Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Rachel Santarella-Mellwig; Uta Haselmann; Nicole L. Schieber; Paul Walther; Yannick Schwab; Claude Antony; Ralf Bartenschlager; In&#233;s Romero-Brey

doi:10.3791/58154

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biotechnik

Корреляционные света электронной микроскопии (Клем) для отслеживания и обработки изображений вирусного белка связанные структуры в клетках, крио прикол

Published: September 07, 2018

doi:

10.3791/58154

Rachel Santarella-Mellwig¹, Uta Haselmann², Nicole L. Schieber¹, Paul Walther³, Yannick Schwab¹, Claude Antony¹, Ralf Bartenschlager^2,4, Inés Romero-Brey²

¹European Molecular Biology Laboratory, ²Department of Infectious Diseases, Molecular Virology,Heidelberg University, ³Central Facility for Electron Microscopy,Ulm University, ⁴Heidelberg Partner Site,German Center for Infection Research

Summary

Корреляционные света электронной микроскопии (Клем) метод применяется к изображение вирус индуцированных внутриклеточных структур через электронной микроскопии (EM) в клетках, которые ранее выбранному световой микроскопии (лм). LM и EM комбинируются как гибридный подход изображений для достижения интегрированное представление взаимодействия вируса хост.

Abstract

Благодаря своей высокой резолюции электронной микроскопии (EM) является незаменимым инструментом для вирусологи. Однако одна из главных трудностей при анализе инфицированных вирусом или transfected клеток через EM являются низкая эффективность инфекции или трансфекции, препятствуя рассмотрению этих клеток. Чтобы преодолеть эту трудность, световой микроскопии (LM) может выполняться сначала выделить субпопуляция зараженных или transfected клеток. Таким образом воспользовавшись использование флуоресцентных белков (FPs) сливается с вирусные белки, LM используется здесь для записи позиции «положительный transfected» клеток, выражая FP и растет на подставке с буквенно-цифровым рисунком. Впоследствии клетки подвергались дальнейшей обработке для ет через высокого давления замораживания (HPF), заморозить замещения (FS) и внедрение смолы. Ультра-быстрой заморозки шаг обеспечивает отличную мембраны сохранение выделенных ячеек, которые затем могут быть проанализированы на уровне ультраструктурных, просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА). Здесь при условии рабочий процесс шаг за шагом коррелятивных света электронной микроскопии (Клем), описывая пробоподготовки, изображений и корреляции в деталях. Экспериментальный дизайн также может применяться для решения многих вопросов биологии клетки.

Introduction

Идея объединения двух микроскопии условия для получения изображения более определенного биологического процесса довольно старый. Таким образом самого первого исследования о вирусах, используя «коррелятивных микроскопии» был опубликован в 1960 году как два отдельных публикаций¹^,². В этом исследовании авторы проанализировали изменения в морфологии ядра, вызванных аденовирусов двумя методами микроскопии. В первой публикации сообщил¹были электронной микроскопии (EM) наблюдения, описывая морфологические данные, связанные с аденовирусной инфекции. В второй публикации различные структуры, отмеченные EM коррелировали с изображениями световой микроскопии (лм) гистохимические окрашивание шаблонов, чтобы определить характер структуры, ранее отмеченные EM².

В этих ранних исследованиях однако их замечания были проведены с использованием различных инфицированных клеток, подготовленных как независимые эксперименты. «Связь» действительно, означает как сочетание информации, поступающей из двух изображений условия понять некоторые явления, сравнивая все выводы, которые были получены с различных анализов с целью понять данного биологического процесс.

В настоящее время термин соотносится микроскопии, также известный как коррелятивных света и электронной микроскопии (Клем), применяется на большее количество методов (Обзор ссылки³^,^,⁴⁵), с общность что оба методы визуализации (лм и EM) осуществляется на тот же образец. Сочетание обоих методов, таким образом, результаты в мульти-модальных, многомасштабный и многомерного анализа этого образца³. Преимущества, что LM может обеспечить широкий обзор многих различных клеток, обеспечение выявления субпопуляции клеток выражения протеина или протеинов интереса в гетерогенных клеток населения. ЕТ преодолевает резолюции предел LM, обеспечивая высокое разрешение изображения определенного внутриклеточных события. Кроме того EM позволяет визуализации не флуоресцентные субцеллюлярные контекста, включая все связаны мембраны органелл, большой макромолекулярных комплексов (например, рибосомы, centrioles и т.д.) и цитоскелетных элементов, тем самым предоставление дополнительных пространственной информации, так называемые «ссылка пространства»⁶и давая контекст на флуоресцентные место определяется LM.

В течение последних нескольких лет, Клем стал мощным инструментом не только для клеток биологи⁵, но и для вирусологи (обзор в ссылка⁷) готовы понять взаимодействие сложных вирусов клеток, которые приводят к распространению успешных вирус. Таким образом для разработки противовирусных препаратов для ликвидации патогенных вирусов важно понимание того, как вирусы изменяют мембран клеток и органелл в их собственных интересах.

Здесь Клем описан метод, позволяющий обнаружение, LM клеток, выражая вирусные белки, сливается с флуоресцентный белок (FP). Эти клетки являются впоследствии крио прикол и далее готов для ультраструктурных анализа через просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) чтобы получить новое понимание как выражение этих белков переставить внутриклеточные мембраны (рис. 1). Клем выступал с химически фиксированные клетки в большинстве исследований вирусологии, опубликованных до даты⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴ ^,^,¹⁵¹⁶^,^,¹⁷¹⁸^,¹⁹. Это главным образом обусловлено необходимостью инактивации инфекционного материала по причинам биобезопасности в биобезопасности уровня-2 и -3 (BSL-2 и BSL-3) лаборатории, где крио иммобилизация клеток обычно не возможно. На эти вопросы, требующие оптимальное сохранение клеточных мембран витрификации через высокого давления замораживания (HPF) однако настоятельно рекомендуется²⁰. В этих случаях может применяться протокол Клем, описанный здесь. Интересно особенно при работе с инфекционными образцов, HPF может выполняться на образцы, которые были ранее химически инактивированных, например в лаборатории BSL-2 и BSL-3. Сочетание химических фиксации следуют HPF является возможность прибыль по крайней мере частично, от преимущества крио сохранение методы²¹^,²².

Рисунок 1 : Схематическое представление рабочего процесса для анализа клеток через Клем. Клетки, растущих на узорной Сапфировые диски сначала анализируются LM для локализации клетки, выражая FPs до их обработки для EM. После обнаружения, клетки сразу же фиксируются HPF и FS впоследствии внедренных в смоле. После полимеризации смолы, поддержки, где росли клетки (= Сапфировые диски) должны быть удалены из блока смолой. Блок, содержащий внедренные ячейки усекается до небольшой трапеция, из которого являются секционного оставшиеся ячейки, выражая FPs, с алмазным ножом. Ультратонких секции собираются на слот сетки и дополнительно изучить ТЕА для получения ультраструктурных информации этих клеток. Эта цифра адаптирована и изменен с разрешения ссылки²⁹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

1. Подготовка узорной Сапфир диски для клеточной культуры Передача узорной Сапфировые диски (см. Таблицу материалы), с образец буквенно-цифровой, травленная на один из их поверхностей, в 15 мл конические центрифугирования.Примечание: в качестве альтернативы, обычных 0,05 мм толщиной Сапфировые диски без буквенно-цифровой шаблон может использоваться в которых шаблон ссылка создается путем углерода, покрытие их с сеткой поиска на верхней части. С этой целью они должны быть очищены с этанолом до углерода шаблон применяется. Тщательно промойте их с этанолом. Распространение их вне в чашке Петри с фильтровальной бумаги и дайте им высохнуть. Разместите их на стеклянное скольжение отдельно друг от друга с помощью тонкий длинный пинцет. Проверьте с инвертированным микроскопом (увеличение Х 4) ли шаблон координат читается на каждом сапфировый диск.Примечание: Если это не так, флип Сапфировые диски с помощью пинцета. Храните Сапфировые диски в чашку Петри.Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. 2. клеточной культуры с узорными Сапфировые диски Стерилизуйте узорной Сапфировые диски с ультрафиолетового (УФ) сшивателя за 5 мин. Возьмите Сапфировые диски клетки культуры биобезопасности кабинета. Стерилизуйте длинный пинцет с этанолом в кабинете биобезопасности. Добавить половину среднего культуры клеток (см. Таблицу материалы) в ячейку культуры блюдо. Перевести Сапфировые диски тщательно с длинный пинцет в ячейку культуры блюдо. Семян 1 х 105 Huh7-Лунет клетки, стабильно выражая T7 полимеразы высокомобильна в другой половине клеток питательной среды, на культуры блюдо.Примечание: Подсчитать количество ячеек для заполнения таким образом, что в конечной точке эксперимента клетки confluency должно быть не более 20 – 30%. Плотность высокая клеток будет препятствовать переселения клетки на более поздних этапах, EM. Кроме того за confluency может привести к отряд клеток из сапфирового диска. Проверьте, что Сапфировые диски остаются в нижней части культуры блюдо и что буквенно-цифровой координаты по-прежнему читаются с инвертированным микроскопом.Примечание: Если диски плавать в среде культуры клеток, используйте длинный пинцет чтобы подтолкнуть диски в нижней и в конечном итоге флип их обратно в правильной ориентации. Transfect следующий день, как ранее сообщалось в ссылки21,23 следуя инструкциям производителя агент transfection клетки. 3. LM изображений клеток, растущих на узорной Сапфировые диски Трансфер Сапфировые диски в конечной точке эксперимента в металлической пластине изображений, содержащих 30 – 50 мкл / положение рН показатель свободной среды уменьшить неспецифических фон флуоресценции.Примечание: Металлической табличке, описанной здесь (рис. 2) был разработан на рабочем совещании Европейской лаборатории молекулярной биологии (ЕЛМБ). В отсутствие этой плиты или аналогичный стекло дно клетки культуры блюда могут также использоваться для LM. Важно изменить нормальной клеточной культуры среднего для средних без pH индикатор. Отметим также, что следует избегать длительного воздействия раз потому, что они могут вызвать Фотообесцвечивание, приводит к накоплению реактивнооксигенных видов (ров) и физиологическое повреждение клетки24,25. Изображение клетки под микроскопом флуоресценции Перевернутый widefield.Примечание: При использовании зеленого флуоресцентного белка (ГПУП)-тегами белка, как показано в результатах представительных, 450-490 Нм и 500 – 550 Нм возбуждения и выбросов фильтры, соответственно, должны использоваться. Приобрести первый низкий масштаб изображения (10 – 20 X) клетки выделять ячейки, выражая FPs запись координаты узорной Сапфировые диски где клетки интереса расположены с помощью дифференциальной помехи микроскопия контраста (DIC).Примечание: Шить несколько областей могло бы помочь иметь лучшее представление о расположения клеток/клеток интерес. Примечание также что фазово контрастной микроскопии могут дополнительно использоваться здесь. Получить высокое увеличение (флуоресценции и ОПК) изображения (63-100 X, нефти погружение цели) же клеток/клеток лучше различить субцеллюлярные локализация протеина интереса в внутриклеточным пространстве.Примечание: Изображения DIC предоставляют контекстные сведения. Эта информация очень важна для корреляции LM изображения с EM микроскопии, потому что окончательный корреляции является более точным с «анатомической» достопримечательности ячейки. Поскольку некоторые Сапфировые диски может сломаться во время крио иммобилизации, настоятельно рекомендуется подготовить triplicates за состояние. Кроме того некоторые клетки отсоединить от дисков во время HPF и последующие шаги настоящего Протокола, в то время как Ультраструктура другие ячейки могут содержать артефакты вследствие блокирования урона. Таким образом по крайней мере две области дисков следует быть imaged через LM обеспечить, что в конечном итоге будет достаточно клетки для анализа. Важно отметить, что эти две области должно быть на противоположных сторонах диска. Таким образом блок смолы, где внедряются клетки можно разрезать на две половинки и разделы этих районов могут быть получены. Рисунок 2 : Схема для LM изображений клеток, растущих на узорной Сапфировые диски. (A) Сапфировые диски передаются с помощью тонкой Пинцеты для визуализации пластины. (B-C) Эта пластинка была специально разработана на семинаре EMBL в Гейдельберге вписываются в световой микроскоп, где Сапфировые диски может отражаться с клетки культуры среднего без pH индикатор. Он состоит из металла слайд, 75 x 25 мм x 1 мм, с четырех-пяти отверстий, молотые в него с 3 мм сверло по размеру Сапфировые диски. Кроме того небольшие канавки были молотые на каждой стороне отверстия под углом в 90°. Эти отверстия облегчают доступ к диски с щипцами при их обработке. Для оптимального изображения условий стекла coverslips № 0 (0,085 до 0,13 мм толщиной) были склеены ниже отверстия с УФ клеем и помещен под УФ света для упрочнения. (D) высокое увеличение изображения узорной сапфирового диска, изображающие буквенно-цифровой координаты, которые выгравированы на его поверхности. Узорные Сапфировые диски являются коммерчески доступных (см. Таблицу материалы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 4. крио иммобилизация клеток, растущих на узорной Сапфир диски через HPF Место «A» и «B» алюминиевых несущих для ЖКХ (см. Таблицу материалы) в чашку Петри с фильтровальной бумаги, смоченной 1-hexadecene. Погружайте узорной Сапфировые диски, содержащие клетки в чашке Петри с 1-hexadecene.Примечание: Перемещать диски немного чтобы смыть средство культуры клеток. Соберите Сапфировые диски между «A» и «B» алюминиевые перевозчиком в держателе HPF следующим образом (Рисунок 3B). На дне место перевозчик «B» с плоской стороной вверх. Место Сапфировые диски на этой плоской стороне с клетками вверх. Добавьте «» перевозчик с его глубиной 0,1 мм, стоящих перед клетки.Примечание: Потому что узорной Сапфировые диски толще, чем обычные Сапфировые диски, коммерчески доступных «A» перевозчик (предназначенных для использования с-узорные 0,05 мм Сапфировые диски) пришлось сократить до 0,05 мм на этой стороне 0,2 мм Глубина на EMBL семинар для вписываются в HPF держателя (рис. 3А). С этой целью «» перевозчик вставляется в конце металлическую трубку так, что его сторона 0,2 мм подвергается и остается все еще во время резки его. Вырезать вниз стороне затем шлифуют, так что это плоский. Кроме того, Специальный Алюминиевый перевозчика может использоваться поверх узорной сапфировый диск (коммерчески доступных, смотрите Таблицу материалы), в этом случае HPF «сэндвич» состоит только из сапфирового диска и этого перевозчика. Закройте держатель HPF машины и заморозить клетки.Примечание: Этот протокол является специфичным для конкретной машины HPF. Другие HPF машины могут быть также используется6,26. В любом случае пожалуйста, будьте осведомлены о существовании нового поколения машин от поставщиков.Предупреждение: Используйте защитные очки и гарнитура защиты слуха. Место замороженные «сэндвич» в коробке из полистирола с жидким азотом для временного хранения.Предупреждение: Используйте защитные очки и войти в контакт с местной безопасности сотрудников быть информированным о потенциальной опасности при обработке жидким азотом. Чтобы избежать путаницы, место каждого «сэндвич» в пробки microcentrifuge отдельный 0,5 мл (внутри полистирольные коробки) отмечены ряд.Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Если заморозить замещения (FS) не может быть выполнена сразу, образцы могут храниться в крио трубы (с отверстием кулаком в верхней) внутри коробки, которые проводятся в стойку в криогенных жидкого азота Дьюар (см. Таблицу материалы). Этот контейнер жидкого азота должны быть расположены в комнате с газовых сенсоров кислорода, чтобы избежать удушья в случае дефицита кислорода.Предупреждение: Все процедуры, описанные ниже (шаги 5 и 6) должна осуществляться в биобезопасности кабинета. Кроме того большинство реагентов, используемых являются опасными. Перед их использованием, обязательно внимательно прочитайте материал листы данных безопасности, предоставляемые производителями, а также просить сотрудников безопасности о местных правилах для обеспечения безопасной обработки. Для правильной утилизации этих используемых материалов, а также надлежащего использования оборудования, описанных ниже это также консультироваться местные институтом здоровья и безопасности процедур. Рисунок 3 : Схема Ассамблеи узорной Сапфир диски между двух алюминиевых перевозчиков для ЖКХ. (A) -визитка мнения перевозчика обычных «A», имеющий резать на его глубже стороне от 0,2 мм до 0,05 мм. (B) 0,16 мм толщиной сапфировый диск с буквенно-цифровой картины запечатлелись на поверхности смонтирован в две алюминиевых несущих для ЖКХ , следующим образом: Сапфировый диск помещается на плоской стороне «Б» перевозчика с клетками вверх. Нарезанные введёнными «» перевозчик с его глубиной 0,1 мм, сталкивается с клетки на вершине, чтобы закрыть «HPF сандвич». Алюминиевых несущих и узорчатыми Сапфировые диски являются коммерчески доступных (см. Таблицу материалы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 5. FS крио Исправлена клеток Заполните вверх FS машины (см. Таблицу материалы) с жидким азотом. Установите температуру до-90 ° C и подождите, пока машина не достигнет этой температуры. Подготовка среднего FS, содержащие 0,2% осмия тетраоксид (4OsO) (v/v), 0,1% уранила ацетат (UA) (w/v) в дистиллированной стекла ацетон при машина FS охлаждать вниз.Примечание: Подготовить, (к примеру) 12 мл среды FS, смешать 4% OsO4600 мкл рабочего раствора с 0,012 г UA в небольшой стеклянной посуде. Распустить эту смесь в ультразвуковой ванне устройство для 5 минут добавить 11.4 мл дистиллированной стекла ацетона с пипетки и хорошо перемешать. Заполнить вверх 1,5 мл microcentrifuge трубы с 200-500 мкл FS среды, закройте крышку и передавать их на машину FS. Подождите 10 минут для средних FS остыть. Передача замороженных «бутерброды», содержащий Сапфировые диски с ячейками в жидком азоте, используя охлажденную длинный пинцет для пробирки, содержащие FS среднего.Предупреждение: Используйте крио защитные перчатки и защитные очки.Примечание: ЖКХ «бутерброды» может быть разобран спонтанно во время их обработки. В этом случае убедитесь, что диски замороженных сапфиры передаются microcentrifuge трубы. Алюминиевые перевозчиков может быть удален. Запустить FS следующим до следующий день27: от-90 ° C до-80 ° C для 8 ч; от-80 ° C до-50 ° C за 8 ч; от-50 ° C до-20 ° C в течение 2 ч; от-20 ° C до 0 ° C в течение 2 ч. 6. смола встраивание замораживания заменить образцы Предупреждение: Все описанные ниже процедуры должны осуществляться в биобезопасности кабинета. Кроме того большинство реагентов, используемых являются опасными. Перед их использованием, обязательно внимательно прочитайте материал листы данных безопасности, предоставляемые производителями, а также просить сотрудников безопасности о местных правилах для обеспечения безопасной обработки. Для правильной утилизации этих используемых материалов, а также надлежащего использования оборудования, описанных ниже это также консультироваться местные институтом здоровья и безопасности процедур. Вынуть замещенных образцов от FS машины и разместить их на льду за 20 мин. Храните образцы при комнатной температуре в течение 20 минут и тщательно мыть их (3 раза по 10 мин) с дистиллированной стекла ацетона. Отказаться от алюминиевых несущих длинные пинцетом, если они все еще находятся в microcentrifuge труб после ПС. Проникнуть в клетки (на оставшиеся Сапфировые диски) в серии 4 шаг эпоксидной смолы с использованием 1 h инкубаций в 25%, 50% и 75% смолы в стекло дистиллированной ацетон, следуют ночи инкубации с 100% смолы. Обмен на следующий день для 1h 100% смолы. Осторожно поместите Сапфировые диски в поток через кольца установлены в бани реагента, заполнены с 100% смолы. Эти кольца используются в качестве формы полимеризации для 10 Сапфировые диски.Примечание: Сапфировые диски должны быть полностью толкнул вниз с координатами вверх читаемым образом. Это может быть проверена с помощью бинокля придает экстрактором дыма. Кроме того бинокулярный внутри биобезопасности кабинета могут быть использованы вместо. Важно отметить, что есть номера (1-10) выгравированы в нижней части реагентов, которые помогают определить образцы. Кроме того для идентификации образцов тег бумаги могут быть включены в блоке смолы. Полимеризоваться образцы в духовке при температуре 60 ° C в течение 48 часов. 7. Удаление узорной Сапфировые диски из блоков полимеризованная смола Удалите блоки жесткий смолы, содержащие клетки из духовки.Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Если нет, пусть блоки остыть до комнатной температуры перед вырезанием их. Вырежьте встраивание формы с лезвием бритвы, чтобы иметь доступ к блокам смолы. Удалите блоки цилиндрических смолы с помощью пинцета.Примечание: Если тег документ не были включены в смоле блокировать до полимеризации, число блоков с постоянным маркером и хранить их в 1,5 мл пробирок microcentrifuge. Протокол может быть приостановлена здесь. Погрузите кончик смолы блока, содержащего сапфировый диск в коробке из полистирола, содержащий жидкого азота до остановки «всплытие». Затем погрузите кончик смолы блока в кипящей H2O. Повторите два предыдущих шага, как столько раз, сколько необходимо, пока сапфировый диск падает покинуть блок смолы.Предупреждение: Используйте крио защитные перчатки и очки.Примечание: Если это не работает, используйте лезвие для удаления немного полимеризованные смолы вокруг диски, прежде чем пытаться снова. Протокол может быть приостановлена здесь. 8. целевые обрезки и ультратонких секционирование для ТЕА Определите область на лице блок смолы, где присутствуют клетки интереса путем изучения блок лицо с бинокулярный ultramicrotome.Примечание: Негативные отпечаток координат узора из узорной Сапфировые диски сохраняется на лице блок. Это позволяет выявлять области, где расположены клетки интереса для целевых обрезки. LM изображения необходимо перевернуть вертикально облегчить вывод о той же позиции блока лица. Трим монослоя встроенного ячейки, содержащие клетки/клетки, представляющие интерес для небольшой плоские пирамиды с форму трапеции (~ 200 мкм × 250 мкм средний размер) с чистым лезвием. Получите 70-нм ультратонких разделы встраиваемых клеток с 35° Алмазный нож. Место разделы на EM слот сетки с помощью сверхтонкого пинцетом.Примечание:: использование сетки сетки следует избегать, поскольку разделы может быть замаскированы панели сетки. Храните сетки в окне сетки.Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. 9. ТЕА анализ ультратонких секций Поместите сетку слот в держатель просвечивающий электронный микроскоп. Получать изображения малое увеличение (обзор), где видна полная ячейка профиль клетки интереса.Примечание:: клетки/клетки интереса можно найти с помощью профилей клеток и расположения клеток друг к другу как ссылки, сравнивая DIC просмотров, приобретенных до LM. Получить высокое увеличение изображения клеток/клеток интереса, чтобы попытаться найти, на уровне ультраструктурные особенности, которые соответствуют флуоресцентные сигналы, ранее отмеченные LM.Примечание: Монтаж изображения могут быть получены в большом увеличении иметь обзор высоким разрешением клеток/клеток интерес. Кроме того часто бывает необходимо приобрести изображений же ячейки в последовательных серийный разделы, чтобы иметь возможность восстановить клетки в 3D перед сравнением с флуоресцентным изображений.

Representative Results

Использование процедуры, представленные здесь (рис. 1), Huh7-Лунет клетки стабильно выражая T7-РНК-полимеразы были посеяны на дисках узорной сапфиры и впоследствии transfected с плазмида, выражая двумя доменами вируса гепатита С (HCV) неструктурных белок NS5A, отмеченных GFP (pTM_AH-D1-GFP) (Рисунок 4). На следующий день, узорные Сапфировые диски, где росли клетки, были вывезены из блюд культуры клеток и образы с помощью лм (рис. 4, рис. 2). Эти клетки, выражая AH-D1-ГФП были определены наличием зеленый флуоресценции в цитозоле и Записанная сохранить свои позиции в пределах координат шаблон Сапфировые диски (цифры 5А, 5б). Сразу же после их рассмотрения LM, сапфировые диски, содержащие клетки интереса были собраны между двух алюминиевых несущих (рис. 3) и подвергли крио иммобилизация HPF. Клетки были затем заморозить замещенных и впоследствии внедренные в эпоксидную смолу. После удаления Сапфировые диски от блоков полимеризованная смола отпечаток буквенно-цифровой шаблон был виден на лице блок, который позволяет извлечения области, где находились клетки интереса. Остальная часть смолы блок был отделан прочь для создания небольшой трапеция, укрывательство клетки интереса. Серийный ультратонких разделы были получены из этого трапеции, собранные на EM слот сетки и далее анализируются ТЕА (рис. 5C). Обратите внимание, что получение вручную серийный последовательных секций хотя возможно28 является трудоемким и требует хорошо подготовленных и квалифицированных кадров. Важно также, что клетки имеют низкий confluency, когда этот протокол Клем (рис. 5A) для того чтобы гарантировать быстрое признание той же ячейке, ранее выявленные LM. В противном случае имея высокий confluency клеток может резко замедлить успешное обнаружение клеток на уровне EM. Анализ ТЕА из нескольких секций ультратонких клетки интереса (цифры 5 d, 5E), выражая AH-D1-GFP, показали наличие в своем внутриклеточным пространстве большого скопления везикулы переменной словотолкование делимитированной от окружающие цитозоль одного липидному (5 рисунокE). Рисунок 4 : Схематическое представление рабочего процесса следует выполнить пример Клем, изображенные в Рисунок 5 . Huh7-Лунет клетки стабильно выражая T7-РНК-полимеразы были transfected с плазмида ДНК кодирования амфифильными спирали (AH) и домена 1 (D1) HCV NS5A белка, помеченный на его C-терминала с GFP (pTM_AH-D1-ГФП). Выражение этой части белка NS5A контролируется транскрипционно T7 промоутер (T7 вечера) и translationally encephalomyocarditis элементом IRES (внутренние рибосома запись сайта) вирус (EMCV), обозначается вторичной структуры. H двадцать четыре клетки после трансфекции (24 hpt) растет на узорной Сапфировые диски и выражая AH-D1-ГФП были обнаружены LM и немедленно подвергнут HPF-FS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5 : Пример процедуры Клем. (A) Huh7-Лунет клетки, стабильно выражая T7 полимеразы анализируемой микроскопии флуоресцирования выделить GFP-положительных клеток, выращенных на узорной Сапфировые диски, 24 ч после трансфекции с плазмида pTM_AH-D1-GFP. (B) выше, увеличение изображения одной ячейки, выбранные в белый пунктирный прямоугольник для анализа Клем. (C) ТЕА изображение ультратонких часть той же ячейке после HPF, FS и встраивание смолы. (D) схематическое представление серийный 70-нм ультратонких секций на слот EM сетке, содержащей ячейку интерес. (E) на левой стороне: ТЕА описаниями двух секций клетки интереса. Справа: высокое увеличение изображений ТЕА внутриклеточных областей, выбранных в желтые прямоугольники на левой стороне, показывая высокое количество везикулы, разделенных от цитозоль через единый мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Клем методологии, представленные здесь для изучения воздействия вирусных белков на клеточные мембраны успешно использовался до прояснения ВГС репликации связанные структуры, главным образом двойная мембрана везикулы (DMV)²¹, а также определение критического строительные блоки, необходимые для формирования этих структур HCV-индуцированной²³. Обратите внимание, что в нашей первой работе с использованием Клем учиться ВГС репликации²¹, был применен слегка модифицированную версию протокола, описанных здесь. В этом исследовании, обычных 0,05 мм толщиной Сапфировые диски, без буквенно-цифровой модели, были использованы в котором углерода, покрытие их с сеткой finder на вершине был создан шаблон ссылки (см. Таблицу материалы). Эта версия текущего протокола может применяться в конечном счете, с тем преимуществом, что «» перевозчик для ЖКХ может использоваться непосредственно, без необходимости резки его, как показано на рисунке 3A. Кроме того, как указано в протоколе, толще, «A» перевозчик может использоваться (см. Таблицу материалы) с рисунком Сапфировые диски, без необходимости перевозчик «B».

Интересно, что этот протокол может применяться не только для исследования образцов BSL-1, такие, как клетки transfected с вирусные белки как описано здесь и в других местах¹⁹^,²³, но и изучить инфицированные вирусом клетки. Хотя работа с патогенов человека обычно ограничивается лаборатории BSL-2 и BSL-3, в некоторых странах он все еще можно выполнять крио иммобилизации при этих условиях биобезопасности. В этих BSL-2 и лаборатории BSL-3, где витрификации не является возможным, благодаря местные предписания или отсутствие HPF машины инфицированные вирусом клетки могут по-прежнему готовиться с помощью этого метода, если химической фиксации с альдегиды осуществляется заранее, а именно перед отъездом BSL-2 или BSL-3 зал. Кроме того альдегиды нужно быть закаленных сразу после фиксации держать флуоресцирование, в то время как остальная часть протокола идентичен описанному здесь. Эта техника может считаться излишним потому что клетки являются фиксированными дважды, химически и через витрификации. Однако этот двойной фиксации протокол действительно приводит к гораздо лучше сохранение HCV-индуцированной DMV по сравнению с DMV, обнаруженные в клетках, подвергается химической фиксации только²¹.

Для дальнейшего изменения и устранения неисправностей читателя называется примечания на протяжении части протокола этой рукописи. Эти записи описывают, чтобы избежать ошибок, а также альтернатив для преодоления предполагаемые трудности, которые могут возникнуть при выполнении данного метода.

Основным условием применения этой техники является HPF машина. Когда крио иммобилизации клеток через HPF не осуществимо (из-за отсутствия HPF машины) или не требуется (при сохранение мембраны не нужно быть оптимальной), клетки могут быть химически фиксированной и впоследствии подготовлены и проанализированы в EM⁸^, ⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,^,¹⁵¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ ^,¹⁹. Этот параметр не требует использования Сапфировые диски, но блюда культуры клеток с сетчатая шаблоны для перемещения ячейки или ячейки кластеров. Основным преимуществом использования этих блюд является их большего диаметра по сравнению с Сапфировые диски, позволяя скрининга больших площадей. Таким образом применение настоящего Протокола Клем успешно применялся для изучения эффекта противовирусное соединения против гепатита с¹⁵ или визуализировать перестановки мембраны, вызванных неструктурных белки норовирусов¹⁹. Еще один вопрос, который может ограничить производительность данного метода является отсутствие коммерческого устройства FS. В этом случае основные домашние системы FS может быть использован вместо. Хотя Автоматическая FS устройств может снизить обработки неудач, самодельные устройства успешно используются например в Кент Макдональд³⁰ и Paul Walther лабораторий.

Что касается химической фиксации протокол, описанные здесь обеспечивает оптимальное сохранение внутриклеточных структур²⁰. Таким образом в случае, если вышеупомянутые HPF и ФС устройства доступны, подрумянить клетки интереса будет предпочтительным.

Будущие альтернативы этому подходу Клем включают возможность использования этого метода не только приобрести 2D информацию на уровне ультраструктурных, но и для получения 3D-информацию об архитектуре мембраны и органелл изменений, вызванных вирусами. 3D-EM методы, включая электронная томография (ET) и целенаправленной Ион луч сканирование электронной микроскопии (FIB-SEM) (подробно описано в²⁹), также могут применяться к ячейкам, которые были подготовлены после этого текущий протокол²¹^, ³¹. Кроме того 3D информацию можно также получить на уровне LM, при использовании конфокального микроскопа, который позволяет приобретение z стеки. В самом деле этот вариант настоятельно рекомендуется, когда точные корреляции между LM и EM наборов данных является желаемой (см. например¹⁷). Информация, включенная в 3D z стеки помогает улучшить корреляцию с 2D изображений ТЕА. Таким образом в таком случае, лучший монтаж LM и EM изображения могут быть выбраны и затем подвергается одной корреляции программного обеспечения, например ec Клем плагин ЛЕДИСТО (http://icy.bioimageanalysis.org/)³² или плагин ориентир соответствий Изображение J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), что приводит к генерации перекрывающихся изображений LM-EM.

Когда временная информация необходима для понимания кинетика определенного события, покадровой изображений может использоваться для мониторинга динамики живых клеток в сочетании с EM. В ходе мероприятия интерес клетки фиксируются немедленно, генерации «замороженные снимок», которые могут быть впоследствии проанализированы через EM, обеспечивая ультраструктурных подробно о том определенном моменте в то время иммобилизации. Для того чтобы получить что «замороженные снимка», после наблюдения в режиме реального времени, клетки может быть химически фиксированной³³ или крио прикол⁶. Поскольку многие клеточные процессы происходят быстрее, чем диффузионные процессы химической фиксации, если возможно, ультра-быстрое замораживание должны быть выполнены. Однако важно принимать во внимание, что HPF машины отличаются в их эффективное время резолюции³⁴.

Кроме того хотя этот протокол разработан для встраивания клеток в эпоксидной смоле, клетки могут быть также внедрены в низкой вязкости смолы, таких как Lowicryls, белый LR или LR золото. Использование этих средств внедрения позволяет сохранить антигенностью³⁵^,³⁶, а также флуоресценции³⁷^,³⁸ и, таким образом, в основном используются для после встраивания на раздел immunolabeling³⁹ ^, ⁴⁰ и на раздел Клем⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴, где LM делается после встраивания. Оба подхода (иммуно EM и на раздел Клем) должны быть исключительно важное значение для этих экспериментов, в которых не характеристика структуры могут быть легко найдены через ТЕА и/или как элемент управления против несоответствиях между LM и EM сигналов. Аналогичным образом, маркировки с антителами, которые могут быть визуализированы как визуализации формы (LM и EM) может осуществляться⁴⁵ с целью, например, определить transfected клеток в LM (до встраивания этап) и добиться гораздо более точной локализации GFP сигнала через его конкретных маркировки, иммуно Эм (после внедрения этап). Это необходимо учитывать, однако, что permeabilization проводится до LM разрешить доступ антител к внутриклеточного пространства, которое может привести к неоптимальной сохранения архитектуры клеток на уровне EM. Интересно, что этот протокол также хорошо подходит для многоцветные экспериментов, может быть достигнуто с использованием других флуоресцентные метки, помимо GFP (как показано здесь). В заключение существует много предполагаемые возможности адаптации этот протокол, как на LM, так и по бокам EM, в зависимости от вопросов, которые рассматриваются в настоящее время. Для получения исчерпывающего описания других альтернативных протоколов читатель отсылался к⁵^,⁴⁶. Независимо от того, как объединяются формы микроскопии вместе получается прирост информации, позволяет нам лучше понять, как вирусы и их белки взаимодействуют с хозяевами в реальной жизни.

Наиболее важным шагом в рамках этого метода — это совокупность последовательных секций из клетки интереса. Как подчеркивается в разделе представитель результаты это требует специалистов, а также много терпения. Важно отметить, что этот шаг необходимо найти ячейки обратно на уровне EM по двум причинам. Во-первых в такого рода Клем протокола с использованием предварительно встраивание LM, координаты видны только на уровне LM и на лице блок смолы после встраивания. Однако они не будут видны на участках с ТЕА. Таким образом целевые обрезки на блок лицом вниз в регионах, представляющих интерес (ROI) должны быть выполнены тщательно с лезвием бритвы, чтобы гарантировать разделы, которые будут впоследствии получены клетки, выражая данный ПС. Во-вторых необходимо найти лучший наложение между LM и EM приобретений «сканирование» несколько разделов. В отличие от методов, где LM осуществляется на стадии после внедрения в этом случае LM-EM оверлей не так точно. Низкая оверлея точность является из-за различия в осевой резолюции LM и EM, усадка при обработке образцов EM и сжатие при резании⁴². Тем не менее эффективное отслеживание методы, например использование ориентиров, помочь найти клетки назад. Это включает в себя положение одной ячейки в другую, а также форма клеток и их ядра. В этой связи как указано в протоколе, DIC изображения обеспечивают «анатомической» информации клетки, которые имеют решающее значение для повышения корреляции. Кроме того ядер или другие органеллы хорошо узнаваемые ячейки (например митохондрий или липидов капельки) может быть пятнами до LM и используется в качестве ориентиров.

Наконец отметить, что хотя эта рукопись ориентирован на использование этой техники для исследования вирусологии, область этот экспериментальный дизайн может быть расширена для решения более общих биологических вопросов.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы очень благодарны сотрудникам электронной микроскопии зал Core (EMCF) в EMBL (Гейдельберг) и в Гейдельбергском университете. Мы также хотели бы поблагодарить Ulrike Herian, Стефани Kallis и Андреа Hellwig (Гейдельбергский университет), а также Эберхардт Шмидт и Ренате Kunz (Университета Ульм) для экспертной технической помощи. Работа р.б. и его команда (его и И.Р.-б.) было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 и TRR83, ТР13.

Materials

UV Crosslinker	Stratagene	400072	Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.
Patterned sapphire discs	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	627	They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Slim and long tweezers	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72919-SS	"Style SS", for handling sapphire discs.
Cell culture medium	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	41965-062	Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 µg streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	25030-123	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Nonessential amino acids	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11140-068	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140-163	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA	F7524	Bottle of 50 ml.
Inverted microscope	Olympus Deutschland, Hamburg, Germany	CKX41	It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.
Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase	Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory	Not available	Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent	Mirus Bio LLC, Madison, USA	MIR 2304	Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.
Inverted widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany	Zeiss Observer.Z1	Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.
1-hexadecene	Merck, Darmstadt, Germany	8220640100	Bottle of 100 ml.
"A" aluminium holders for high pressure frezing (HPF)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	241	This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"B" aluminium holders for HPF	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	242	This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"A" aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	737	This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a "B" holder or the edition of the "A" holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Sapphire discs	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	405	These sapphires discs are the "conventional" one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.
Finder grids	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA	LF135-Cu	These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on "conventional" sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.
HPF machine	ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland	HPM 01	This HPF machine has been used for this protocol.
HPF machine	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EMPACT 2	"EMPACT 2", as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).
Cryo-tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Z763667-500EA	For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.
Liquid nitrogen dewar	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany	GZ-05094-60	For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.
Automatic freeze substitution (AFS) machine	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EM AFS2	This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	19150	4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.
Uranyl-Acetate (UA)	Serva, Heidelberg, Germany	77879.01	Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.
Sonicator	Bandelin Electronic, Berlin, Germany	329	"Sonorex Super RK 31" is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.
Glass-distilled acetone	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	10015	Bottle of 100 ml.
Stereomicroscope	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica M80	Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.
Epoxy resin	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	14120	Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.
Flow through rings	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707157	Package containing 100 pieces.
Reagent baths	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707154	Package containing 100 pieces.
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica EM UC7	Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.
Ultra 35° diamond knife	Diatome Ltd., Nidau Switzerland	AGG339-735	This knife have an edge length of 3 mm.
Ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	E78318	"Style 3X", for handling EM grids.
EM slot grids	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	G2010-Cu	100 grids/vial.
EM grid storage box	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	71155	It has capacity for 100 grids.

Referenzen

Morgan, C., Godman, G. C., Breitenfeld, P. M., Rose, H. M. A correlative study by electron and light microscopy of the development of type 5 adenovirus. I. Electron microscopy. Journal of Experimental Medicine. 112, 373-382 (1960).
Godman, G. C., Morgan, C., Breitenfeld, P. M., Rose, H. M. A correlative study by electron and light microscopy of the development of type 5 adenovirus. II. Light microscopy. Journal of Experimental Medicine. 112, 383-402 (1960).
Caplan, J., Niethammer, M., Taylor, R. M., Czymmek, K. J. The power of correlative microscopy: multi-modal, multi-scale, multi-dimensional. Current Opinion in Structural Biology. 21, 686-693 (2011).
de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nature Methods. 12, 503-513 (2015).
Müller-Reichert, T., Verkade, P. . Correlative light and electron microscopy III, First edition. , (2017).
Brown, E., Mantell, J., Carter, D., Tilly, G., Verkade, P. Studying intracellular transport using high-pressure freezing and Correlative Light Electron Microscopy. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20, 910-919 (2009).
Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Letters. , (2016).
Spuul, P., et al. Assembly of alphavirus replication complexes from RNA and protein components in a novel trans-replication system in mammalian cells. Journal of Virology. 85, 4739-4751 (2011).
Nagel, C. H., Dohner, K., Binz, A., Bauerfeind, R., Sodeik, B. Improper tagging of the non-essential small capsid protein VP26 impairs nuclear capsid egress of herpes simplex virus. PLoS One. 7, 44177 (2012).
Sharma, M., Kamil, J. P., Coughlin, M., Reim, N. I., Coen, D. M. Human cytomegalovirus UL50 and UL53 recruit viral protein kinase UL97, not protein kinase C, for disruption of nuclear lamina and nuclear egress in infected cells. Journal of Virology. 88, 249-262 (2014).
Kallio, K., et al. Template RNA length determines the size of replication complex spherules for Semliki Forest virus. Journal of Virology. 87, 9125-9134 (2013).
Martinez, M. G., Snapp, E. L., Perumal, G. S., Macaluso, F. P., Kielian, M. Imaging the alphavirus exit pathway. Journal of Virology. 88, 6922-6933 (2014).
Lebrun, M., et al. Varicella-zoster virus induces the formation of dynamic nuclear capsid aggregates. Virology. 454-455, 311-327 (2014).
Madela, K., et al. A simple procedure to analyze positions of interest in infectious cell cultures by correlative light and electron microscopy. Methods in Cell Biology. 124, 93-110 (2014).
Berger, C., et al. Daclatasvir-like inhibitors of NS5A block early biogenesis of hepatitis C virus-induced membranous replication factories, independent of RNA replication. Gastroenterology. 147, 1094-1105 (2014).
van der Schaar, H. M., et al. Illuminating the Sites of Enterovirus Replication in Living Cells by Using a Split-GFP-Tagged Viral Protein. mSphere. 1, (2016).
Vale-Costa, S., et al. Influenza A virus ribonucleoproteins modulate host recycling by competing with Rab11 effectors. Journal of Cell Science. 129, 1697-1710 (2016).
Wang, L., et al. Visualization of HIV T Cell Virological Synapses and Virus-Containing Compartments by Three-Dimensional Correlative Light and Electron Microscopy. Journal of Virology. 91, (2017).
Doerflinger, S. Y., et al. Membrane alterations induced by nonstructural proteins of human norovirus. PLOS Pathogens. 13, 1006705 (2017).
Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
Romero-Brey, I., et al. Three-dimensional architecture and biogenesis of membrane structures associated with hepatitis C virus replication. PLOS Pathogens. 8, 1003056 (2012).
Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
Romero-Brey, I., et al. NS5A Domain 1 and Polyprotein Cleavage Kinetics Are Critical for Induction of Double-Membrane Vesicles Associated with Hepatitis C Virus Replication. MBio. 6, 00759 (2015).
Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36, 280-290 (2003).
Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1011, 45-56 (2004).
McDonald, K. L., Morphew, M., Verkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: equipment- and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: the visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208, 3-10 (2002).
White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1-340 (1986).
Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral Infection at High Magnification: 3D Electron Microscopy Methods to Analyze the Architecture of Infected Cells. Viruses. 7, 6316-6345 (2015).
McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
Villinger, C., Neusser, G., Kranz, C., Walther, P., Mertens, T. 3D Analysis of HCMV Induced-Nuclear Membrane Structures by FIB/SEM Tomography: Insight into an Unprecedented Membrane Morphology. Viruses. 7, 5686-5704 (2015).
Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nature Methods. 14, 102-103 (2017).
Polishchuk, R. S., Mironov, A. A. Correlative video light/electron microscopy. Current Protocols in Cell Biology Supplement. , 8 (2001).
McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of Microscopy. 235, 273-281 (2009).
Newman, G. R., Jasani, B., Williams, E. D. A simple post-embedding system for the rapid demonstration of tissue antigens under the electron microscope. The Histochemical Journal. 15, 543-555 (1983).
Schwarz, H., Humbel, B. M. Influence of fixatives and embedding media on immunolabelling of freeze-substituted cells. Scanning Microscopy. 3, 57-63 (1989).
Luby-Phelps, K., Ning, G., Fogerty, J., Besharse, J. C. Visualization of identified GFP-expressing cells by light and electron microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 51, 271-274 (2003).
Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
McDonald, K. L. Rapid embedding methods into epoxy and LR White resins for morphological and immunological analysis of cryofixed biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 20, 152-163 (2014).
Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods in Cell Biology. 88, 45-58 (2008).
Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. Journal of Cell Biology. 192, 111-119 (2011).
Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
Hampoelz, B., et al. Pre-assembled Nuclear Pores Insert into the Nuclear Envelope during Early Development. Cell. 166, 664-678 (2016).
Lemercier, N., et al. Microtome-integrated microscope system for high sensitivity tracking of in-resin fluorescence in blocks and ultrathin sections for correlative microscopy. Scientific Reports. 7, 13583 (2017).
Takizawa, T., Powell, R. D., Hainfeld, J. F., Robinson, J. M. FluoroNanogold: an important probe for correlative microscopy. Journal of Biological Chemistry. 8, 129-142 (2015).
Romero-Brey, I., Yamauchi, Y. 3D electron microscopy (EM) and correlative light electron microscopy (CLEM) methods to study virus-host interactions. Methods in Molecular Biology: Influenza Virus Methods & Protocols. , (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Diesen Artikel zitieren

Santarella-Mellwig, R., Haselmann, U., Schieber, N. L., Walther, P., Schwab, Y., Antony, C., Bartenschlager, R., Romero-Brey, I. Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells. J. Vis. Exp. (139), e58154, doi:10.3791/58154 (2018).