiel³. Die Vorteile sind, dass LM kann eine umfassende Übersicht über viele verschiedene Zellen ermöglicht die Identifizierung der Zelle Subpopulationen mit dem Ausdruck eines Proteins oder in eine heterogene Zellpopulation interessierender Proteine. EM überwindet die Auflösungsgrenze des LM, bietet eine höhere Auflösung Bild eines bestimmten Ereignisses intrazellulären. Darüber hinaus ermöglicht EM die Visualisierung des nicht-fluoreszierende subzelluläre Kontexts, einschließlich aller Membran gebunden Organellen, große makromolekulare Komplexe (z. B. Ribosomen, Centriolen, etc.) und Zytoskeletts Elemente, damit Bereitstellung von räumlichen Zusatzinformationen, die so genannte “Referenz Raum”⁶und fluoreszierende Ort erkannt durch LM Rahmen verleihen.

CLEM geworden in den letzten Jahren ein leistungsfähiges Werkzeug nicht nur für Zelle Biologen⁵, sondern auch für Virologen (rezensiert in Referenz⁷) bereit, die komplexe Virus-Zell-Interaktionen zu verstehen, die für eine erfolgreiche Virus-Verbreitung führen. Deshalb verstehen wie Viren Zellmembranen und Organellen zu ihren eigenen Gunsten ändern entscheidend für die Entwicklung von antiviraler Medikamenten um pathogene Viren auszurotten.

Hier wird ein CLEM Verfahren beschrieben, das ermöglicht die Erkennung von LM von Zellen mit dem Ausdruck virale Proteine mit einem fluoreszierenden Proteins (FP) verschmolzen. Diese Zellen sind anschließend Cryo-immobilisiert und weitere bereit für Ultrastrukturforschung Analyse über die Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), neue Einblicke in die Expression dieser Proteine ordnen wie intrazelluläre Membranen (Abbildung 1). CLEM wurde mit chemisch festen Zellen in den meisten der Virologie Studien veröffentlicht bis Datum⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,^{14 durchgeführt} ^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Dies ist vor allem wegen der Notwendigkeit der Inaktivierung infektiösen Materials aus biologischen Gründen Biosafety Level-2 und-3 (BSL-2 und BSL-3) Labors, wo die Cryo-Immobilisierung von Zellen in der Regel nicht möglich ist. Für diese Fragen erfordern eine optimale Konservierung der Zellmembranen, Verglasung über Hochdruck Einfrieren (HPF) jedoch²⁰empfiehlt. In diesen Fällen kann die hier beschriebene CLEM Protokoll angewendet werden. Interessanterweise kann vor allem beim Arbeiten mit infektiösen Proben HPF auf Proben durchgeführt werden, die zuvor chemisch inaktiviert, zum Beispiel in Labors BSL-2 und BSL-3 gewesen sein. Die Kombination von chemischen Fixierung gefolgt von HPF ist eine Möglichkeit, zumindest teilweise profitieren Sie von den Vorteilen der Kryokonservierung Methoden²¹^,²².

Abbildung 1 : Schematische Darstellung des Workflows für die Analyse der Zellen durch CLEM. Zellen wachsen auf gemusterte Saphir Scheiben werden zunächst durch LM, Zellen mit dem Ausdruck FPs vor deren Verarbeitung für EM zu lokalisieren analysiert. Sobald diese gefunden ist, werden Zellen von HPF und FS anschließend in Harz eingebettet werden sofort behoben. Bei der Polymerisation des Harzes, die Unterstützung, wo Zellen wuchsen (= Saphire Scheiben) muss aus dem Harz-Block entfernt werden. Der Block mit den eingebetteten Zellen ist auf ein kleines Trapez getrimmt aus dem verbleibenden Zellen, mit dem Ausdruck FPs, mit einem Diamant-Messer geschnitten werden. Ultradünnen Abschnitte auf Slot Gittern gesammelt und weiter durch TEM Ultrastrukturforschung Informationen dieser Zellen zu untersuchen. Diese Zahl ist angepasst und mit freundlicher Genehmigung von Verweis²⁹geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

1. Vorbereitung der gemusterten Saphir Scheiben für die Zellkultur Übertragen Sie die gemusterten Saphiren Scheiben (siehe Tabelle der Materialien), mit einem alphanumerischen Muster geätzt auf eines ihrer Oberflächen in einem 15 mL konische Zentrifugation Rohr.Hinweis: Alternativ können herkömmliche 0,05 mm dicken Saphir Disks ohne alphanumerische Muster verwendet werden entsteht ein Referenzmuster von Carbon Beschichten sie mit einem Finder Raster an der Spitze. Zu diesem Zweck sollten sie mit Ethanol gereinigt werden, bevor die Carbon-Muster angewendet wird. Waschen sie gründlich mit Ethanol. Verbreiten sie heraus in einer Petrischale mit Filterpapier und trocknen lassen. Legen Sie sie auf einen Glasobjektträger schlanke lange Pinzette voneinander getrennt. Prüfen Sie mit einem inversen Mikroskop (4 X Vergrößerung), ob das Muster der Koordinaten auf jeden saphirscheibe lesbar ist.Hinweis: Wenn dies nicht der Fall ist, drehen Sie die Saphiren Scheiben mit Hilfe der Pinzette. Speichern Sie die Saphiren Scheiben in einer Petrischale.Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. (2) Zellkultur mit gemusterten Saphir Discs Die gemusterten Saphiren Scheiben mit einer ultravioletten (UV)-Vernetzer für 5 min zu sterilisieren. Nehmen Sie die Saphiren Scheiben der Zelle Kultur Biosicherheits Kabinett. Die lange Pinzette mit Ethanol in der Biosicherheit Kabinett zu sterilisieren. Fügen Sie die Hälfte der Zellkulturmedium (siehe Tabelle der Materialien) zu einer Zelle Kulturschale. Übertragen Sie die Saphiren Scheiben sorgfältig mit der lange Pinzette in der Kulturschale Zelle. 1 x 105 Huh7 Lunet Samenzellen, die T7-Polymerase in der anderen Hälfte des Zellkulturmedium auf der Kulturschale Nukleinsäuretablette stabil zum Ausdruck zu bringen.Hinweis: Berechnen Sie die Anzahl der Zellen so gesät werden, dass die Zelle Konfluenz am Endpunkt des Experiments sollte nicht mehr als 20 – 30 %. Hohe Zelldichte wird die Verlagerung der Zellen in einem späteren Stadium von EM behindern. Darüber hinaus kann über Konfluenz die Loslösung der Zellen von der Saphir-Discs führen. Überprüfen Sie, dass die Saphiren Scheiben am unteren Rand der Kulturschale bleiben und die alphanumerischen Koordinaten mit der inversen Mikroskop noch lesbar sind.Hinweis: Wenn die Scheiben in die Zellkulturmedium schweben, verwenden Sie die lange Pinzette, die Scheiben nach unten schieben und schließlich, sie wieder auf die richtige Orientierung zu kippen. Transfizieren Sie die Zellen am nächsten Tag wie bereits berichtet in Referenzen21,23 nach der Transfektion Agent-Herstellers. (3) LM Bildgebung von Zellen wachsen auf gemusterte Saphir Discs Die Saphiren Scheiben am Endpunkt des Experiments auf einer bildgebenden Metallplatte mit 30 – 50 µL übertragen / position der pH Indikator-freien Medium, unspezifische Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren.Hinweis: Die hier beschriebenen Metallplatte (Abbildung 2) wurde im Rahmen des European Molecular Biology Laboratory (EMBL) Workshops konzipiert. In Abwesenheit von dieser Platte oder ein ähnliches könnte Glasboden Zelle Kultur Gerichte auch stattdessen für LM verwendet werden. Es ist wichtig, die normale Zellkulturmedium für Medium ohne pH-Indikator zu ändern. Beachten Sie auch, dass lange Belichtungszeiten sollte vermieden werden, weil sie Immunofluoreszenz, was zu reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Akkumulation und physiologische Schäden der Zellen24,25verursachen könnte. Bild der Zellen unter einem invertierten Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop.Hinweis: Wenn Sie ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) verwenden-tagged Proteins, wie dargestellt in die repräsentativen Ergebnisse, 450-490 nm und 500 – 550 nm Anregung und Emission Filter, bzw., sollte verwendet werden. Erwerben Sie zunächst ein geringer Vergrößerung Bild (10-20 X) der Zellen, Zellen, die mit dem Ausdruck FPs Record (Aufnahme) verteilen die Koordinaten der gemusterten Saphiren Scheiben wo die Zellen von Interesse befinden, mithilfe von differenziellen Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie.Hinweis: Mehrere Bereiche Nähte könnte helfen, einen besseren Überblick über die Lage der Zelle/Zellen von Interesse sind. Beachten Sie auch die Phasenkontrast-Mikroskopie hier optional genutzt werden kann. Abrufen von Bildern hoher Vergrößerung (Fluoreszenz und DIC) (63 – 100 X, Ölimmersion Ziele) der gleichen Zelle bzw. Zellen, die subzelluläre Lokalisation des Proteins des Interesses in den intrazellulären Raum besser zu erkennen.Hinweis: DIC Bilder Kontextinformationen. Diese Information ist oft entscheidend für LM Bilder später mit EM mikrographen korrelieren, da die endgültige Korrelation genauer mit “anatomischen” Wahrzeichen der Zelle ist. Da einige Saphir Discs während Cryo-Immobilisierung unterbrechen können, empfiehlt es, Triplicates pro Zustand vorzubereiten. Darüber hinaus trennen Sie einige Zellen die Scheiben während HPF und die nachfolgenden Schritte dieses Protokolls, während die Ultrastruktur der anderen Zellen Artefakte infolge Einfrieren Schäden enthalten könnte. Daher sollten mindestens zwei Bereiche der Scheiben abgebildet werden, über LM um sicherzustellen, dass am Ende genügend Zellen analysiert werden. Wichtig ist, sollte sich diese beiden Bereiche auf gegenüberliegenden Seiten der Scheibe. Auf diese Weise kann der Harz-Block, wo die Zellen eingebettet sind, in zwei Hälften geschnitten werden und Abschnitte dieser Bereiche erzielt werden. Abbildung 2 : Schema für die LM-Bildgebung von Zellen wachsen auf gemusterte Saphire Scheiben. (A) die Saphiren Scheiben werden mit Hilfe von feinen Pinzette auf eine speicherfolie übertragen. (B-C) Diese Platte hat speziell bei der EMBL-Workshop in Heidelberg, in dem Lichtmikroskop zu passen, wo die Saphiren Scheiben mit Zellkulturmedium ohne pH-Indikator abgebildet werden können. Es besteht aus einem metallschlitten, 75 mm x 25 mm x 1 mm, mit vier-fünf Löcher mit einem 3 mm Bohrer auf die Größe der Saphiren Scheiben passen hinein gefräst. Darüber hinaus wurden kleine Rillen auf beiden Seiten der Löcher in einem Winkel von 90° gemahlen. Diese Löcher erleichtern die Scheiben mit der Pinzette zugreifen, wenn sie zu manipulieren. Um optimale Bildgebung Bedingungen zu ermöglichen wurden Glasdeckgläser Nr. 0 (0,085 bis 0,13 mm dick) unter die Löcher mit UV-Kleber geklebt und unter UV-Licht Aushärten platziert. (D) hoher Vergrößerung Bild der gemusterten saphirscheibe Darstellung der alphanumerischen Koordinaten, die auf seiner Oberfläche geätzt werden. Die gemusterten Saphiren Scheiben sind im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. (4) Cryo-Immobilisierung von Zellen wachsen auf gemusterte Saphir Scheiben über HPF Legen Sie die “A” und “B” Aluminium-Träger für HPF (siehe Tabelle der Materialien) in einer Petrischale mit Filterpapier mit 1-Hexadecene getränkt. Tauchen Sie die gemusterten Saphir CDs mit den Zellen in einer Petrischale mit 1-Hexadecene.Hinweis: Verschieben Sie die Scheiben ein bisschen das Zellkulturmedium abzuwaschen. Montieren Sie die Saphiren Scheiben zwischen “A” und “B” Aluminium Träger im HPF Halter wie folgt (Abb. 3B). Legen Sie auf der Unterseite einen “B”-Träger mit der flachen Seite nach oben zeigt. Legen Sie die Saphir Discs auf dieser flachen Seite mit den Zellen nach oben. Fügen Sie einen “A” Träger mit seiner 0,1-mm-Tiefe mit Blick auf die Zellen.Hinweis: Da die gemusterten Saphiren Scheiben dicker als die herkömmlichen Saphiren-Scheiben sind, musste der im Handel erhältlichen “A”-Träger (mit nicht-gemusterten 0,05 mm Saphir Scheiben verwendet werden soll) bis 0,05 mm im Diesseits 0,2 mm Tiefe am EMBL geschnitten werden Workshop um fit in die HPF-Halterung(Abbildung 3). Zu diesem Zweck ist der “A” Träger in das Ende des ein Metallrohr eingefügt, sodass seinerseits 0,2 mm ausgesetzt ist und immer noch beim Schneiden es nach unten bleibt. Die abgespeckte Seite wird dann geschliffen, so dass es flach ist. Alternativ kann ein spezielle Aluminium-Träger auf den gemusterten saphirscheibe verwendet werden (im Handel erhältlich, siehe Tabelle der Materialien), wobei in diesem Fall die HPF “Sandwich”, bestehend aus nur dem saphirscheibe und Träger. Schließen Sie die Halterung der HPF-Maschine und das Einfrieren der Zellen.Hinweis: Dieses Protokoll ist spezifisch für eine bestimmte HPF-Maschine. Andere Maschinen HPF könnte Alternativ verwendeten6,26. In jedem Fall bitte beachten Sie die Existenz von Maschinen der neuen Generation von den Lieferanten.Achtung: Verwenden Sie Schutzbrille und Hörfähigkeit Schutz Kopfhörer. Legen Sie die gefrorenen “Sandwich” in eine Styroporbox mit flüssigem Stickstoff zur Zwischenlagerung.Achtung: Verwenden Sie Schutzbrillen und nehmen Sie Kontakt mit der lokalen Sicherheitsbeauftragte über die Gefahren informiert werden, beim Umgang mit flüssigen Stickstoffs. Um Verwechslungen zu vermeiden, legen Sie jedes “Sandwich” in einem separaten 0,5 mL Microcentrifuge Schlauch (innen Styroporbox) mit einer Nummer gekennzeichnet.Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Wenn Frost Substitution (FS) sofort durchgeführt werden kann, die Proben in verstaubar Cryo-Röhrchen (mit einem Loch in die Spitze geschlagen) in Kisten, die in einem Rack in einem kryogenen flüssigem Stickstoff gehalten werden Dewar (siehe Tabelle der Materialien). Diese Flüssigstickstoff-Behälter sollte mit Sauerstoff-Gas-Sensoren zur Vermeidung von Erstickungsgefahr bei Sauerstoffmangel in einem Raum befinden.Achtung: Alle folgenden (Schritte 5 und 6) beschriebenen Verfahren müssen in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden. Darüber hinaus sind die meisten der verwendeten Reagenzien gefährlich. Bevor Sie sie verwenden, ist es zwingend erforderlich, lesen sorgfältig die Sicherheitsdatenblätter von den Herstellern zur Verfügung gestellt, sowie Fragen der Sicherheitsbeauftragte über die lokalen Regeln für sichere Handhabung zu gewährleisten. Für die ordnungsgemäße Entsorgung der gebrauchten Materialien, sowie für die ordnungsgemäße Verwendung der unten beschriebenen Ausrüstung ist es auch erforderlich, um die lokalen Institut Gesundheit und Sicherheitsverfahren zu konsultieren. Abbildung 3 : Schema der Versammlung der gemusterten Saphir Scheiben zwischen zwei Aluminium-Träger für HPF. (A) Cut-away Ansichten eines konventionellen “A”-Trägers, die auf der tieferen Seite von 0,2 mm bis 0,05 mm. (B) die 0,16 mm dicken saphirscheibe mit dem alphanumerische Muster auf der Oberfläche geätzt geschnitten werden muss ist in zwei Aluminium-Träger für HPF montiert , wie folgt: dem saphirscheibe befindet sich auf der flachen Seite des “B” Träger mit den Zellen nach oben. Eine gehackte, die “A” Träger mit seiner 0,1-mm-Tiefe mit Blick auf die Zellen an der Spitze zu schließen “HPF-Sandwich” platziert wird. Die Aluminium-Träger und die gemusterten Saphiren Scheiben sind im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 5. FS Cryo-feste Zellen Füllen Sie die FS-Maschine (siehe Tabelle der Materialien) mit flüssigem Stickstoff. Stellen Sie die Temperatur auf-90 ° C ein und warten Sie, bis die Maschine diese Temperatur erreicht. Bereiten Sie das FS-Medium mit 0,2 % Osmium ausgefällt (OsO4) (V/V), 0,1 % Uranyl Acetat (UA) (w/V) in Glas-destilliert Aceton während der FS-Maschine kühlt.Hinweis: Zur Vorbereitung (zum Beispiel) 12 mL FS Medium mix 600 µL 4 % OsO4mit 0,012 g UA in einem kleinen Glasbehälter. Diese Mischung in ein Ultraschallbad Gerät für 5 min. hinzufügen 11,4 mL Glas destilliert Aceton mit einer Pipette auflösen und gut mischen. 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 200-500 µL FS Medium füllen Sie, schließen Sie den Deckel und übertragen Sie sie auf die FS-Maschine. Warten Sie 10 Minuten für das FS Medium abkühlen lassen. Die gefrorenen “Sandwiches”, enthält die Saphiren Scheiben mit Zellen in flüssigem Stickstoff gekühlten lange Pinzette auf die Rohre mit dem FS-Medium zu übertragen.: Vorsicht Cryo-schützende Handschuhe und Schutzbrillen.Hinweis: Die HPF “Sandwiches” könnte spontan während deren Handhabung zerlegt werden. In diesem Fall ist darauf zu achten, dass die gefrorenen Saphire-Scheiben auf die Mikrozentrifugenröhrchen übertragen werden. Die Aluminium-Träger können verworfen werden. Führen Sie die FS wie folgt bis zum nächsten Tag27: von-90 ° C bis-80 ° C für 8 h; von-80 ° C bis-50 ° C für 8 h; von-50 ° C bis-20 ° C für 2 h; von-20 ° C bis 0 ° C für 2 h. (6) Harz Einbettung von Freeze ersetzt Samples Achtung: Die nachstehend beschriebenen Verfahren müssen in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden. Darüber hinaus sind die meisten der verwendeten Reagenzien gefährlich. Bevor Sie sie verwenden, ist es zwingend erforderlich, lesen sorgfältig die Sicherheitsdatenblätter von den Herstellern zur Verfügung gestellt, sowie Fragen der Sicherheitsbeauftragte über die lokalen Regeln für sichere Handhabung zu gewährleisten. Für die ordnungsgemäße Entsorgung der gebrauchten Materialien, sowie für die ordnungsgemäße Verwendung der unten beschriebenen Ausrüstung ist es auch erforderlich, um die lokalen Institut Gesundheit und Sicherheitsverfahren zu konsultieren. Nehmen Sie die ersetzten Exemplare aus der FS-Maschine und legen Sie sie für 20 min auf Eis. Halten Sie die Proben bei Raumtemperatur für 20 min und waschen Sie sie gründlich (3 x 10 min pro) mit Glas-destilliert Aceton. Verwerfen Sie die Aluminium-Träger mit einer langen Pinzette, wenn sind noch in der Mikrozentrifugenröhrchen nach der FS. Die Zellen (auf die verbleibenden Saphiren Scheiben) in einer vier-Stufen-Epoxy Harz mit 1 h Inkubationen in 25 %, 50 % und 75 % Harz im Glas destilliert Aceton, gefolgt von Übernachtung Inkubation mit 100 % Harz zu infiltrieren. Tauschen Sie das 100 % Harz am nächsten Tag 1 h. Legen Sie vorsichtig die Saphiren Scheiben in durchströmten Ringe montiert in Reagenz Bäder mit 100 % Harz gefüllt. Diese Ringe werden als Polymerisation Formen für 10 Saphir-Discs verwendet.Hinweis: Die Saphiren Scheiben müssen vollständig auf den Boden mit den Koordinaten nach oben in eine lesbare Weise geschoben werden. Dies konnte mit Hilfe eines Fernglases befestigt, ein Rauch-Extraktor überprüft werden. Alternativ könnte ein Fernglas im Inneren eine biologische Kabinett stattdessen verwendet werden. Wichtiger ist, sind Zahlen (1-10) eingraviert auf der Unterseite der Reagenzien, die dazu beitragen, um die Proben zu ermitteln. Darüber hinaus konnte für die Identifizierung der Proben ein Papier-Tag im Harz-Block enthalten sein. Polymerisieren Sie die Proben in den Ofen bei 60 ° C für 48 h. 7. Entfernung von gemusterten Saphir Scheiben aus polymerisierten Harz-Blöcke Entfernen Sie die harte Harz-Blöcke enthalten die Zellen aus dem Ofen.Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Wenn nicht, lassen Sie die Blöcke auf Zimmertemperatur abkühlen vor dem Schneiden sie. Schneiden Sie die einbettenden Formen mit einer Rasierklinge auf die Harz-Blöcke zugreifen. Entfernen Sie die zylindrischen Harz-Blöcke mit einer Pinzette.Hinweis: Wenn ein Papier-Tag nicht aufgenommen worden ist, in das Harz vor der Polymerisation, Anzahl der Blöcke mit einem wasserfesten Stift blockieren und in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aufbewahren. Das Protokoll kann hier angehalten werden. Tauchen Sie die Spitze des Harz-Blocks mit dem saphirscheibe in eine Styroporbox mit flüssigem Stickstoff bis zum Anschlag “sprudeln”. Dann Tauchen Sie die Spitze des Harzes Blocks in kochendem H2O. Wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte so oft wie nötig, bis der saphirscheibe aus dem Harz-Block fällt.Achtung: Verwenden Sie Schutzbrillen und Cryo-schützende Handschuhe.Hinweis: Wenn dies nicht funktioniert, verwenden Sie eine Rasierklinge, um ein bisschen von der polymerisierten Harz rund um die Scheiben zu entfernen, bevor Sie erneut versuchen. Das Protokoll kann hier angehalten werden. 8. gezielte Trimmen und ultradünnen Schneiden für TEM Das Gebiet auf dem Harz Block Gesicht wo die Zellen von Interesse vorhanden sind, durch die Untersuchung der Block-Gesicht mit dem Fernglas ein regungsloses zu identifizieren.Hinweis: Negative Impressum des Musters koordinieren von gemusterten Saphir-Discs ist auf dem Block Gesicht beibehalten. Dies ermöglicht die Identifikation von der Gegend, wo die Zellen von Interesse für gezielte Trimmen befinden. Die LM-Bilder müssen vertikal gespiegelt werden, zur Erleichterung die Feststellung von der gleichen Position im Block Gesicht. Schneiden Sie die eingebettete Zelle Monolage, enthält die Zelle/Zellen von Interesse für eine kleine flache Pyramide mit der Form eines Trapez (~ 200 µm × 250 µm Durchschnittsgröße) mit einer sauberen Rasierklinge. Erhalten Sie 70 nm ultradünnen Abschnitte der eingebetteten Zellen mit einem 35° Diamant Messer. Legen Sie in den Abschnitten auf EM Slot Netze mit Hilfe von Ultra-feine Pinzette.Hinweis:: die Verwendung von Mesh-Gitter sollte vermieden werden, weil die Abschnitte durch die Raster-Balken verdeckt werden könnte. Speichern Sie die Netze in einem Raster angezeigt.Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. (9) TEM Analyse der ultradünnen Abschnitte Platzieren Sie die Slot-Raster in die Halterung des Transmissions-Elektronenmikroskop. Abrufen von geringer Vergrößerung (Übersicht) Bildern, wo die komplette Zelle Profil der Zelle von Interesse sichtbar ist.Hinweis:: die Zelle bzw. Zellen von Interesse finden wieder mithilfe der Zelle-Profile und die Standorte der Zellen zueinander als Referenzen, im Vergleich zu der DIC Ansichten von LM vor erworben. Abrufen von Bildern hoher Vergrößerung der Zelle/Zellen von Interesse, um zu versuchen und zu finden auf der Ultrastrukturforschung Ebene Funktionen, die die fluoreszierenden Signale beobachtet vorher durch LM entsprechen.Hinweis: Montage Bilder erhalten Sie bei hoher Vergrößerung, eine Übersicht mit einer hohen Auflösung der Zelle/Zellen von Interesse zu haben. Darüber hinaus ist es oft notwendig, Bilder von der gleichen Zelle in Folge Schnittserien in der Lage sein, die Zelle in 3D zu rekonstruieren, bevor Sie im Vergleich zu den Fluoreszenzbilder zu erwerben.

Representative Results

Mithilfe der hier vorgestellten Verfahren (Abbildung 1), Huh7 Lunet Zellen auf gemusterte Saphire Discs entkernt und anschließend mit einem Plasmid mit dem Ausdruck zwei Domänen des Hepatitis C-Virus (HCV) transfiziert wurden stabil auszudrücken die T7-RNA-polymerase Elementoptionen Protein NS5A, getaggt mit GFP (pTM_AH-D1-GLP) (Abbildung 4). Am Folgetag wurden die gemusterten Saphiren Scheiben, wo die Zellen wuchsen, die Zelle Kultur Gerichte entzogen und abgebildet durch LM (Abbildung 4, Abbildung 2). Diese Zellen mit dem Ausdruck der GFP-D1-AH waren gekennzeichnet durch das Vorhandensein von grünen Fluoreszenz in der Zellflüssigkeit und aufgezeichnet, um ihre Positionen innerhalb der Koordinate-Muster der Saphiren Scheiben (Figuren 5A, 5 b) speichern. Unmittelbar nach deren LM-Prüfung, der Saphir CDs mit den Zellen von Interesse waren zwischen zwei Aluminium-Träger (Abbildung 3) montiert und Cryo-Immobilisierung durch HPF ausgesetzt. Zellen wurden dann Einfrieren, ersetzt und anschließend in ein Epoxidharz eingebettet. Nach dem Entfernen der Saphiren Scheiben aus polymerisierten Harz-Blöcken war der Abdruck des Musters alphanumerische sichtbar auf den Block-Gesicht, das erlaubt, Abrufen von den Bereichen, wo die Zellen von Interesse waren. Der Rest des Blocks Harz war Weg getrimmt, um ein kleines Trapez beherbergen die Zellen von Interesse zu erzeugen. Ultradünne Schnittserien wurden aus diesem Trapez, gesammelt auf EM Slot Gittern und weiter durch TEM (Abbildung 5C) analysiert. Beachten Sie, dass manuell Schnittserien in Folge zu erhalten, obwohl machbar28 ist arbeitsintensiv und gut ausgebildete und qualifizierte Personal erfordert. Es ist auch wichtig, dass die Zellen verfügen über eine geringe Konfluenz bei CLEM Protokolls (Abb. 5A) unterzogen, um eine schnelle Erfassung der gleichen Zelle zuvor identifiziert durch LM zu gewährleisten. Andernfalls könnte mit höheren Zelle Konfluenz drastisch verlangsamen das erfolgreiche Auffinden von Zellen auf der Ebene der EM. TEM Analyse mehrerer ultradünnen Abschnitte der Zelle von Interesse (Zahlen 5, 5E), mit dem Ausdruck der AH-D1-GFP, offenbart die Präsenz in den intrazellulären Raum große Ansammlungen von Vesikeln der Variable Morphologie abgegrenzt von der rund um Zytosol durch einen einzigen Lipid Bilayer (Abbildung 5E). Abbildung 4 : Schematische Darstellung des Workflows gefolgt auszuführenden CLEM Beispiel dargestellt Abbildung 5 . Huh7-Lunet Zellen stabil auszudrücken die T7-RNA-Polymerase mit einer DNA Plasmid Codierung der amphipathische Helix (AH) und der Domäne 1 (D1) von HCV NS5A Protein transfiziert wurden markiert an der C-terminalen mit GFP (pTM_AH-D1-GLP). Der Ausdruck dieses Teils des NS5A-Proteins ist transcriptionally durch ein T7-Promotor (T7 Pm) und translationally durch ein Enzephalomyocarditis Virus (EMCV) IRES (interne Ribosom Eintrag Website) Element, angezeigt durch eine sekundäre Struktur gesteuert. 24 h nach Transfektion (24 Hpt) Zellen wachsen auf gemusterten Saphire Scheiben und mit dem Ausdruck der AH-D1-GFP wurden von LM erkannt und unverzüglich HPF-FS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5 : Beispiel für ein CLEM Verfahren. (A) Huh7 Lunet Zellen stabil auszudrücken die T7-Polymerase analysiert durch Fluoreszenz-Mikroskopie, GFP-positiven Zellen gewachsen auf gemusterte Saphir Scheiben, 24 h nach Transfektion mit dem Plasmid pTM_AH-D1-GFP bereitzustellen. (B) höhere Vergrößerung Bild aus einer einzigen Zelle in das weiße gestrichelte Rechteck ausgewählt von CLEM ausgewertet werden. (C) TEM Bild einer ultradünnen Abschnitt der gleichen Zelle nach HPF, FS und Harz einbetten. (D) schematische Darstellung der Schnittserien 70 nm ultradünnen auf einem Slot EM Raster enthält die Zelle von Interesse. (E) auf der linken Seite: TEM Übersichten über zwei Abschnitte der Zelle von Interesse. Auf der rechten Seite: hohe Vergrößerung TEM Bilder der intrazellulären Bereiche im gelben Rechtecke auf der linken Seite, zeigt hohe Zahl von Vesikeln aus dem Cytosol über eine einzelne Membran getrennt ausgewählt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die CLEM Methodik hier vorgestellt, um die Auswirkungen der ein virales Protein-Expression auf Zellmembranen zu studieren wird erfolgreich eingesetzt, bevor um die HCV-Replikation-assoziierten erhellen Strukturen, vor allem Doppelmembran Vesikel (DMVs)²¹, sowie zu Ermitteln Sie die kritische Bausteine erforderlich, um diese HCV-induzierten Strukturen²³bilden. Beachten Sie, dass in unserer ersten Arbeit mit CLEM HCV-Replikation²¹zu studieren, eine leicht modifizierte Version des Protokolls, die hier beschriebenen angewendet wurde. In diesem konventionellen 0,05 mm dicken Saphir Disks ohne alphanumerische Muster-Studie dienten in dem ein Referenzmuster entstand durch Kohlenstoff Beschichten sie mit einem Finder Raster an der Spitze (siehe Tabelle der Materialien). Diese Version des aktuellen Protokolls kann schließlich mit dem Vorteil angewendet werden, dass die “A” Träger für HPF direkt, ohne die Notwendigkeit der Senkung wie in Abbildung 3Averwendet werden kann. Alternativ, wie im Protokoll erwähnt, ein dicker “A” Träger genutzt werden (siehe Tabelle der Materialien) mit gemusterten Saphir Scheiben, ohne die Notwendigkeit eines Trägers “B”.

Interessanterweise kann dieses Protokoll angewendet werden, nicht nur BSL-1 Proben zu studieren, wie Zellen mit viralen Proteinen wie beschrieben hier und anderswo¹⁹^,²³transfiziert, sondern auch um infizierte Zellen zu studieren. Obwohl arbeiten mit humanpathogenen Labors BSL-2 und BSL-3 in der Regel beschränkt, in einigen Ländern ist es noch möglich, Cryo-Immobilisierung unter diesen biologischen Bedingungen durchzuführen. In den BSL-2 und BSL-3 Labors wo Verglasung nicht möglich, da die örtlichen Vorschriften oder das Fehlen einer HPF-Maschine ist können virusinfizierte Zellen noch vorbereitet zu sein mit dieser Methode, wenn chemische Fixierung mit Aldehyden im voraus durchgeführt wird, nämlich vor der Abreise der BSL-2 oder BSL-3 Einrichtungen. Darüber hinaus müssen Aldehyde abgeschreckt werden, sofort nach der Fixierung die Fluoreszenz zu halten, während der Rest des Protokolls mit dem hier beschriebenen identisch ist. Diese Technik kann überflüssig angesehen werden, weil die Zellen zweimal, chemisch und über Verglasung befestigt sind. Dieses doppelte Fixierung Protokoll führt jedoch in der Tat um einen viel besseren Schutz der HCV-induzierte DMVs im Vergleich zu der DMVs in den Zellen chemische Fixierung allein²¹ausgesetzt gefunden.

Weitere Modifikationen und Fehlerbehebung des Lesers bezeichnet man die Noten während des Protokoll-Teils dieser Handschrift. Diese Hinweise beschreiben Fallstricke zu vermeiden, sowie Alternativen zur vermeintliche Schwierigkeiten zu überwinden, die entstehen könnten, wenn diese Methode durchführen.

Die wichtigste Voraussetzung für die Anwendung dieser Technik ist eine HPF-Maschine. Wenn Zellen Cryo-Immobilisierung der Zellen über HPF ist nicht möglich (aufgrund des Fehlens einer HPF-Maschine) oder nicht erforderlich ist (wenn die Membran Erhaltung nicht optimal sein muss), kann durch EM⁸^{chemisch fixiert und anschließend vorbereitet und analysiert werden,} ⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^,¹⁹. Diese Option erfordert nicht die Verwendung von Saphir Scheiben, aber Zelle Kultur Gerichte mit gerasterten Mustern für Zellen oder zellcluster verlagern. Der Hauptvorteil des Einsatzes dieser Gerichte ist ihre größeren Durchmesser im Vergleich zu Saphir Scheiben, so dass das Screening von größeren Flächen. So hat die Anwendung dieses Protokolls CLEM erfolgreich die Wirkung von eine antivirale Substanz gegen HCV¹⁵ studieren oder visualisieren Sie die Membran-Rearrangements induziert durch die Elementoptionen Proteine von Noroviren¹⁹angewendet. Ein weiteres Problem, das die Leistung dieser Methode einschränken kann ist das Fehlen eines kommerziellen FS-Geräts. In diesem Fall können hausgemachte FS Basissysteme stattdessen genutzt werden. Obwohl automatische FS-Geräte Umgang mit Pannen reduzieren könnte, werden hausgemachte Geräte erfolgreich zum Beispiel in Kent McDonalds³⁰ und Paul Walthers Labors eingesetzt.

In Bezug auf chemische Fixierung das hier beschriebene Protokoll sorgt für eine optimale Konservierung der intrazellulären Strukturen²⁰. Für den Fall, dass die oben genannten HPF und FS-Geräte zur Verfügung stehen, wäre einzufrieren die Zellen von Interesse bevorzugt daher.

Zukünftige Alternativen zu dieser CLEM Ansatz gehört die Möglichkeit der Anwendung dieser Methode nicht nur 2D-Informationen Ultrastrukturforschung Ebene zu erwerben, sondern auch 3D Informationen über die Architektur von Membran und Organelle Veränderungen durch Viren zu gewinnen. Die 3D-EM-Methoden, einschließlich Elektron Tomographie (ET) und fokussierte Ion Beam scanning-Elektronenmikroskopie (FIB-SEM) (ausführlich beschrieben in²⁹), könnte auch auf Zellen angewendet werden, die nach dieser aktuellen Protokoll²¹^{vorbereitet wurden,} ³¹. 3D-Informationen konnte darüber hinaus auch die Ebene der LM abgerufen werden, bei einem confocal Mikroskop ermöglicht den Erwerb von Z-Stapel. Diese Option ist in der Tat dringend empfohlen, wenn eine exakte Korrelation zwischen LM und EM Datasets gewünschte (siehe zum Beispiel¹⁷). Die Angaben in 3D Z-Stapel-Aids, die Korrelation mit der 2D TEM Bilder zu verbessern. So, in einem solchen Szenario am besten passende LM und EM Bilder werden ausgewählt und können dann eines der Korrelation-Software zur Verfügung, wie z. B. die EG-CLEM Plugin von ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)³² oder das Wahrzeichen Korrespondenzen Plugin von unterworfen Bild J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), was die Generation der überlappende LM-EM Bilder.

Wenn zeitliche Informationen benötigt werden, die Kinetik der ein bestimmtes Ereignis zu verstehen, kann Zeitraffer Bildgebung zur Dynamik von lebenden Zellen in Kombination mit EM zu überwachen. Während der Veranstaltung von Interesse sind Zellen sofort fixiert, generieren eine “gefrorene Momentaufnahme”, die anschließend über EM analysiert werden können, den detaillierten Ultrastrukturforschung Informationen über diesen besonderen Moment zum Zeitpunkt der Immobilisierung. Um diese “gefrorene Momentaufnahme”, nach der Beobachtung in Echtzeit zu erhalten, können Zellen entweder chemisch festen³³ oder Cryo immobilisiert⁶sein. Da viele zelluläre Prozesse schneller als die Diffusionsvorgänge chemische Fixierung auftreten, sollte wenn möglich, Ultra-schnelles Gefrieren durchgeführt werden. Allerdings ist es wichtig zu berücksichtigen, dass die HPF-Maschinen in ihre effektive Auflösung³⁴unterscheiden.

Obwohl dieses Protokoll für die Einbettung von Zellen in einem Epoxidharz entworfen wurde, können Zellen darüber hinaus auch in niedrigviskose Harze, wie Lowicryls, LR weiß oder LR Gold eingebettet. Die Verwendung dieser Einbettung Medien ermöglicht die Antigenität³⁵^,³⁶, sowie Fluoreszenz³⁷^,³⁸ zu bewahren und sind daher hauptsächlich für die Post-Einbettung auf Abschnitt Immunolabeling³⁹ ^, ⁴⁰ und auf Abschnitt CLEM⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴, wo die LM nach der Einbettung erfolgt. Beide Ansätze (Immuno-EM und auf Abschnitt CLEM) müssen für diese Experimente entscheidend sein in denen nicht-Charakteristik Strukturen leicht per TEM und/oder als Kontrolle gegen Miscorrelation LM bis EM Signale gefunden werden können. Ebenso Kennzeichnung mit Antikörpern, die durch beide bildgebenden Verfahren (LM und EM) sichtbar gemacht werden können vorgenommen werden⁴⁵ um, z. B. transfizierte Zellen in LM (Pre-Einbettung Bühne) und erreichen eine viel genauere Lokalisierung von der GFP-Signal über seine spezifischen Kennzeichnung durch Immuno-EM (Post-Einbettungs-Stadium). Muss berücksichtigt werden, jedoch erfolgt die Permeabilisierung vor LM erlauben den Zugang von Antikörpern gegen den intrazellulären Raum, was eine Sub-optimale Erhaltung der Zellarchitektur auf EM Niveau führen kann. Interessant ist, dieses Protokoll eignet sich auch gut für Multi-Color, die Experimente lässt sich mit dem Einsatz anderer fluoreszierende Tags als GFP (wie hier gezeigt). Zusammenfassend gibt es viele vermeintliche Möglichkeiten der Anpassung dieses Protokolls auf die LM bzw. an den EM-Seiten, je nach Fragestellung, die in Angriff genommen werden. Eine umfassende Beschreibung der anderen alternativen Protokollen wird bis⁵^,⁴⁶verwiesen. Unabhängig davon, wie die Mikroskopie-Modalitäten kombiniert werden ergibt zusammen einen Zugewinn an Information, ermöglicht es uns, besser zu verstehen, wie Viren und ihre Proteine mit ihren Gastgebern im wirklichen Leben interagieren.

Die wichtigste Schritt innerhalb dieser Methode ist die Sammlung von Schnittserien aus den Zellen von Interesse. Wie in Abschnitt repräsentative Ergebnisse hervorgehoben erfordert dies fachkundiges Personal sowie viel Geduld. Wichtig ist, ist dieser Schritt wichtig, die Zellen wieder auf dem Niveau der EM aus zwei Gründen zu finden. Erstens sind in dieser Art von CLEM Protokoll mit Pre LM einbetten, die Koordinaten nur sichtbar auf der LM-Ebene und auf dem Harz Block Gesicht nach der Einbettung. Allerdings werden sie nicht auf den Abschnitten durch TEM sichtbar. Gezielte Trimmen auf dem Block nach unten in die Regionen von Interesse (ROIs) muss daher sorgfältig durchgeführt werden, mit einer Rasierklinge um sicherzustellen, dass die Abschnitte, die nachträglich erlangt werden die Zellen mit dem Ausdruck einer bestimmten FP enthalten. Zweitens ist es notwendig, die beste Überlagerung zwischen den LM und die EM-Akquisitionen zu finden, “Scannen” mehrere Abschnitte. Im Gegensatz zu Methoden, wo LM in der Post-Einbettung Stadium durchgeführt wird, ist in diesem Fall das LM-EM-Overlay nicht so genau. Die geringe Überlagerung Genauigkeit ist aufgrund der Unterschiede in axiale Auflösung zwischen LM und EM, Schrumpfung während der Probenverarbeitung von EM und Kompression während⁴²-Schnitt. Dennoch helfen effizientes Tracking-Methoden wie der Einsatz von Sehenswürdigkeiten, die Zellen wieder zu finden. Dazu gehören die Position von einer Zelle zur anderen, sowie die Form der Zellen und deren Kern. In diesem Zusammenhang informieren wie in dem Protokoll, DIC-Bilder “anatomischen” der Zellen, die die Korrelation zu verbessern sind. Alternativ die Zellkerne oder andere gut erkennbar Zellorganellen (z. B. Mitochondrien oder Lipid Tröpfchen) vor LM gebeizt und als Landmarken verwendet werden können.

Schließlich ist es bemerkenswert zu erwähnen, dass obwohl diese Handschrift über den Einsatz dieser Technik für Virologie Studien ausgerichtet ist, der Anwendungsbereich dieser Versuchsanordnung erweitert werden kann, um allgemeine biologische Fragen beantworten.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir sind sehr dankbar für die Mitarbeiter von der Elektronenmikroskopie Kern Einrichtungen (EFWZ) am EMBL (Heidelberg) und an der Universität Heidelberg. Wir möchte Danke Ulrike Herian, Stephanie Kallis und Andrea Hellwig (Universität Heidelberg), sowie Eberhardt Schmidt und Renate Kunz (Universität Ulm) für kompetente technische Unterstützung. Arbeit von r.b. und sein Team (U.H. und I.R-b) wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 und TRR83, TP13 unterstützt.

Materials

UV Crosslinker	Stratagene	400072	Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.
Patterned sapphire discs	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	627	They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Slim and long tweezers	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72919-SS	"Style SS", for handling sapphire discs.
Cell culture medium	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	41965-062	Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 µg streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	25030-123	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Nonessential amino acids	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11140-068	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140-163	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA	F7524	Bottle of 50 ml.
Inverted microscope	Olympus Deutschland, Hamburg, Germany	CKX41	It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.
Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase	Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory	Not available	Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent	Mirus Bio LLC, Madison, USA	MIR 2304	Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.
Inverted widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany	Zeiss Observer.Z1	Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.
1-hexadecene	Merck, Darmstadt, Germany	8220640100	Bottle of 100 ml.
"A" aluminium holders for high pressure frezing (HPF)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	241	This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"B" aluminium holders for HPF	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	242	This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"A" aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	737	This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a "B" holder or the edition of the "A" holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Sapphire discs	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	405	These sapphires discs are the "conventional" one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.
Finder grids	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA	LF135-Cu	These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on "conventional" sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.
HPF machine	ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland	HPM 01	This HPF machine has been used for this protocol.
HPF machine	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EMPACT 2	"EMPACT 2", as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).
Cryo-tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Z763667-500EA	For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.
Liquid nitrogen dewar	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany	GZ-05094-60	For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.
Automatic freeze substitution (AFS) machine	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EM AFS2	This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	19150	4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.
Uranyl-Acetate (UA)	Serva, Heidelberg, Germany	77879.01	Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.
Sonicator	Bandelin Electronic, Berlin, Germany	329	"Sonorex Super RK 31" is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.
Glass-distilled acetone	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	10015	Bottle of 100 ml.
Stereomicroscope	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica M80	Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.
Epoxy resin	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	14120	Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.
Flow through rings	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707157	Package containing 100 pieces.
Reagent baths	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707154	Package containing 100 pieces.
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica EM UC7	Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.
Ultra 35° diamond knife	Diatome Ltd., Nidau Switzerland	AGG339-735	This knife have an edge length of 3 mm.
Ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	E78318	"Style 3X", for handling EM grids.
EM slot grids	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	G2010-Cu	100 grids/vial.
EM grid storage box	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	71155	It has capacity for 100 grids.

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Santarella-Mellwig, R., Haselmann, U., Schieber, N. L., Walther, P., Schwab, Y., Antony, C., Bartenschlager, R., Romero-Brey, I. Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells. J. Vis. Exp. (139), e58154, doi:10.3791/58154 (2018).