Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Rachel Santarella-Mellwig; Uta Haselmann; Nicole L. Schieber; Paul Walther; Yannick Schwab; Claude Antony; Ralf Bartenschlager; In&#233;s Romero-Brey

doi:10.3791/58154

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Biotechnik

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

Published: September 07, 2018

doi:

10.3791/58154

Rachel Santarella-Mellwig¹, Uta Haselmann², Nicole L. Schieber¹, Paul Walther³, Yannick Schwab¹, Claude Antony¹, Ralf Bartenschlager^2,4, Inés Romero-Brey²

¹European Molecular Biology Laboratory, ²Department of Infectious Diseases, Molecular Virology,Heidelberg University, ³Central Facility for Electron Microscopy,Ulm University, ⁴Heidelberg Partner Site,German Center for Infection Research

Summary

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 메서드는 이전 가벼운 현미경 검사 법 (LM)에 의해 선택 된 셀에 전자 현미경 (EM)를 통해 바이러스-유도 된 세포내 구조 이미지에 적용 됩니다. LM 및 EM 바이러스-호스트 상호 작용의 통합된 보기를 달성 하기 위해 하이브리드 이미징 접근으로 결합 됩니다.

Abstract

그것의 높은 해상도 때문에 전자 현미경 (EM) virologists 위한 필수적인 도구입니다. 그러나, 그들을 통해 바이러스 감염 또는 transfected 세포를 분석할 때 주요 어려움 중 하나는 감염 또는 transfection, 세포 검사를 방해의 낮은 효율. 이 어려움을 극복 하기 위해 가벼운 현미경 검사 법 (LM) 감염 또는 transfected 세포의 부분 모집단을 할당할 먼저 수행할 수 있습니다. 따라서, 바이러스 성 단백질에 융합 형광 성 단백질 (FPs)의 사용을 활용, LM는 여기 “긍정적인 페” 셀의 위치를 기록 하는 FP를 표현 하 고 영숫자 패턴 지원에 성장. 그 후, 셀 더 높은 압력 (HPF) 동결을 통해 EM에 대 한 처리, 대체 (FS) 및 수 지 포함 고정. 초 급속 동결 단계 다음 전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 ultrastructural 수준에 분석 될 수 있는 선택된 된 셀의 우수한 막 보존을 보장 합니다. 여기, 단계별 상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 워크플로 제공, 샘플 준비, 이미징 및 상관 관계를 자세히 설명 합니다. 실험 설계는 많은 세포 생물학 질문에 적용할 수 있습니다.

Introduction

특정 생물 학적 과정의 더 나은 사진을 얻기 위해 두 현미경 modalities 결합의 아이디어는 오히려 오래 된. 따라서, “상호 현미경”을 사용 하 여 바이러스에 대 한 최초의 연구는 두 별도 게시¹^,²로 1960 년에 출판 되었다. 그 연구에서 저자 두 현미경 기법에 의하여 adenoviruses에 의해 유도 된 핵의 형태에 변화를 분석 했다. 첫 번째 게시에서 아 데 노 바이러스 감염과 관련 된 형태학 세부 묘사 전자 현미경 (EM) 관찰 했다 보고¹. 두 번째 발행물에서 그들에 의해 관찰 하는 다른 구조 이전 EM²에 의해 관찰 하는 구조의 성격을 정의 조직화 학적인 얼룩 패턴의 가벼운 현미경 검사 법 (LM) 이미지와 상관 했다.

그러나 이러한 초기 연구에서 그들의 관측 수행 했다 독립적인 실험으로 준비 하는 다른 감염된 세포를 사용 하 여. “상관 관계”, 실제로, 태어난 두 이미징 형식에서 오는 정보의 조합으로 현상을 이해 하는 특정, 특정된 생물을 이해 하기 위해 다른 분석 실험으로 얻은 모든 결과 비교 프로세스입니다.

용어는 상호 현미경 검사 법, 일컬어 상호 빛과 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인), 공통점 (참조³^,^,⁴⁵검토), 방법의 증가 수에 적용 요즘, 그 두 영상 기법 (LM 및 EM) 매우 동일한 샘플에 수행 됩니다. 두 방법의 조합, 그로 인하여, 그 샘플³의 다중 모드, 다중 스케일 및 다차원 분석에서 결과. 이점은은 단백질 또는 다른 유형의 세포 인구 내의 관심사의 단백질을 표현 하는 세포 모집단의 식별을 가능 하 게 되는 많은 다른 세포의 광범위 한 개요 LM에 제공할 수 있다. 그들 특정 세포내 이벤트의 더 높은 해상도 이미지를 제공 하는 LM의 해상도 한계 극복. 또한, EM 사용 함으로써 모든 바인딩된 막 세포, 큰 고분자 복합물 (예를 들어, 리보솜, centrioles, 등) 및 cytoskeletal 요소를 포함 하 여 비 형광 subcellular 맥락의 시각화 소위 “공간 참조”⁶, 추가 공간 정보를 제공 하 고 LM에 의해 검출 하는 형광 자리에 문맥을 주는.

지난 몇 년 동안, 클레 멘 타인 세포 생물학⁵, 뿐만 아니라 (참조⁷검토) virologists 강력한 도구가 되고있다 성공적인 바이러스 전파 하는 복잡 한 바이러스 세포 상호 작용을 이해 하고자. 따라서, 바이러스 세포 막과 그들의 자신의 이득에 세포를 수정 하는 방법을 이해 병원 성 바이러스를 근절 하기 위해 항 바이러스 약품을 개발 하는 것이 필수적입니다.

여기, 클레 멘 타인 메서드 (FP) 형광 단백질을 융합 하는 바이러스 성 단백질을 표현 하는 셀의 LM에 의해 감지 수 설명 되어 있습니다. 이 세포는 이후 cryo 움직일 수 및 전송 전자 현미경 (TEM)이이 단백질의 표정 세포내 막 (그림 1)를 재배열 하는 방법으로 새로운 통찰력을 얻을을 통해 ultrastructural 분석에 대 한 추가 준비. 클레 멘 타인 날짜⁸^,^,⁹¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,^{14에 게시 바이러스학 연구의 대부분에 화학적으로 고정 셀 수행 되었습니다.} ^,¹⁵^,^,¹⁶¹⁷^,^,¹⁸¹⁹. 이것은 주로 비활성화 biosafety 수준 2와-3 (BSL-2와 BSL-3) 실험실, 어디 곳을 알아내는-immobilization 셀은 일반적으로 불가능 biosafety 이유로 감염 물질의 필요. 그러나 세포 막의 최적 보존을 요구 하는 그 질문에 대 한 높은 압력 (HPF) 동결 통해 vitrification는,, 좋습니다²⁰. 이 경우 여기에 설명 된 클레 멘 타인 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 흥미롭게도, 감염 표본으로 작업 하는 경우에 특히 HPF 되었습니다 이전 화학적으로 활성화 된 예 BSL-2와 BSL-3 실험실에서 샘플에 수행할 수 있습니다. 화학 고정 이어서 HPF의 조합 cryo 보전 방법²¹^,²²의 장점에서 적어도 부분적으로 이익을 가능성은.

그림 1 :를 통해 세포의 분석에 대 한 워크플로의 도식 표현 클레 멘 타인. 셀 패턴화 된 사파이어 디스크에 먼저 LM EM에 대 한 그들의 처리 전에 FPs를 표현 하는 세포를 지역화 하 여 분석 된다. 일단, 셀 즉시 HPF과 FS 이후에 수 지에 포함 된 수에 의해 고정 됩니다. 수 지, 셀 성장 했다 지원의 중 합 시 (= 사파이어 디스크) 수 지 블록에서 제거 해야 합니다. 포함 된 셀을 포함 하는 블록을 표현 하는 FPs, 나머지 셀은 다이아몬드 칼으로 sectioned 작은 사다리꼴에 잘립니다. Ultrathin 섹션은 슬롯 격자에 수집 하 고 이러한 세포의 ultrastructural 정보를 얻기 위해 가장에 의해 추가 검사. 이 그림은 적응 하 고 허가 기준²⁹수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Protocol

1. 세포 배양에 대 한 디스크 패턴화 된 사파이어의 준비 그들의 표면 중 하나에 15 mL 원뿔 원심 분리 관에 새겨져 있는 영숫자 패턴으로 패턴화 된 사파이어 디스크 ( 재료의 표참조)를 전송 합니다.참고: 또는, 영숫자 패턴 없이 기존의 0.05 m m 두께 사파이어 디스크 수 사용할 수 있는 참조 패턴 위에 파인더 그리드와 코팅 탄소에 의해 만들어집니다. 이 목표에 그들은 청소 되어야 한다 에탄올과 탄소 패턴 적용 되기 전에. 에탄올과 그들을 철저히 씻으십시오. 필터 종이 페 트리 접시에 그들을 밖으로 확산 하 고 그들이 말리 면. 에 넣어 유리 슬라이드 슬림 긴 핀셋을 사용 하 여 서로 분리. 거꾸로 현미경 (4 배 확대)으로 좌표의 패턴은 모든 사파이어 디스크에서 읽을 수 있는지 여부를 확인 합니다.참고:이 경우가 아니라, 핀셋의 도움으로 사파이어 디스크를 플립. 페 트리 접시에 사파이어 디스크를 저장 합니다.참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 2. 패턴화 된 사파이어 디스크 세포 배양 5 분에 대 한 자외선 (UV) crosslinker와 패턴화 된 사파이어 디스크 소독. 사파이어 디스크 캐비닛 셀 문화 biosafety 가져가 라. 소독 캐비닛 biosafety에 에탄올과 긴 핀셋. 세포 배양 매체의 절반을 추가 ( 재료의 표참조) 셀 문화 접시에. 전송 사파이어 디스크 신중 하 게 긴 핀셋으로 세포 배양 접시에. 씨앗 1 x 105 Huh7 Lunet 세포, T7 중 합 효소의 세포 배양 매체 문화 접시에 나머지 절반에 resuspended를 안정적으로 표현.참고: 실험의 끝 지점에서 셀 confluency 이어야 한다 그런 방법으로 시드 되어야 하는 셀의 수를 계산 하지 이상 20-30%. 높은 세포 밀도 EM에 의해 후기에서 셀의 이전을 방해 됩니다. 또한, 이상 confluency 사파이어 디스크에서 세포의 분리 될 수 있습니다. 사파이어 디스크 문화 접시의 하단에 남아와 영숫자 좌표는 여전히 거꾸로 현미경으로 읽을 수 있는 확인 하십시오.참고: 경우에 디스크 세포 배양 매체에 플 로트, 하단에는 디스크를 밀어 하 고 결국 올바른 방향으로 다시 그들을 플립 긴 핀셋을 사용 합니다. Transfect 세포 transfection 에이전트의 제조업체 지침에 따라 참조21,23 이전 보고 다음날. 3. LM 이미징 패턴화 된 사파이어 디스크에 성장 하는 세포의 이미징 금속판 30-50 µ L을 포함 하는 실험의 끝 지점에서 사파이어 디스크 전송 / 일반적인 배경 형광을 줄이기 위해 산도 표시기 무료 매체의 위치.참고: 여기에 설명 된 금속 격판덮개 (그림 2) 유럽 분자 생물학 실험실 (EMBL) 워크숍에서 설계 되었습니다. 이 접시 또는 유사한의 부재, 유리 아래쪽 셀 문화 요리 또한 사용할 수 대신 LM에 대 한. 그것은 산도 표시기 없이 매체에 대 한 정상 세포 배양 매체를 변경 하는 것이 중요입니다. Note는 또한 긴 노출 시간 때문에 그들은 photobleaching, 반응성 산소 종 (ROS) 축적 및 셀24,25의 생리 적 피해를 발생할 수 있습니다 피해 야 한다. 거꾸로 widefield 형광 현미경 세포 이미지.참고: 녹색 형광 단백질 (GFP)를 사용 하는 경우-태그 단백질, 각각 대표 결과, 450-490 nm 및 500-550 nm 여기 및 방출 필터와 같이 사용 해야 합니다. 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경을 사용 하 여 관심사의 세포 어디 FPs 레코드를 표현 하는 셀 패턴화 된 사파이어 디스크의 좌표를 할당 셀의 낮은 확대 이미지 (10-20 X)를 먼저 취득.참고: 관심의 셀/셀의 위치에 대 한 더 나은 개요를 도움이 될 몇 가지 분야를 바느질. 또한 그 단계 대조 현미경 검사 법 사용 될 수 선택적으로 여기 참고. 동일한 셀/셀 더 분별 세포내 공간 내에서 관심사의 단백질의 subcellular 지 방화의 고배율 (형광 및 DIC) 이미지 (63-100 X, 기름 침수 목표)를 취득 합니다.참고: DIC 이미지 컨텍스트 정보를 제공합니다. 이 정보는 마지막 상호 관계는 셀의 “해 부” 랜드마크와 더 정확한 때문에 종종 연관 LM 이미지 안에 현미경 나중에 중요 한입니다. 일부 사파이어 디스크 cryo-동원 정지 하는 동안 휴식 수도 있습니다, 그것은 좋습니다 조건 당 triplicates를 준비 하. 또한, 일부 셀에서에서 분리할 디스크 HPF와이 프로토콜의 후속 단계 동안 동안 다른 셀의 열 대권 외 동결 손상 때문에 아티팩트를 포함 될 수 있습니다. 따라서, 디스크의 두 개 이상 영역 끝에 있을 것 이라는 충분 한 세포를 분석할 수 있도록 LM을 통해 몇 군데 한다. 중요 한 것은,이 두 분야는 디스크의 반대편에 있어야 합니다. 이러한 방식으로 셀 포함 된 수 지 블록 2 개 반으로 삭감 될 수 있다 고이 분야의 얻어질 수 있다. 그림 2 :에 셀의 LM 이미징에 대 한 스키마 패턴 사파이어 디스크. (A) 사파이어 디스크 이미징 판에 좋은 족집게의 도움으로 전송 됩니다. (B-C) 이 접시 특별히 설계 되었습니다 EMBL 워크숍 하이델베르크에 가벼운 현미경, pH 지시자 없이 세포 배양 매체와 사파이어 디스크 수 군데 하는 어디에 맞게. 75 m m x 25 m m x 1 m m, 4-5 구멍 사파이어 디스크의 크기에 맞게 3mm 드릴 비트와 함께 그것에 가공 된 금속 슬라이드 그것에 의하여 이루어져 있다. 또한, 작은 홈에 90 ° 각도로 구멍의 양쪽에 가공 된 했다. 이러한 구멍 쉽게 그들을 조작 때 집게로 디스크를 액세스할 수 있습니다. 최적의 이미징 조건 수 있도록 유리 coverslips 번호 0 (0.085 0.13 m m 두께) UV 접착제로 구멍 아래 붙어 있었고 강화 자외선 아래에 배치. 패턴화 된 사파이어 디스크 표면에 새겨져 있으며 영숫자 좌표를 묘사의 (D) 높은 확대 이미지. 패턴화 된 사파이어 디스크는 상용 ( 재료의 표참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 4. 셀 패턴화 된 사파이어에 성장 하는 곳을 알아내는-Immobilization HPF 통해 디스크 HPF에 대 한 “A”와 “B” 알루미늄 사업자 배치 ( 재료의 표참조) 페 트리 접시 필터 종이에서 적셔 1-hexadecene. 젖어 패턴화 된 사파이어 디스크 1-hexadecene로 페 트리 접시에 셀을 포함 하.참고: 디스크를 조금 이동를 세포 배양 매체를 씻어. “A”와 “B” 알루미늄 캐리어 HPF 홀더 (그림 3B) 다음과 같이에 사파이어 디스크를 조립 한다. 하단에서 위쪽으로 향하게 평평한 쪽 “B” 캐리어를 놓습니다. 위쪽으로 향하게 하는 셀이 편평한 측에 사파이어 디스크를 놓습니다. 셀을 직면 하 고 그것의 0.1-m m 깊이 가진 “” 운반대를 추가 합니다.참고: 패턴화 된 사파이어 디스크 기존 사파이어 디스크 보다 두꺼운 이기 때문에, 상업적으로 사용할 수 있는 “A” 캐리어 (0.05 m m 사파이어 디스크 비 꽃무늬와 함께 사용할 수 있도록 설계) 했다는 EMBL에이 0.2 m m 깊이에서 0.05 m m로 잘라 HPF 홀더(그림 3)에 맞추기 위해 워크숍. 이 목표에 “” 운반대는 0.2 m m 측면 노출 되 고 아래로 절단 하는 동안 여전히 남아 금속 튜브의 끝에 삽입 됩니다. 쪽 아래 컷은 플랫 되도록 다음 모래를 뿌린. 또는, 특별 한 알루미늄 캐리어 패턴화 된 사파이어 디스크 위에 사용할 수 있습니다 (상업적으로 사용 가능한 재료의 표를참조), 사파이어 디스크 및이 캐리어만 구성 되 고이 경우 HPF “샌드위치”. HPF 컴퓨터의 소유자를 닫고 셀을 고정 합니다.참고:이 프로토콜은 특정 HPF 기계에 대 한 특정. 다른 HPF 기계 또는 사용된6,26일 수 있었다. 어떤 경우에 공급 업체에서 새로운 세대 컴퓨터의 존재를 알고 이십시오.주의: 안전 고글과 청각 보호 헤드폰을 사용 합니다. 임시 저장을 위한 액체 질소로 폴리스 티 렌 상자에 냉동된 “샌드위치”를 배치 합니다.주의: 고글을 사용 하 고 액체 질소를 처리 하는 경우 잠재적인 위험에 대 한 정보를 지역 안전 요원에 연락해. 혼동을 피하기 위해, 각 “샌드위치” 별도 0.5 mL microcentrifuge 튜브에서 (폴리스 티 렌 상자) 안에 숫자로 표시를 배치 합니다.참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 동결 대체 (FS) 즉시 수행할 수 없는 경우 샘플에에서 저장할 수 있습니다 곳을 알아내는-튜브 (상단에 구멍 뚫은 구멍)와 상자, 극저온 액체 질소에 선반에서 개최 하는 dewar ( 재료의 표참조). 방에 산소 가스 센서, 산소 부족 시 질 식 방지를 하는이 액체 질소 용기 있어야 합니다.주의: 모든 절차 (단계 5와 6) 아래에 설명 된 수 실행 한다 biosafety 내각에서. 또한, 사용 시 약의 대부분은 위험한. 그들을 사용 하기 전에 읽고 신중 하 게 소재 안전 데이터 시트는 제조사에서 제공 하 고 안전 하 게 처리 되도록 로컬 규칙에 대 한 안전 요원에 게 필수입니다. 이들 사용된 재료의 정확한 처리를 위해 뿐만 아니라 아래에 설명 된 장비의 적절 한 사용에 대 한, 그것은 또한 지역 연구소의 건강 및 안전 절차를 참조 하는 데 필요한. 그림 3 : 패턴화 된 사파이어의 어셈블리의 스키마 HPF에 대 한 두 명의 알루미늄 사업자 사이의 디스크. (A) 0.2 m m에 0.05 m m. 영숫자 패턴으로 0.16 m m 두께 사파이어 디스크 표면에 에칭 (B) 에서 깊은 측면에 잘려야 하는 전통적인 “A” 캐리어의 컷-멀리 보기 HPF에 대 한 두 명의 알루미늄 사업자로 조립 다음과 같이: 사파이어 디스크 위쪽으로 향하게 하는 세포와 “B” 캐리어의 평면에 배치 됩니다. 다진 셀을 직면 하 고 그것의 0.1-m m 깊이 가진 “A” 캐리어 닫기 “HPF 샌드위치”를 위에 배치 됩니다. 알루미늄 캐리어와 패턴화 된 사파이어 디스크는 상용 ( 재료의 표참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 5입니다. FS Cryo 고정 셀의 FS 기계를 작성 ( 재료의 표참조) 액체 질소. -90 ° C에 온도 설정 하 고 컴퓨터는이 온도 도달 될 때까지 기다립니다. 0.2% 오스뮴 tetroxide (OsO4)를 포함 하는 FS 매체 준비 (v/v), 0.1 %uranyl 아세테이트 (UA) (w/v) 유리 증 류 아세톤 FS 기계 동안에 냉각 됩니다.참고: 준비, FS 매체의 (예) 12 mL 작은 유리 용기에 UA의 0.012 g 4% OsO4의 600 µ L를 혼합. 5 분 추가 11.4 ml를 피펫으로와 유리 증 류 아세톤의 초음파 목욕 장치에이 혼합물을 분해 하 고 잘 섞으십시오. FS 매체의 200-500 µ L microcentrifuge 튜브 1.5 mL를, 뚜껑을 닫고를 FS 컴퓨터에 그들을 전송. 진정 FS 매체에 대 일 분을 기다립니다. 포함 하는 액체 질소 냉각된 긴 핀셋 FS 매체를 포함 하는 튜브를 사용 하 여 셀과 사파이어 디스크 언된 “샌드위치”를 전송 합니다.주의: 곳을 알아내는-보호 장갑 및 고글을 사용 합니다.참고: HPF “샌드위치” 처리 하는 동안 자연스럽 게 분해 될 수 있습니다. 이 경우에, microcentrifuge 관에 고정 된 사파이어 디스크 전송 됩니다 있는지 확인 합니다. 알루미늄 캐리어 삭제 될 수 있습니다. 다음 날27까지 FS를 다음과 같이 실행 하는 방법:-80 ° C 8 h;-90 ° C에서 -80 ° C ~ 8 h;-50 ° C에서 2 h;-20 ° C-50 ° C에서 2 h 0 ° C에-20 ° C에서. 6. 수 지의 동결 포함 대체 샘플 주의: 아래에서 설명 하는 모든 절차 수 실행 한다 biosafety 내각에서. 또한, 사용 시 약의 대부분은 위험한. 그들을 사용 하기 전에 읽고 신중 하 게 소재 안전 데이터 시트는 제조사에서 제공 하 고 안전 하 게 처리 되도록 로컬 규칙에 대 한 안전 요원에 게 필수입니다. 이들 사용된 재료의 정확한 처리를 위해 뿐만 아니라 아래에 설명 된 장비의 적절 한 사용에 대 한, 그것은 또한 지역 연구소의 건강 및 안전 절차를 참조 하는 데 필요한. FS 기계에서 대체 표본에 밖으로가 고 20 분 동안 얼음에 그들을 배치. 20 분 동안 실 온에서 샘플을 유지 하 고 그들을 철저 하 게 세척 (3 번, 10 분 각) 유리 증 류 아세톤과. 만약 그들이 아직도 microcentrifuge 튜브는 FS 후 긴 핀셋으로 알루미늄 캐리어를 삭제 합니다. 유리 증 류 아세톤, 뒤에 100% 수 지와 야간 보육에 25%, 50% 및 75% 수 지에서 1 h 외피를 사용 하 여 4 단계 에폭시 수 지 시리즈에 (나머지 사파이어 디스크)에 세포를 침투 하 고 1 시간에 대 한 다음 날 100% 수 지를 교환 합니다. 조심 스럽게 흐름을 통해 반지 가득 100% 수 지 시 약 탕에 탑재로 사파이어 디스크를 놓습니다. 이 반지는 10 사파이어 디스크 합 금형으로 사용 됩니다.참고: 사파이어 디스크 해야 합니다 수 완전히 밀어 바닥에 읽을 수 있는 방식으로 위쪽으로 향하게 하는 좌표와. 이 연기 추출기에 연결 된 눈의 도움으로 체크 될 수 있습니다. 또는, biosafety 캐비닛 내부 눈 대신 사용 될 수 있습니다. 중요 한 것은, 숫자 (1-10) 샘플을 식별 하는 데 도움이 시 약의 바닥에 새겨져 있다. 또한, 샘플의 식별 종이 태그 수 지 블록에 포함 될 수 있습니다. 48 h에 대 한 60 ° C에서 오븐에서 샘플 유해 7. 생산 수 지 블록에서 패턴화 된 사파이어 디스크의 제거 오븐에서 세포를 포함 하는 단단한 수 지 블록을 제거 합니다.참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 만약에 아닙니다, 그들을 절단 하기 전에 실내 온도 아래로 블록 식 지. 수 지 블록에 대 한 액세스를 면도날으로 포함 금형을 잘라. 핀셋을 사용 하 여 원통형 수 지 블록을 제거 합니다.참고: 종이 태그는에 포함 되지 않은 경우는 수 지 중 합, 수 영구 표시와 함께 블록 전에 차단 및 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 그들을 저장. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. “버블링” 멈출 때까지 액체 질소를 포함 하는 폴리스 티 렌 상자에서 사파이어 디스크를 포함 하는 수 지 블록의 끝을 담가. 그런 다음, 끓는 H2o.에 수 지 블록의 끝을 담가 사파이어 디스크 수 지 블록 해제 될 때까지 필요한 만큼 여러 번 앞의 두 단계를 반복 합니다.주의: 곳을 알아내는-보호 장갑 및 고글을 사용 합니다.참고:이 작동 하지 않는 경우 다시 시도 하기 전에 디스크 주위 polymerized 수 지의 비트를 제거 하는 면도날을 사용 합니다. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 8. 타겟 트리밍 가장 위한 Ultrathin 단면 관심사의 세포는 블록 얼굴 한 ultramicrotome의 눈을 검사 하 여 존재 하는 수 지 블록 얼굴에 영역을 식별 합니다.참고: 패턴화 된 사파이어 디스크에서 좌표 패턴의 부정적인 인쇄물 블록 얼굴에 그대로 유지 됩니다. 관심사의 세포 타겟된 트리밍에 대 한 위치는 지역 식별 수 있습니다. LM 이미지 블록 얼굴의 동일한 위치에의 발견을 촉진 하기 위하여 수직으로 대칭 이동 될 해야 합니다. 세포를 포함 하는 셀/작은 평면 피라미드에 대 한 관심의 한 사다리꼴의 모양으로 포함 된 셀 단층 트림 (~ 200 µ m × 250 µ m 평균 크기)를 깨끗 한 면도날으로. 35 ° 다이아몬드 칼으로 포함 된 셀의 70 nm ultrathin 섹션을 가져옵니다. 초 정밀 핀셋의 도움으로 EM 슬롯 격자에 섹션을 배치 합니다.참고::: 메쉬를 사용 하 여 격자 섹션 그리드 바에 의해 복 면 될 수 있기 때문에 피해 야 한다. 격자 격자 상자에 저장 합니다.참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 9. 가장 분석 Ultrathin 섹션의 전송 전자 현미경의 소유자에 슬롯 그리드를 놓습니다. 낮은 확대 (개요) 이미지, 관심의 셀의 완전 한 셀 프로 파일은 표시를 획득 합니다.참고::: 셀/셀의 찾을 수 있습니다 다시 DIC 조회 LM 전에 인수를 비교 하는 참조로 셀 프로 파일 및 다른 한 셀의 위치를 사용 하 여. 시도 하 고 ultrastructural 수준에서 이전 LM에 의해 관찰 하는 형광 신호에 해당 하는 기능을 찾을 관심의 셀/셀의 고배율 이미지를 취득 합니다.참고: 몽타주 이미지는 관심사의 세포/세포의 높은 해상도 대 한 개요를 고배율에서 얻어질 수 있다. 또한, 그것은 종종 형광 이미지를 비교 하기 전에 3d에서 셀을 재구성 수 연속 직렬 섹션에서 동일한 셀의 이미지를 수집 하는 데 필요한.

Representative Results

(그림 1), 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여 Huh7 Lunet 셀 패턴화 된 사파이어 디스크에 시드 되었고 이후 C 형 간염 바이러스 (HCV)의 두 개의 도메인을 표현 하는 플라스 미드와 페 T7 RNA 중 합 효소를 안정적으로 표현 nonstructural 단백질 NS5A, 태그 GFP (pTM_AH-D1-GFP) (그림 4). 다음 날, 패턴화 된 사파이어 디스크, 세포 성장 했다 셀 문화 요리에서 촬영 되었고 LM (그림 4, 그림 2)에 의하여 몇 군데. 아-D1-GFP를 표현 하는 그 세포는 cytosol에서 녹색 형광의 존재에 의해 확인 되었고 사파이어 디스크 (그림 5A, 5B)의 좌표-패턴 내에서 자신의 위치를 저장 하는 기록. 바로 뒤에 그들의 LM 검사, 관심사의 세포를 포함 하는 사파이어 디스크 두 알루미늄 캐리어 (그림 3) 사이 조립 하 고 HPF 여 곳을 알아내는-동원 정지를 받게 했다. 대체 하 고 이후에 에폭시 수 지에 포함 된 셀 고정 후 했다. 생산 수 지 블록에서 사파이어 디스크의 제거에 따라 영숫자 패턴의 인쇄물 관심사의 세포 있었다 지역 검색 허용 블록 얼굴에 표시 했다. 수 지 블록의 나머지는 관심사의 세포를 은닉 하는 작은 사다리꼴 생성 하 멀리 손질 했다. 직렬 ultrathin 섹션이이 사다리꼴에서 얻은, EM 슬롯 격자에 수집 되었고 더욱더 편 (그림 5C)에 의해 분석. 참고는 수동으로 직렬 연속 섹션 가능28 은 노동 집약적인 및 잘 훈련 되 고 숙련 된 직원이 필요 합니다. 그것은 또한 세포는 낮은 confluency 때이 클레 멘 타인 프로토콜 (그림 5A) 이전 LM으로 식별 하는 같은 셀의 빠른 인식을 보장 하기 위해 중요 한. 그렇지 않으면, 높은 셀 confluency 데 수 있습니다 극적으로 느리게 그들 수준에서 세포의 성공적인 찾기. TEM 분석의 관심 (그림 5D, 5E) 셀의 여러 ultrathin 섹션, 변수 형태에서 구분의 소포의 큰 축적의의 세포내 공간에 존재 밝혀 아-D1-GFP, 표현에 cytosol는 단일 지질 bilayer (그림 5E)에 의해 둘러싼. 그림 4 : 워크플로 도식 표현에 묘사 된 클레 멘 타인 예제를 수행 하려면 다음 그림 5 . 인코딩 amphipathic 나선 (AH) 및 도메인 1 (D1) HCV NS5A 단백질의 DNA 플라스 미드와 페 했다 안정적 T7 RNA 중 합 효소를 표현 하는 Huh7 Lunet 셀 태그 GFP (pTM_AH-D1-GFP)와 그것의 C-터미널. NS5A 단백질의이 부분의 식 transcriptionally T7 발기인 (T7 오후) 및 translationally 이차 구조에 의해 표시 된 encephalomyocarditis 바이러스 (EMCV) IRES (내부 리보솜 입장 위치) 요소를 제어 합니다. 24 h 후 transfection (24 hpt) 세포 성장 패턴 사파이어 디스크 고 LM에 의해 탐지 되 고 즉시 HPF FS 대상이 아-D1-GFP를 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 : 클레 멘 타인 절차의 예. (A) Huh7 Lunet 세포 GFP-긍정적인 세포 성장 패턴화 된 사파이어 디스크, 플라스 미드와 transfection 후 24 시간에 pTM_AH-D1-GFP를 할당할 형광 현미경에 의해 분석 T7 중 합 효소를 안정적으로 표현. 클레 멘 타인에 의해 분석할 흰색 점선된 사각형 내에서 선택 된 단일 셀의 (B) 높은 확대 이미지. HPF, FS 및 수 지 포함 후 동일한 셀의 ultrathin 섹션의 (C) 가장 이미지. (D) 직렬 70 nm ultrathin 섹션의 셀을 포함 하는 슬롯 안에 격자에 도식 적인 표현입니다. 왼쪽에 (E) : 가장 관심의 셀의 두 섹션의 개요. 오른쪽: 단일 막 통해 cytosol에서 구분 된 소포의 높은 숫자를 공개 왼쪽에 노란색 사각형에서 선택한 세포내 영역의 고배율 TEM 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

복제 관련 HCV 명료 하 구조, 주로 이중 막 소포 (Dmv)²¹, 전에을 여기에 제시 된 세포 막에는 바이러스 성 단백질 식의 영향을 공부 하는 클레 멘 타인 방법론 성공적으로 사용 되었습니다. ²³이 HCV 유도 구조 형성 하는 데 필요한 중요 한 빌딩 블록을 결정 합니다. HCV의 복제²¹공부 클레 멘 타인을 사용 하 여 우리의 첫 번째 작업에 유의 여기에 설명 된 프로토콜의 약간 수정된 된 버전을 적용 했다. 연구, 영숫자 패턴 없이 기존의 0.05 m m 두께 사파이어 디스크 사용 했다 있는 참조 패턴에 의해 만들어진 상단에 파인더 그리드와 코팅 탄소 ( 재료의 표참조). 이 버전의 현재 프로토콜 적용할 수 있습니다 결국, HPF에 대 한 “A” 캐리어 그림 3A아래로 절단의 필요 없이 직접 사용할 수 있다는 장점과 함께. 또는, 프로토콜에서 설명 했 듯이, “A” 캐리어 두꺼운 이용 될 수 있다 ( 재료의 표참조)는 “B”의 필요 없이 패턴화 된 사파이어 디스크.

흥미롭게도,이 프로토콜 같은 셀 페 설명 대로 바이러스 성 단백질으로 여기 고 다른¹⁹^,²³, BSL-1 샘플, 공부 뿐만 아니라 바이러스에 감염 된 세포를 공부를 적용할 수 있습니다. 있지만 작업 인간의 병원 체는 일반적으로 BSL-2와 BSL-3 실험실, 일부 국가에서는 그건 cryo-동원 정지가 biosafety 조건 하에서 수행할 수 있습니다. 그 BSL-2와 BSL-3 실험실 어디 vitrification 불가능, 현지 규정 또는 HPF 시스템의 부재, 바이러스 감염 세포 준비 될 수 있다 아직도 알데하이드와 화학 기정 사전에 실시 하는 경우이 메서드를 사용 하 여 즉 전에 BSL-2 또는 BSL-3 시설을 떠나. 또한, 알데하이드 프로토콜의 나머지는 여기에 설명 된 동일 동안 형광, 계속 고정 후 즉시 침묵 될 필요가 있다. 이 기술은 셀 두 번, 화학적 및 vitrification를 통해 고정 되어 있기 때문에 중복 간주 될 수 있습니다. 그러나,이 이중 고정 프로토콜 셀 화학 기정 혼자²¹대상이 있는 Dmv에 비해 HCV 유도 Dmv의 훨씬 더 나은 보존을 실제로 지도 한다.

추가 수정 및 독자를 문제 해결에 대 한이 원고에 대 한 프로토콜 부분에 걸쳐 메모를 부릅니다. 이 노트는 함정을 피하기 위해, 뿐만 아니라이 방법을 수행할 때 발생할 수 있는 상 상속 어려움을 극복 하기 위해 대안을 설명 합니다.

이 기술을 적용 하기 위한 주요 필수 HPF입니다. 때 cryo immobilizing HPF 통해 셀 (HPF 기계의 부재) 때문에 가능 하지 않습니다 또는 (때 막 보존 수 필요 하지 않습니다) 필요 없습니다, 세포 화학적 고정 및 이후에 준비 고 수 EM⁸^{에 의해 분석} ⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,^,¹⁶¹⁷^,¹⁸ ^,¹⁹. 이 옵션에는 셀 또는 셀 클러스터 재배치 gridded 패턴으로 셀 문화 요리 하지만 사파이어 디스크를 사용 하 여가 필요 하지 않습니다. 이 요리를 사용 하 여의 주요 장점은 큰 표면 영역의 심사를 수 있도록 사파이어 디스크에 비해 그들의 더 큰 직경. 따라서,이 클레 멘 타인 프로토콜의 응용 프로그램은 성공적으로 적용 되었다 HCV¹⁵ 에 대 한 항 바이러스 화합물의 효과 연구 하거나 noroviruses¹⁹nonstructural 단백질에 의해 유도 된 막 재배열을 시각화. 이 방법의 성능을 제한 하는 수 있는 또 다른 문제는 상업 FS 장치의 부재 이다. 이 경우에, 기본적인 수 제 FS 시스템 대신 활용할 수 있습니다. FS 장치 자동 처리 사고를 줄일 수 있습니다, 하지만 집에서 만드는 장치는 성공적으로 사용 예를 들어 켄트 맥도날드의³⁰ 와 폴 발터의 실험실에서.

화학 기정에 관하여 여기에서 설명 하는 프로토콜 세포내 구조²⁰의 최적의 보존을 보장 합니다. 따라서, 위에서 언급 한 HPF와 FS 장치를 사용할 수 있는 경우에 관심사의 세포를 vitrifying 것 선호.

이 클레 멘 타인 방법 미래 대안 ultrastructural 수준에서 2D 정보를 얻으려고 뿐만 아니라 바이러스에 의해 발생 하는 막과 세포 기관이 변경의 아키텍처에 대 한 3 차원 정보를 얻기 위해이 방법 사용의 가능성을 포함 합니다. 전자 단층 촬영 (동부 표준시)와 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (거짓말-sem의) (에서 광범위 하 게 설명된²⁹)를 포함 하 여 3 차원 EM 방법 또한이 현재 프로토콜²¹^{, 다음 준비 된 셀에 적용 될 수 있습니다.} ³¹. 또한, 3 차원 정보 수 또한 얻어질 LM 수준 z 스택의 인수를 허용 하는 confocal 현미경을 사용 하는 경우. 사실,이 옵션이 좋습니다 때 LM 및 EM 데이터 집합 사이의 정확한 상관관계는 원하는 (예를 들어¹⁷참조). 3D z-스택에 포함 된 정보는 2D 가장 이미지와 상관 관계를 개선 하기 위해 에이즈. 따라서 이러한 시나리오에서는 최고의 피팅 LM 및 EM 이미지 선택하실 수 있으며 다음 얼음 (http://icy.bioimageanalysis.org/)³² 의 ec-클레 멘 타인 플러그인 등의 획기적인 통신 플러그인 가능한 상관 관계 소프트웨어 중 하나를 받게 이미지 J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), LM EM 이미지 중복의 생성 결과.

일시적인 정보 특정 이벤트의 활동을 이해 하는 데 필요한 때 시간 경과 영상 EM과 함께에서 살아있는 세포의 역학을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 관심 이벤트 동안 셀 고정 됩니다 즉시, “냉동된 스냅숏” 이후에 그들을 통해 분석할 수 있는 생성, 동원 정지의 시간에 그 특정 순간에 대 한 자세한 ultrastructural 정보를 제공 하. 실시간으로 관찰 후 그 “냉동된 스냅숏”을 얻으려면 세포 화학적 고정된³³ 또는 곳을 알아내는 움직일 수⁶수 있습니다. 이후 많은 세포질 과정의 화학 정착 확산 프로세스 보다 더 빨리 발생, 만약에 가능 하다 면, 매우 빠른 냉동 수행 되어야 한다. 그러나, 그것은 HPF 기계 그들의 효과적인 시간 해상도³⁴에 다을 고려 하는 것이 중요입니다.

또한,이 프로토콜 에폭시 수 지에 셀을 포함 하는 위해 설계 되었습니다, 비록 셀 수 또한에 포함 Lowicryls, LR 화이트 또는 LR 금 같은 저 점도 수 지. 이러한 포함 미디어를 사용 하 여 형광³⁷^,³⁸ 뿐만 아니라 antigenicity³⁵^,³⁶, 보존을 가능 하 게 하 고, 따라서, 주로 후에 섹션 immunolabeling³⁹ 를 포함에 대 한 사용 ^, ⁴⁰ 그리고 섹션에 클레 멘 타인⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴, 어디는 LM 포함 후 이루어집니다. 두 방법 (면역-EM 및 섹션에 클레 멘 타인) 그 실험에 있는 비 특성 구조를 쉽게 찾을 수 가장을 통해 또는 miscorrelation LM와 그들 사이 대 한 제어 신호에 대 한 중요 한 되어야 합니다. 마찬가지로, 두 이미징 형식 (LM 및 EM)에 의해 구상 될 수 있다 항 체로 실행 될 수 있다 예를 들어 LM (사전 단계 포함)의 transfected 세포를 식별 하 고의 훨씬 더 정확한 지 방화를 달성 하기 위해⁴⁵ 개는 GFP 면역-EM (포스트 포함 단계)에 의해 그것의 특정 라벨을 통해 신호. 그러나에 고려 한다,, 그 permeabilization LM EM 수준에서 셀 건축의 최적의 보존 될 수 있습니다 세포내 공간에 항 체의 액세스를 허용 하기 전에 수행 됩니다. 흥미롭게도,이 프로토콜은 또한 적합 다 색 실험을 위해 (같이) GFP 이외의 다른 형광 태그의 사용으로 달성 될 수 있다. 결론적으로,이 프로토콜은 LM에 또는 EM 면 해결 되는 질문에 따라 적응의 많은 상 상속 가능성이 있다. 다른 대체 프로토콜의 포괄적인 설명에 대 한 독자⁵^,⁴⁶을 부릅니다. 현미경 modalities 결합 방법을에 함께 결과 바이러스 및 그들의 단백질 실제 생활에서 그들의 호스트와 상호 작용 하는 방법을 더 잘 이해할 수 있도록 정보의 이득입니다.

이 메서드 내에서 가장 중요 한 단계는 관심의 세포에서 직렬 섹션의 컬렉션 이다. 대표적인 결과 섹션에서 강조,이 전문가 직원 뿐만 아니라 인내심이 많이 필요합니다. 중요 한 것은,이 단계는 두 가지 이유로 그들 수준에서 다시 셀을 찾을 수 필수적입니다. 첫째, 클레 멘 타인 프로토콜 사전 LM 포함을 사용 하 여의이 종류에서 좌표만 볼 수 있습니다 LM 수준 및 수 지 블록 얼굴에 포함 후. 그러나, 그들은 되지 않습니다 볼 수 가장에 의해 섹션에. 따라서, 관심사 (ROIs)의 지역에 아래로 블록 얼굴에 타겟된 트리밍 이후에 가져온 섹션 주어진된 FP를 표현 하는 셀을 포함 되도록 면도날으로 신중 하 게 수행할 수 해야 합니다. 둘째, “스캔” 몇몇 단면도 LM와 그들 인수 사이의 최고의 오버레이 찾을 필요가 있다. 방법 LM 포스트 포함 단계에서 수행 됩니다, 달리이 경우 LM EM 오버레이 그렇게 정확 하지. 낮은 오버레이 정확도 LM와 EM, EM, 샘플 처리 동안 수축 및 단면⁴²동안 압축 축 해상도 차이 때문 이다. 그럼에도 불구 하 고, 효율적인 추적 방법, 랜드마크를 사용 하 여 같은 다시 셀을 찾는 데 도움이. 이 세포 및 그들의 핵의 모양 뿐만 아니라, 다른 한 셀의 위치가 포함 됩니다. 이와 관련, 프로토콜에 설명 된 대로 DIC 이미지 상관 관계 개선에 중요 한 세포의 “해 부” 정보를 제공 합니다. 또는, 핵 또는 다른 잘 인식할 수 있는 셀 세포 (미토 콘 드리 아 등 지질 작은 물방울) LM 전에 스테인드 하 고 랜드마크로 서 사용 될 수.

마지막으로, 그것은 비록이 원고 바이러스학 연구에 대 한이 기술의 사용에 초점을 맞추고,이 실험적인 디자인의 범위는 보다 일반적인 생물 학적 질문 확장 수 있습니다 말할 것도 주목 된다.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 직원의는 전자 현미경 검사 법 핵심 시설 (EMCF) EMBL (하이델베르크)와 하이델베르크의 대학에 매우 감사. 우리 또한 싶습니다 Ulrike Herian, 스테파니 Kallis와 안드레아 Hellwig (하이델베르크 대학), 감사 Eberhardt 슈미트와 전문가 기술 지원 위한 Renate Kunz (Ulm의 대학). R.B. 작품와 그의 팀 (어와 투자 B) 도이치 가운데, SFB1129, TP11, TRR83, TP13에 의해 지원 되었다.

Materials

UV Crosslinker	Stratagene	400072	Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.
Patterned sapphire discs	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	627	They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Slim and long tweezers	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72919-SS	"Style SS", for handling sapphire discs.
Cell culture medium	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	41965-062	Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 µg streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	25030-123	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Nonessential amino acids	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11140-068	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140-163	Package containing 20 bottles of 100 ml/each.
Fetal calf serum	Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA	F7524	Bottle of 50 ml.
Inverted microscope	Olympus Deutschland, Hamburg, Germany	CKX41	It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.
Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase	Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory	Not available	Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent	Mirus Bio LLC, Madison, USA	MIR 2304	Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.
Inverted widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany	Zeiss Observer.Z1	Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.
1-hexadecene	Merck, Darmstadt, Germany	8220640100	Bottle of 100 ml.
"A" aluminium holders for high pressure frezing (HPF)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	241	This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"B" aluminium holders for HPF	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	242	This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"A" aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	737	This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a "B" holder or the edition of the "A" holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Sapphire discs	Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland	405	These sapphires discs are the "conventional" one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.
Finder grids	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA	LF135-Cu	These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on "conventional" sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.
HPF machine	ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland	HPM 01	This HPF machine has been used for this protocol.
HPF machine	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EMPACT 2	"EMPACT 2", as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).
Cryo-tubes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Z763667-500EA	For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.
Liquid nitrogen dewar	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany	GZ-05094-60	For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.
Automatic freeze substitution (AFS) machine	Leica Microsystems, Vienna, Austria	EM AFS2	This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	19150	4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.
Uranyl-Acetate (UA)	Serva, Heidelberg, Germany	77879.01	Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.
Sonicator	Bandelin Electronic, Berlin, Germany	329	"Sonorex Super RK 31" is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.
Glass-distilled acetone	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	10015	Bottle of 100 ml.
Stereomicroscope	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica M80	Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.
Epoxy resin	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	14120	Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.
Flow through rings	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707157	Package containing 100 pieces.
Reagent baths	Leica Microsystems, Vienna, Austria	16707154	Package containing 100 pieces.
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica EM UC7	Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.
Ultra 35° diamond knife	Diatome Ltd., Nidau Switzerland	AGG339-735	This knife have an edge length of 3 mm.
Ultra fine tweezers	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	E78318	"Style 3X", for handling EM grids.
EM slot grids	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	G2010-Cu	100 grids/vial.
EM grid storage box	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	71155	It has capacity for 100 grids.

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Santarella-Mellwig, R., Haselmann, U., Schieber, N. L., Walther, P., Schwab, Y., Antony, C., Bartenschlager, R., Romero-Brey, I. Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells. J. Vis. Exp. (139), e58154, doi:10.3791/58154 (2018).